Name: atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

وكان هذا العمل مدعوما بجائزه علماء التنوع في الكلية من كليه الطب بجامعه ماساتشوستس إلى T.P.. N.N.. ويدعم من قبل SEP-CONACYT ، منحه 279879. وتدعم المؤسسة الوطنية للعلوم منحه DBI 0959476. ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم للدكتور داريل ا. بوسكو لتزويده بخط الخلية N2A ولدانييل تسوسسو لدعمها التقني.

1-ثقافة خلايا الثدييات
<ol><li>اعتبارات عامه
	<ol>
<li>اتبع تقنيات العقيم لثقافة خلايا الثدييات التي تم مراجعتها سابقا38.</li>
		<li>الحفاظ علي جميع خطوط الخلية في مرطب 5 ٪ CO2 حاضنه في 37 درجه مئوية. تختلف شروط ثقافة الخلية لكل نوع من أنواع الخلايا. من المهم الحفاظ علي الظروف ا...

القياس الطيفي لامتصاص الذرية هو طريقه حساسة للغاية لتحديد كميه الزنك في العينات البيولوجية الصغيرة الحجم/الكتلة. الأمثل الموصوفة من قياس الزنك يجعل تطبيق هذه الطريقة بسيطه ويضمن الظروف التحليلية المثالية. هنا ، باستخدام GF-العاص ، حددنا تركيز الزنك في خلايا كامله ، وفي الكسور الخلوية وال?...

يتم العثور علي الانتقال والمعادن الثقيلة ، مثل الزنك والنحاس والمنغنيز والحديد ، بشكل طبيعي في البيئة في كل من المواد الغذائية والملوثات. وتتطلب جميع الكائنات الحية كميات مختلفه من هذه المغذيات الصغرى ؛ ومع ذلك ، فان التعرض للمستويات العالية يضر بالكائنات الحية. الحصول علي المعادن هو أساسا من خلال النظام الغذائي ، ولكن يمكن أيضا استنشاق المعادن أو امتصاصها من خلال الجلد1،2،3،4،5. ومن المهم ملاحظه ان وجود الفلزات في جزيئات الغلاف الجوي أخذ في الازدياد وارتبط إلى حد كبير بالمخاطر الصحية. وبسبب الانشطه البشرية المنشا ، تم اكتشاف مستويات متزايدة من الفلزات الثقيلة مثل Ag ، مثل الاقراص المدمجة ، والكروم ، والزئبق ، والنيكل ، والحديد ، والرصاص في الجسيمات الجوية ، ومياه الامطار ، والتربة6،7. هذه المعادن لديها القدرة علي المنافسة مع العناصر النزره الفسيولوجية الاساسيه ، وخاصه الزنك والحديد ، وانها تحفز الآثار السامة عن طريق تنشيط الانزيمات الاساسيه للعمليات البيولوجية.
الزنك عنصر التتبع هو الاكسده محايده ويتصرف كحمض لويس في التفاعلات البيولوجية ، مما يجعلها عاملا أساسيا اللازمة للطي البروتين والنشاط الحفاز في أكثر من 10 ٪ من البروتينات الثدييات8،9، 10؛ التالي ، فمن الضروري لمختلف الوظائف الفسيولوجية8،11. ومع ذلك ، مثل العديد من العناصر النزره ، هناك توازن دقيق بين هذه المعادن التي تسهل الوظيفة الفسيولوجية الطبيعية وتسبب سميه. في الثدييات, نقص الزنك يؤدي إلى فقر الدم, تاخر النمو, قصور الغدد التناسلية, تشوات الجلد, الإسهال, ثعلبه, اضطرابات الذوق, التهاب مزمن, وضعف وظائف المناعة والجهاز العصبي11,12, 13،14،15،16،17،18. في الزائدة ، والزنك هو السامة للخلايا ويضعف امتصاص المعادن الاساسيه الأخرى مثل النحاس19،20،21.
بالاضافه إلى ذلك ، بعض المعادن مثل Cu و Fe لديها القدرة علي المشاركة في ردود الفعل الضارة. إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) عن طريق فنتر الكيمياء يمكن ان تتداخل مع الجمعية من الحديد الكبريت البروتينات العنقودية وتغيير استقلاب الدهون22،23،24. لمنع هذا الضرر ، تستخدم الخلايا محرمين ملزمه المعادن والناقلين لمنع الآثار السامة. مما لا شك فيه ، يجب ان يكون التوازن المعدني التحكم باحكام للتاكد من ان أنواع الخلايا المحددة الحفاظ علي مستويات مناسبه من المعادن. ولهذا السبب ، هناك حاجه كبيره إلى النهوض بتقنيات القياس الدقيق للمعادن النزره في العينات البيولوجية. في الكائنات الحية النامية والناضجة هناك حاجه البيولوجية التفاضلية للعناصر النزره علي المستوي الخلوي ، في مراحل النمو المختلفة ، وفي الظروف العادية والمرضية. لذلك ، من الضروري تحديد دقيق لمستويات الانسجه والمعادن الجهازية لفهم التوازن المعدني أسطح.
الجرافيت فرن الامتصاص الذري الطيف (GF-العاص) هو تقنيه حساسة للغاية تستخدم لحجم العينات الصغيرة ، مما يجعلها مثاليه لقياس الانتقال والمعادن الثقيلة الموجودة في العينات البيولوجية والبيئية25،26 , 27 , 28. وعلاوة علي ذلك ، نظرا لحساسية عاليه من هذه التقنية ، وقد ثبت ان تكون مناسبه لدراسة خصائصالنقل الدقيقة من Na +/k +-atpase والمعدة H +/k +-atpase باستخدام xenopus البويضات كنظام نموذجي29. في GF-العاص ، تمتص العناصر المفتتة داخل العينة طولا موجيا من الإشعاع المنبعث من مصدر ضوئي يحتوي علي معدن الفائدة ، مع الإشعاع الممتص المتناسب مع تركيز العنصر. يتم الاثاره الكترونيه العنصرية عند امتصاص الاشعه فوق البنفسجية أو المرئية في عمليه كميه فريدة لكل عنصر كيميائي. وفي عمليه الكترون واحده ، ينطوي امتصاص الفوتون علي الكترون ينتقل من مستوي طاقة اقل إلى مستوي اعلي داخل الذرة ويحدد GF-العاص كميه الفوتونات التي تمتصها العينة ، والتي تتناسب مع عدد امتصاص الإشعاع العناصر صغار في أنبوب الجرافيت.
وتعتمد الانتقائية في هذه التقنية علي البنية الكترونيه للذرات التي يكون فيها لكل عنصر خط طيفي محدد للامتصاص/الانبعاث. في حاله الزنك ، والطول الموجي الامتصاص هو 213.9 نانومتر ويمكن تمييزها بدقه من المعادن الأخرى. عموما ، يمكن استخدام GF-العاص لقياس الزنك مع حدود كافيه من الكشف (اللد) وحساسية عاليه والانتقائية25. تتكامل التغيرات في الطول الموجي الممتص وتقدم كقمم لامتصاص الطاقة عند أطوال موجية محدده ومعزولة. وعاده ما يتم احتساب تركيز الزنك في عينه معينه من منحني قياسي من التركيزات المعروفة وفقا لقانون البيره لامبرت ، الذي الامتصاص يتناسب مباشره مع تركيز الزنك في العينة. ومع ذلك ، فان تطبيق معادله بير لامبرت علي تحليلات GF-العاص يعرض أيضا بعض التعقيدات. فعلي سبيل المثال ، يمكن ان تؤثر التغيرات في الانحلال و/أو التركيزات غير المتجانسة للعينات علي القياسات المعدنية.
الانحلال المعدنية المطلوبة لتحليل عنصري التتبع GF يتكون من ثلاث خطوات أساسيه. الخطوة الاولي هي ديسولفيشن ، حيث تبخرت المذيبات السائلة. ترك المركبات الجافة بعد الفرن يصل إلى درجه حرارة حوالي 100 درجه مئوية. ثم ، يتم تبخير المركبات عن طريق تسخينها من 800 إلى 1,400 درجه مئوية (اعتمادا علي العنصر الذي سيتم تحليله) وتصبح غازا. وأخيرا ، يتم صغار المركبات في الدولة الغازية مع درجات الحرارة التي تتراوح من 1,500 إلى 2,500 درجه مئوية. وكما سبقت مناقشته أعلاه ، فان زيادة تركيزات معدن الفائدة ستجعل الزيادات النسبية في الامتصاص التي يكتشفها الفرنك الغين-العاص ، ومع ذلك فان الفرن يقلل من النطاق الديناميكي للتحليل ، الذي هو نطاق العمل من التركيزات التي يمكن ان تكون يحددها الصك. التالي ، فان هذه التقنية تتطلب تركيزات منخفضه وتحديد دقيق للنطاق الديناميكي للأسلوب عن طريق تحديد اللد والحد من الخطية (LOL) من قانون بير لامبرت. ال اللد هو الحد الأدنى من الكمية المطلوبة ليتم الكشف عن ماده ، وتعريف ثلاثه اضعاف الانحراف المعياري لل Zn في المصفوفة. لول هو الحد الأقصى للتركيز التي يمكن الكشف عنها باستخدام القانون بير لامبرت.
في هذا العمل ، ونحن وصف طريقه قياسيه لتحليل مستويات الزنك في مقتطفات الخلية بأكملها ، سيتوبلازمي والكسور النووية ، وفي تكاثر والتفريق بين الخلايا المستزرعة (الشكل 1). قمنا بتكييف العزلة السريعة لبروتوكول النوى للانظمه الخلوية المختلفة لمنع فقدان المعادن اثناء اعداد العينة. وكانت النماذج الخلوية المستخدمة الاساسيه التي تستمد من الخلايا الأقمار الصناعية الماوس ، وخلايا الورم الاروميه العصبية murine (N2A أو Neuro2A) ، murine 3T3 L1 شحميه ، وهو الإنسان غير tumoriغينيك الثدي خط خليه الظهاريه (MCF10A) ، والكلي البوليسية. MDCK) الخلايا. وقد أنشئت هذه الخلايا من السلالات المختلفة وهي نماذج جيده للتحقيق في النسب اختلافات محدده من مستويات المعادن في المختبر.
وتشكل الأقاليم الاساسيه المشتقة من خلايا الفئران الفضائية نموذجا مناسبا في المختبر للتحقيق في تمايز العضلات الهيكلية. انتشار هذه الخلايا سريع عندما مثقف تحت ظروف المصل عاليه. ثم يتم الحث علي التمايز في السلالة العضلية بسبب انخفاض حالات المصل30. الورم الارومي العصبي murine (N2A) أنشئت خط الخلية المستمدة من قمة الماوس العصبية. هذه الخلايا الحالية العصبية والأميبا الخلايا الجذعية المورفولوجية. علي التحفيز التمايز ، والخلايا N2A تقديم العديد من الخصائص للخلايا العصبية ، مثل الشعيرات العصبية. وتستخدم خلايا N2A للتحقيق في مرض الزهايمر ، ونمو العصب العصبي ، والسمية العصبية31،32،33. و 3T3-L1 murine ما قبل الخلايا الشحمية التي أنشئت خط الخلية يستخدم عاده للتحقيق في التغيرات الايضيه والفسيولوجية المرتبطة اديبوجينيسيس. هذه الخلايا تقديم الليفية مثل المورفولوجية, ولكن مره واحده حفزت للتمييز, انها تقدم التنشيط الانزيميه المرتبطة تخليق الدهون وتراكم الدهون الثلاثية. ويمكن ملاحظه ذلك كتغييرات مورفولوجية لإنتاج قطرات الدهون السيتوبلازمية34،35. MCF10A هو خط الخلايا الظهاريه غير الورم الثديية المستمدة من أمراه قبل سن إلياس مع مرض فيبروكيستيك الثدي36. وقد استخدم علي نطاق واسع للدراسات البيوكيميائية والجزيئية والخلوية المتعلقة بالسرطانات الثديية مثل الانتشار ، وهجره الخلايا ، والغزو. وقد تم استخدام خط الخلايا الظهاريه الكلي البوليسية Madin-داربي (MDCK) علي نطاق واسع للتحقيق في الخصائص والاحداث الجزيئية المرتبطة بإنشاء النمط الظاهري الظهاريه. عند الوصول إلى التقاء ، تصبح هذه الخلايا المستقطبة وإنشاء التصاقات خليه خلوية ، وخصائص الانسجه الظهاريه الثدييات37.
لاختبار قدره العاص لقياس مستويات الزنك في خلايا الثدييات ، حللنا الكسور الكاملة وشبه الخلوية (cytosol والنواة) من هذه الخطوط الخلوية الخمسة. وأظهرت قياسات العاص تركيزات مختلفه من الزنك في هذه الأنواع من الخلايا. وكانت التركيزات اقل في التكاثر والتفريق بين الأقاليم الاوليه (4 إلى 7 nmol/mg من البروتين) واعلي في أربعه خطوط الخلايا الراسخة (تتراوح بين 20 إلى 40 nmol/ملغ من البروتين). تم الكشف عن زيادة صغيره غير هامه في مستويات الزنك في التفريق بين الكريات الاوليه وخلايا الورم الارومي العصبي بالمقارنة مع تكاثر الخلايا. تم الكشف عن التاثير المعاكس في الخلايا الشحمية المتمايزة. ومع ذلك ، فان تكاثر خلايا 3T3-L1 اظهر تركيزات اعلي من المعدن مقارنه بالخلايا المتمايزة. الأهم من ذلك ، في هذه الخطوط الخلوية الثلاثة ، أظهرت التجزئة تحت الخلوية ان الزنك موزع بشكل مختلف في السيتوسيول والنواة وفقا لحاله الأيض لهذه الخلايا. علي سبيل المثال ، في تكاثر المقاطع العضلية ، وخلايا N2A ، و 3T3-L1 قبل الخلايا الشحمية ، يتم ترجمه غالبيه المعدن إلى النواة. عند استقراء التمايز باستخدام العلاجات الخلوية المحددة ، الزنك مترجمه إلى عصارة في هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا. ومن المثير للاهتمام ، أظهرت كل من خطوط الخلايا الظهاريه مستويات اعلي من الزنك اثناء الانتشار مقارنه مع عند التوصل إلى التقاء ، والتي شكلت أحاديه الطبقة الضيقة المميزة. في تكاثر الخلايا الظهاريه ، كان خط الخلية الثديية MCF10A توزيع الزنك علي قدم المساواة بين عصارة ونواه ، بينما في خط الخلايا المشتقة من الكلي ، وكان معظم المعدن الموجود في النواة. في هذين النوعين من الخلايا ، عندما وصلت الخلايا إلى التقاء ، كان الزنك في الغالب التي تقع علي cytosol. وتبين هذه النتائج ان GF-العاص هو تقنيه حساسة للغاية ودقيقه لاجراء تحليل عنصري في عينات منخفضه الغلة. GF-العاص إلى جانب تجزئه تحت الخلوية ويمكن تكييفها للتحقيق في مستويات العناصر المعدنية النزره في خطوط الخلايا المختلفة والانسجه.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1005706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brg1-antibody (G7)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnologies</td>
			<td>sc-17796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti b-tubulin-antibody (BT7R)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-16308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidemal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>95321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>51300044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid (HNO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM (Reduced Serum Media)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol (Collagen)</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retionic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648469-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 &#181;g/mL, 2% HNO3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N9300168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Established Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3-L1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CL-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDK</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Absortion spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Aanalyst 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagnode</td>
			<td>UCD-200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells

المعادن الانتقالية هي المغذيات الصغرى الاساسيه للكائنات الحية ولكن يمكن ان تكون سامه للخلايا بتركيزات عاليه من خلال التنافس مع المعادن الفسيولوجية في البروتينات وتوليد إجهاد الاكسده. الحالات المرضية التي تؤدي إلى استنزاف المعادن أو تراكم هي العوامل السببية لمختلف الامراض البشرية. وتشمل بعض الامثله فقر الدم ، والتهاب الجلدي المعوي ، وامراض ويلسون والمنكز. ولذلك من المهم ان تكون قادره علي قياس مستويات ونقل المعادن الانتقالية في العينات البيولوجية مع حساسية عاليه ودقه من أجل تسهيل البحوث استكشاف كيفيه مساهمه هذه العناصر في الوظائف الفسيولوجية العادية السميه. الزنك (Zn) ، علي سبيل المثال ، هو عامل مساعد في العديد من البروتينات الثدييات ، ويشارك في الاحداث الإشارات ، وهو رسول الثانوية في الخلايا. في الزائدة ، الزنك السامة ويمكن ان تمنع امتصاص المعادن الأخرى ، في حين ان في العجز ، فانه يمكن ان يؤدي إلى مجموعه متنوعة من الظروف المميتة المحتملة.

الجرافيت فرن الامتصاص الذري الطيفي (GF-العاص) يوفر طريقه حساسة للغاية وفعاله لتحديد الزنك وغيرها من تركيزات المعادن الانتقالية في العينات البيولوجية المختلفة. الانحلال الكهربي عن طريق GF-العاص ثبت قيمه المعادن عن طريق تفتيت كميات صغيره من العينات لتحليل الامتصاص الانتقائي اللاحق باستخدام الطول الموجي لأثاره عنصر الفائدة. في حدود الخطية من قانون البيره لامبرت ، وامتصاص الضوء من قبل المعدن يتناسب مباشره مع تركيز التحاليل. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لتحديد محتوي الزنك ، GF-العاص يكتشف كل من الزنك الحرة والمعقدة في البروتينات وربما في جزيئات صغيره داخل الخلايا مع حساسية عاليه في وحدات التخزين عينه صغيره. وعلاوة علي ذلك ، فان GF-العاص هو أيضا أكثر سهوله في الوصول اليه من قياس الطيف الكتلي المقترن بشكل محفز أو الاشعه السينية المستندة إلى synchrotron. في هذا الأسلوب ، يتم وصف اعداد عينه منتظمة من مختلف خطوط الخلايا المستزرعة للتحليلات في GF-العاص. تمت مقارنه الاختلافات في هذا العنصر النزره في كل من الخلايا الكاملة والكسور تحت الخلوية من تكاثر والخلايا المتمايزة كدليل علي المبدا.

اختبرنا قدره GF-العاص للكشف عن مستويات دقيقه من الزنك في خلايا الثدييات (الشكل 1). وهكذا ، فاننا مثقف الاساسيه التي تستمد من خلايا الأقمار الصناعية الماوس ، وخطوط الخلايا القائمة N2A (الورم الارومي العصبي المشتقة) ، 3T3 L1 (الخلايا الشحمية) ، MCF10A (ظهاره الثدي) ، و?...

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

الطيفية الامتصاص الذري لقياس برك الزنك داخل خلايا الثدييات

ويشيع استخدام خطوط الخلايا الاساسيه أو القائمة المستزرعة لمعالجه المسائل البيولوجية والميكانيكية الاساسيه كنهج اولي قبل استخدام النماذج الحيوانية. يصف هذا البروتوكول كيفيه اعداد مقتطفات الخلايا الكاملة والكسور تحت الخلوية لدراسات الزنك (Zn) والعناصر النزره الأخرى مع الطيفية الامتصاص الذري.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

23- إن دور المعادن الانتقالية في تنمية الثدييات هو دور يُستهان به إلى حد كبير. تظهر الأدلة الناشئة أن التوازنات الفلزية لا تزال تتغير وفقا للمرحلة التنموية للخلايا والأنسجة. وعلاوة على ذلك، فإن الوجهات الخلوية المحددة للمعادن أيضا varietal في التنمية، وبطبيعة الحال، فإنه من الصعب تحديد مواقعها.وقد تم حتى الآن تطوير تقنيات تحليلية مختلفة لتحديد المعادن كمياً، ولكن معظمها باهظ الثمن أو يتعذر الوصول إليه. وتركز البحوث المكثفة لتحسين تحديد المعادن بطريقة أكثر سهولة وكفاءة. الجرافيت الفرن الطيفي الامتصاص الذري، GF-AAS، واثنين من المزايا الرئيسية.ويوفر حدوداً منخفضة للكشف عن الزنك، مما يسمح بإجراء تحليل دقيق للزنك. بل هو أيضا تقنية التي لا تتطلب كميات كبيرة من العينة، microliters من الحل تميل إلى أن تكون كافية لتنفيذ التحليل. الجمع بين هاتين المزايا جعل GF-AAS مثالية لتحليل العناصر النزرة في عينات ذات حجم منخفض.ترتبط العديد من الحالات المرضية البشرية باختلال التوازن المعدني. بعض الأمثلة هي فقر الدم، التهاب الأكروبرمات المعوي، ومرض ويلسون و Menkes'. ولذلك، من المهم تطوير أساليب فعالة وموثوق بها لقياس مستويات المعادن الانتقالية في العينات البيولوجية مع حساسية عالية ودقة عالية.GF-AAS هو مثال ممتاز على التكنولوجيا التي تسهل تحديد أي معدن معين في الظروف الفسيولوجية العادية، وفي الحالات المسببة للأمراض. الأسلوب هو تنوعا للغاية. ويمكن تطبيقه على العديد من النظم والعديد من العناصر يمكن تحليل باستخدام GF-AAS.ويتمثل التحدي في تحديد حد طريقة الكشف في الواقع، والتأكد من أن العينات تقع ضمن هذا الحد. وبالنظر إلى أن حجم العينات منخفض، فليس هناك مجال كبير للاختبار، لذا يجب إجراء فحص دقيق للبيانات منذ البداية. بعد التحليل الأول للعينات، نحن بحاجة إلى تحديد ما هو عامل التخفيف اللازم لتحقيق العينات إلى الحدود المطلوبة لتحديد الكمية.تأكد من أنك قادر على تجزئة النوى بشكل صحيح قبل الذهاب إلى AAS. البقع الغربية هي دائما التحقق من صحة جيدة قبل التحليل الطيفي. بينما يتطلب GF-AAS كميات منخفضة، برك داخل الخلايا هي في أحجام منخفضة بالفعل.هذا لا يعطي مجالاً كبيراً للاختبار يجب إجراء القياسات الأولى وفحصها بعناية ، لذلك يمكن تقليل المعالجة بالعينة إلى عامل تخفيف واحد فقط. للبدء، ثقافة الخلايا ذات الاهتمام في لوحات 55 سم مربع.استخدام فخ فراغ لpirate وسائل الإعلام الثقافة. تأكد من إزالة جميع آثار الوسائط. استخدام الثلج البارد برنامج تلفزيوني خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم لشطف الخلايا من النقاط الزمنية المطلوبة، أو ظروف الثقافة، ثلاث مرات.ثم إضافة ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS إلى لوحة، وكشط الخلايا قبالة لوحة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر، والاحتفاظ بها على الجليد. الطرد المركزي لمدة 10 ثانية في 10، 000 مرة G، وإزالة المابير من قبل الطموح.إذا كان من المطلوب تحليل المعادن من الكسور السيتوبلازمية والنووية، resuspend بيليه الخلية في 400 ميكرولترات من الجليد البارد PBS التي تحتوي على 0.1٪ NP-40، وهو المنظفات غير الأيونية. نقل 100 ميكرولترات إلى أنبوب microcentrifuge جديدة كعينة الخلية بأكملها، وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية. لعزل النوى، استخدم طرف P1000 micropipette إلى ماصة تعليق الخلية 400 ميكرولتر صعودا وهبوطا خمس إلى 10 مرات على الجليد.ثم، استخراج خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية ونقلها إلى شريحة زجاجية المجهر. ضع الميكرولترات الخمسة تحت مجهر خفيف باستخدام هدف 40 مرة للتحقق من سلامة النوى. الطرد المركزي المتبقية 395 microliter خلية تعليق lysate لمدة 10 ثانية في 10، 000 مرة G.Transfer supernatant التي تحتوي على كسر cytosolic إلى أنبوب جديد microcentrifuge.المقبل، إضافة 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.1٪NP-40 لشطف بيليه مع الكسر النووي، والطرد المركزي لمدة 10 ثوان في 10، 000 مرة G.Remove supernatant، و resuspend بيليه تحتوي على نواة في 100 ميكرولترات من نفس الحل. لlyse الخلايا، واستخدام Bioruptor ل sonicate الخلية بأكملها والنوى التي تحتوي على حل ثلاث مرات، كل لمدة خمس دقائق. المضي قدما في تنفيذ مراقبة الجودة من نقاء الكسور بواسطة لطخة الغربية، وذلك باستخدام الأجسام المضادة محددة لكسور إما النووية أو cytosolic.أولا، إضافة حجم متساو من حمض النيتريك المركزة من الصف المعادن النزرة إلى الخلية بأكملها، والكسور السيتوبلازمية والنووية التي تحتوي على 100 و 500 و 100 ميكرولترات من تعليق الخلية في أنابيب ميكروسيرت 1.5 ملليلتر، ووضعها في كتلة حرارية في 80 درجة مئوية لتكميل ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أخرج الأنابيب من الكتلة الحرارية ووضعها في رف لمواصلة الهضم الحمضي بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية. وقف التفاعل عن طريق إضافة 30٪ من حجم العينة من بيروكسيد الهيدروجين.جلب حجم العينة إلى 500 ميكرولترات مع 18 ميجا أوم تنقية المياه. بعد ذلك، في أنبوب فالكون 15 ملليلتر يخفف من مستوى التحليل الصف أكسيد النيتريك في الماء النقي في 18 ميجا أوم لإعداد اثنين من حجم في المئة محلول حمض النيتريك كحل فارغ أثناء المعايرة. ثم، استخدم محلول حمض النيتريك بنسبة 2 في المائة لتخفيف محلول مخزون الزنك المتاح تجارياً 1000 جزء في المليون بتركيز 1000 جزء في البليون.إعداد حلول معيار العمل من 1، 000 جزء لكل مليون حل الزنك القياسية، و1، 000 جزء في مليار الحل، ثم تمييعه إلى 5، 8، 10، 15، 20، و 25 جزء في المليار مباشرة مع 2 حجم محلول حمض النيتريك. ضع ملليلتر واحد من 0.1٪ من مُعدّل مصفوفة نترات المغنيسيوم في أكواب عينة البولي بروبلين، ثم قم بتحميل الأكواب في الـ autosampler. قم ببرمجة مطياف الامتصاص الذري لإضافة خمسة ميكروليتر تلقائياً من معدّل المصفوفة إلى معايير الزنك والفراغ.تعيين نفس الشرط الأمثل على مطياف الامتصاص الذري للحلول القياسية والعينات، مع معدل تدفق مقدمة في 250 ملليلتر في الدقيقة الواحدة، ودرجة حرارة الحقن في 20 درجة مئوية، ودرجة حرارة الفرن الجرافيت تصل إلى 1، 800 درجة مئوية في أربع عمليات الخطوة. وينبغي قياس جميع المعايير والعينات لتجربة واحدة في نفس الوقت لتجنب الأخطاء بسبب اختلافات المعايرة أو التبخر. تحسين مصباح C-HCL إلى تيار من 20 أمبير، الطول الموجي من 213.9 نانومتر، ومشقوق من 0.7 نانومتر.الميبت العينات في أكواب عينة البولي بروبلين، ووضعها في كاروسيل autosampler. الحد الأدنى للكشف عن الزنك هو 0.01 جزء في البليون. ومن خلال زيادة تركيز المعايير، يتحدد الحد الأعلى للكشف عن الزنك بـ 20 جزءاً في البليون.بعد الحصول على منحنى الزنك القياسي، وقياس العينات معدن لتحديد المحتوى المعدني. إذا كانت البيانات التي تم الحصول عليها تتجاوز حد الكشف، تمييع العينات مع 18 ميجا أوم المياه النقية المعالجة مع 0.1٪ تحليلية الصف حمض النيتريك. في هذه العزلة السريعة للبروتوكول النووي، تظهر البقعة الغربية التمثيلية من التفريق بين الكائنات العضلية الأولية نقاء الكسور دون الخلوية.تم استخدام إنزيم chromatin إعادة عرض Brg1 لتحديد الكسر النووي، واستخدمت tubulin لتحديد الكسر السيتوسوليك. ويبين هذا الشكل ميكروجرافات ضوئية تمثيلية لطبقات أحادية متكاثرة ومتميزة أو التقاء لكل نوع خلية، ومحتوى الزنك المقابل في مستخلصات الخلايا الكاملة والكسور الخلوية والنووية. وأظهرت جميع خطوط الخلايا التي تم تحليلها في هذه الدراسة تركيزات الزنك في نطاق نانوموللار.أظهرت ميوتيوب الأولية المتمايزة مستويات أعلى من الزنك من الخلايا المتكاثرة. تم الكشف عن توزيع شبه الخلية مماثلة من الزنك في الخلايا العصبية المشتقة خط N2A. من ناحية أخرى، أظهرت الخلية 3T3-L1 القائمة مستويات أعلى من الزنك عندما كانت الخلايا قبل الخلايا الشحمية تتكاثر مما كانت عليه عندما كانت مستحثة أو متباينة.وأظهرت خلايا MCF10A مستويات متساوية من الزنك بين الكسور السيتوسولية والنووية في الخلايا المتكاثرة. مرة واحدة الخلايا MCF10A الوصول إلى التقاء, تم الكشف عن انخفاض 40٪ في مستويات الزنك الخلية الكاملة, ووجد أن المعدن أن تكون أكثر تركيزا في كسر السيتوسوليك. الجرافيت الجرافيت قياس الطيفية امتصاص الذر atomic فرن هو تقنية حساسة للغاية لقياس التحول والمعادن الثقيلة في العينات البيولوجية والبيئية.وينبغي توخي عناية خاصة والنظافة في إعداد الكسور دون الخلوية، حيث من المرجح أن يتداخل الحد الأدنى من التلوث مع التحليل، وذلك بسبب حساسية المعدات. ونظراً لانخفاض كميات المعادن ومستوياتها في كل تجربة، من الصعب التفكير في تقنية أفضل وأكثر دقة لقياس الزنك من GF-AAS. لا توجد تقنيات حالية يمكن أن توفر حدود الكشف والحجم المنخفض المطلوب بتكلفة منخفضة نسبيا من GF-AAS.الجرافيت الجرافيت قياس الطيفية امتصاص الذر atomic فرن دقيق وحساسة وفعالة من حيث التكلفة، ويمكن الوصول إليها. وسيستمر هذا الأسلوب التحليلي في التحسن مع استمرار تقدم تكنولوجيات الكشف عن العناصر. وسوف يشمل التطبيق المستقبلي للكشف عن الزنك والمعادن الأخرى بواسطة GF-AAS الأعضاء والأنسجة التي يتم الحصول عليها من النماذج الحيوانية، والخزعات من المرضى الذين يعانون من أمراض مرتبطة باختلالات المعادن النظامية.حمض النيتريك هو حمض تآكل للغاية قادرة على التسبب في حروق كيميائية شديدة بسرعة كبيرة. هذه المادة الكيميائية يمكن أيضا أن تتفاعل بعنف مع بعض المركبات مثل مساحيق معدنية. بسبب الخطر الذي يشكله حمض النيتريك، من المهم اتخاذ تدابير سلامة صارمة عند التعامل مع حمض النيتريك.عند التعامل مع حمض النيتريك نوصي بشدة ارتداء النظارات الكيميائية السلامة، درع الوجه للحماية من البداية، والقفازات، والتنفس البخار المعتمدة إذا التهوية ليست كافية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

الحجم الذري الدراسات الهيكلية للتجميعات الجزيئات بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي الصلبة

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

استراتيجية لتحديد المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا والبقاء على قيد الحياة في خلايا الثدييات المستزرعة في الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

كثافة التدرج الطرد الفائق للتحقيق في إعادة تدوير الغدد الصماء في خلايا الثدييات

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

التحليل الطيفي المزدوج اللون للفلورسين المترابط لدراسة التفاعل بين البروتين والبروتين وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

التحليل الطيفي للقرص المضغوط لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي والبروتين

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

تنقية بروتينات p53 في كل مكان من خلايا الثدييات

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

تكشف حساسية غشاء الميتوكوندريا الداخلي ل Na+ عن برك CoQ وظيفية مجزأة جزئيا

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...