Name: atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Faculty Diversity Scholars Award van de Universiteit van Massachusetts Medical School aan T.P.-B. N.N.-T. wordt ondersteund door SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N wordt ondersteund door de National Science Foundation Grant DBI 0959476. De auteurs zijn dankbaar Dr Daryl A. Bosco voor het verstrekken van de N2A Cell line en aan Daniella Cangussu voor haar technische ondersteuning.

1. zoogdiercellen cultuur
<ol><li>Algemene overwegingen
	<ol>
<li>Volg de aseptische technieken voor zoogdiercellen cultuur eerder beoordeeld38.</li>
		<li>Handhaaf alle cel lijnen in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 °c. De voorwaarden voor de cultuur van cellen verschillen per type cel. Het is belangrijk om de juiste cultuur voorwaarden te handhaven voor elke gebruikte cel lijn, als variaties van deze procedures zal leiden tot afwijkende fenotypes en falen va...

Atomaire absorptiespectroscopie is een zeer gevoelige methode voor Zn kwantificering in kleine volume/massa biologische monsters. De beschreven optimalisatie van Zn meting maakt toepassing van deze methode eenvoudig en garandeert ideale analytische condities. Hier, met behulp van GF-AAS, hebben we bepaald de concentratie van Zn in hele cellen, en in cytosolische en nucleaire fracties, uit verschillende cellen lijnen. De resultaten tonen aan dat deze techniek vergelijkbaar is met die verkregen door tl-sondes en ICP-MS. Bi...

Overgang en zware metalen, zoals Zn, Cu, MN, en Fe, zijn van nature in het milieu gevonden in zowel voedingsstoffen in voedsel en verontreinigende stoffen. Alle levende organismen vereisen verschillende hoeveelheden van deze micronutriënten; echter, blootstelling aan hoge niveaus is schadelijk voor organismen. Metal acquisitie is voornamelijk door het dieet, maar metalen kunnen ook worden ingeademd of geabsorbeerd door de huid1,2,3,4,5. Het is belangrijk op te merken dat de aanwezigheid van metalen in atmosferische deeltjes neemt toe en is grotendeels geassocieerd met gezondheidsrisico's. Wegens antropogene activiteiten, zijn de verhoogde niveaus van zware metalen zoals AG, zoals, cd, CR, Hg, ni, Fe, en PB ontdekt in atmosferische deeltjes kwestie, regenwater, en grond6,7. Deze metalen hebben het potentieel om te concurreren met essentiële fysiologische sporenelementen, met name Zn en Fe, en ze veroorzaken toxische effecten door het inactiveren van fundamentele enzymen voor biologische processen.
Het spoorelement Zn is redox neutraal en gedraagt zich als een Lewis zuur in biologische reacties, waardoor het een fundamentele cofactor die nodig is voor eiwit vouwen en katalytische activiteit in meer dan 10% van zoogdieren eiwitten8,9, 10; Bijgevolg is het essentieel voor diverse fysiologische functies8,11. Echter, net als vele sporenelementen, is er een delicaat evenwicht tussen deze metalen vergemakkelijken van de normale fysiologische functie en het veroorzaken van toxiciteit. Bij zoogdieren, Zn tekortkomingen leiden tot anemie, groeivertraging, hypogonadisme, huidafwijkingen, diarree, alopecia, smaakstoornissen, chronische ontsteking, en verminderde immuun-en neurologische functies11,12, 13,14,15,16,17,18. In overmaat, Zn is chemo en schaadt de absorptie van andere essentiële metalen zoals koper19,20,21.
Bovendien, sommige metalen zoals Cu en FE hebben het potentieel om deel te nemen aan schadelijke reacties. Productie van reactieve zuurstof soorten (Ros) via Fenton chemie kan interfereren met de assemblage van ijzerzwavel cluster eiwitten en Alter lipide metabolisme22,23,24. Om deze schade te voorkomen gebruiken cellen metaal-bindende chaperones en transporteurs om toxische effecten te voorkomen. Ongetwijfeld, metaal homeostase moet strak worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat specifieke soorten cellen te handhaven goede niveaus van metalen. Om deze reden, is er een significante behoefte om technieken voor nauwkeurige meting van spoormetalen in biologische steekproeven vooruit te gaan. Bij het ontwikkelen en rijpen van organismen bestaat er een differentiële biologische behoefte aan sporenelementen op cellulair niveau, in verschillende ontwikkelingsstadia, en in normale en pathologische omstandigheden. Daarom, nauwkeurige bepaling van weefsel en systemische metaal niveaus is noodzakelijk om organisch metaal homeostase te begrijpen.
Graphite Furnace atomaire absorptiespectrometrie (GF-aas) is een zeer gevoelige techniek die wordt gebruikt voor kleine monster volumes, waardoor het ideaal is om de overgang en zware metalen aanwezig zijn in biologische en milieu-monsters te meten25,26 , 27 , 28. Bovendien is het vanwege de hoge gevoeligheid van de techniek aangetoond dat het geschikt is voor het bestuderen van de fijne transport eigenschappen van na+/K+-ATPase en maag H+/K+-ATPase met behulp van Xenopus oöcyten als modelsysteem29. In GF-AAS, absorberen de verstoven elementen binnen een steekproef een golflengte van straling die door een lichtbron wordt uitgezonden die het metaal van belang bevat, met de geabsorbeerde straling evenredig aan de concentratie van het element. Elementaire elektronische excitatie vindt plaats bij absorptie van ultraviolette of zichtbare straling in een gequanteerd proces uniek voor elk chemisch element. In een enkel elektron proces, de absorptie van een foton gaat om een elektron verplaatsen van een lager energieniveau naar een hoger niveau binnen het Atoom en GF-AAS bepaalt de hoeveelheid fotonen geabsorbeerd door het monster, dat evenredig is aan het aantal straling absorberen elementen verstoven in de grafiet buis.
De selectiviteit van deze techniek berust op de elektronische structuur van de atomen, waarin elk element een specifieke absorptie/emissie spectrale lijn heeft. In het geval van Zn, de absorptie golflengte is 213,9 nm en kan precies worden onderscheiden van andere metalen. Globaal, kan GF-AAS worden gebruikt om Zn met adequate grenzen van opsporing (LOD) en hoge gevoeligheid en selectiviteit25te kwantificeren. De veranderingen in de geabsorbeerde golflengte zijn geïntegreerd en gepresenteerd als pieken van energie-absorptie op specifieke en geïsoleerde golflengten. De concentratie van de Zn in een bepaald monster wordt meestal berekend op basis van een standaardkromme van bekende concentraties volgens de wet bier-Lambert, waarbij de absorptie direct evenredig is met de concentratie van Zn in het monster. Echter, de toepassing van de beer-Lambert vergelijking met GF-AAS analyses presenteert ook een aantal complicaties. Bijvoorbeeld, variaties in de verneveling en/of niet-homogene concentraties van de monsters kan invloed hebben op de metalen metingen.
De metalen verneveling vereist voor GF AAS Trace Elemental Analysis bestaat uit drie fundamentele stappen. De eerste stap is desolvatie, waar het vloeibare oplosmiddel wordt verdampt; het verlaten van droge verbindingen na de oven bereikt een temperatuur van rond 100 °C. Vervolgens worden de verbindingen verdampt door ze te verwarmen van 800 tot 1.400 °C (afhankelijk van het te analyseren element) en een gas te worden. Tot slot, de verbindingen in de gasvormige staat zijn verstoven met temperaturen die variëren van 1.500 tot 2.500 ° c. Zoals hierboven besproken, zal het verhogen van de concentraties van een metaal van belang evenredige stijgingen van de absorptie gedetecteerd door de GF-AAS, maar de oven vermindert het dynamisch bereik van de analyse, dat is het werkbereik van concentraties die kunnen worden bepaald door het instrument. Zo, de techniek vereist lage concentraties en een zorgvuldige bepaling van het dynamisch bereik van de methode door het bepalen van de LOD en de grens van lineariteit (LOL) van de beer-Lambert wet. De LOD is de minimumhoeveelheid die nodig is om een stof te kunnen detecteren, gedefinieerd als drie maal de standaarddeviatie van Zn in de matrix. De LOL is de maximale concentratie die kan worden gedetecteerd met behulp van bier-Lambert wet.
In dit werk beschrijven we een standaardmethode om de niveaus van Zn te analyseren in hele cel extracten, cytoplasma en nucleaire fracties, en in het verspreiden en differentiëren van gekweekte cellen (Figuur 1). We hebben de snelle isolatie van kernen protocol aangepast aan verschillende cellulaire systemen om metaal verlies te voorkomen tijdens het monster voorbereiding. De gebruikte cellulaire modellen waren primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen, muizen neuroblastoma cellen (N2A of Neuro2A), muizen 3T3 L1 adipocyten, een menselijke niet-tumorigenic borst epitheel cel lijn (MCF10A), en epitheel Madin-Darby de Honds nier ( MDCK) cellen. Deze cellen werden gevestigd van verschillende lineages en zijn goede modellen voor het onderzoeken van Lineage specifieke variaties van metaal niveaus in vitro.
Primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen vormen een goed geschikt in vitro model om skeletspier differentiatie te onderzoeken. De proliferatie van deze cellen is snel wanneer gekweekt onder hoge serum voorwaarden. Differentiatie in de gespierde afstamming wordt vervolgens geïnduceerd door lage serum condities30. De muizen neuroblastoma (N2A) gevestigde cel lijn werd afgeleid van de muis neurale kuif. Deze cellen aanwezig neuronale en amoeboid stamcel morfologie. Bij differentiatie stimulus, de N2A cellen presenteren verschillende eigenschappen van neuronen, zoals neurofilaments. N2a cellen worden gebruikt om de ziekte van Alzheimer te onderzoeken, neuriet uitgroei, en neurotoxiciteit31,32,33. De 3T3-L1 muizen pre-adipocyten gevestigde cel lijn wordt vaak gebruikt om de metabole en fysiologische veranderingen in verband met adipogenesis te onderzoeken. Deze cellen presenteren een fibroblast-achtige morfologie, maar eenmaal gestimuleerd voor differentiatie, ze presenteren enzymatische activering geassocieerd met lipide synthese en triglyceriden accumulatie. Dit kan worden waargenomen als morfologische veranderingen te produceren cytoplasma lipide druppeltjes34,35. MCF10A is een niet-tumor borstklier epitheel cel lijn afgeleid van een premenopauzale vrouw met borstkanker fibrocystische ziekte36. Het is op grote schaal gebruikt voor biochemische, moleculaire, en cellulaire studies met betrekking tot borst carcinogenese zoals proliferatie, cel migratie, en invasie. De Madin-Darby Canine nier (MDCK) epitheel cel lijn is uitvoerig gebruikt om de eigenschappen en moleculaire gebeurtenissen in verband met de oprichting van de epitheel fenotype te onderzoeken. Bij het bereiken van samenvloeiing, deze cellen worden gepolariseerd en vast te stellen cel-cel adhesies, kenmerken van zoogdier epitheelweefsels37.
Om het vermogen van AAS te testen om de niveaus van Zn in zoogdiercellen te meten, analyseerden we hele en subcellulaire fracties (cytosol en Nucleus) van deze vijf cel lijnen. AAS metingen toonden verschillende concentraties van Zn in deze cel types. De concentraties waren lager in het vermenigvuldigen en het onderscheiden van primaire myoblasten (4 tot 7 nmol/mg van proteïne) en hoger in de vier gevestigde cel lijnen (die zich van 20 tot 40 nmol/mg van proteïne uitstrekken). Een kleine niet-significante stijging van Zn niveaus werd ontdekt in het onderscheiden van primaire myoblasten en neuroblastoma cellen in vergelijking met het vermenigvuldigen van cellen. Het tegenovergestelde effect werd ontdekt in onderscheiden adipocyten. Nochtans, vertoonden de vermenigvuldigende 3T3-L1 cellen hogere concentraties van het metaal in vergelijking met onderscheiden cellen. Belangrijk, in deze drie cel lijnen, subcellulaire fractionering toonde aan dat Zn is gedifferentieerd verdeeld in de cytosol en de kern volgens de metabole toestand van deze cellen. Bijvoorbeeld, in het verspreiden zich myoblasten, N2A cellen, en 3T3-L1 pre-adipocyten, is een meerderheid van het metaal gelokaliseerd aan de kern. Bij de inductie van differentiatie met behulp van specifieke cel behandelingen, Zn gelokaliseerd om de cytosol in deze drie soorten cellen. Interessant is dat beide epitheelcellen hogere niveaus van Zn toonden tijdens de proliferatie in vergelijking met bij het bereiken van samenvloeiing, waarin een karakteristieke strakke monolayer werd gevormd. In de proliferatie van Epitheelcellen, de borstklieren cel lijn MCF10A had een gelijke Zn verdeling tussen de cytosol en de kern, terwijl in de nier-afgeleide cel lijn, het grootste deel van het metaal was gelegen in de kern. In deze twee cellen, toen de cellen samenvloeiing bereikten, was Zn voornamelijk gelegen aan de cytosol. Deze resultaten tonen aan dat GF-AAS is een zeer gevoelige en accurate techniek voor het uitvoeren van elementaire analyse in lage opbrengst monsters. GF-AAS in combinatie met subcellulaire fractionering en kan worden aangepast aan de niveaus van sporenmetalen elementen in verschillende cellen en weefsels te onderzoeken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1005706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brg1-antibody (G7)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnologies</td>
			<td>sc-17796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti b-tubulin-antibody (BT7R)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-16308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidemal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>95321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>51300044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid (HNO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM (Reduced Serum Media)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol (Collagen)</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retionic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648469-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 &#181;g/mL, 2% HNO3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N9300168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Established Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3-L1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CL-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDK</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Absortion spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Aanalyst 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagnode</td>
			<td>UCD-200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells

Overgang metalen zijn essentiële micronutriënten voor organismen, maar kan giftig zijn voor cellen bij hoge concentraties door te concurreren met fysiologische metalen in eiwitten en het genereren van redox stress. Pathologische omstandigheden die leiden tot uitputting van metaal of accumulatie zijn oorzakelijke agentia van verschillende ziekten van de mens. Enkele voorbeelden zijn anemie, acrodermatitis enteropathica, en Wilson en Menkes ' ziekten. Het is daarom belangrijk om de niveaus en het vervoer van overgangsmetalen in biologische monsters met een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid te kunnen meten om onderzoek te vergemakkelijken om te onderzoeken hoe deze elementen bijdragen tot normale fysiologische functies en Toxiciteit. Zink (Zn), bijvoorbeeld, is een cofactor in veel zoogdieren eiwitten, participeert in signalering gebeurtenissen, en is een secundaire boodschapper in cellen. In overmaat, is Zn giftig en kan absorptie van andere metalen remmen, terwijl in tekort, het tot een verscheidenheid van potentieel dodelijke voorwaarden kan leiden.

Graphite Furnace atomaire absorptiespectroscopie (GF-AAS) biedt een zeer gevoelige en effectieve methode voor het bepalen van Zn en andere overgang metaal concentraties in diverse biologische monsters. Elektrothermische verneveling via GF-AAS kwantificeert metalen door atomiseren kleine hoeveelheden monsters voor de daaropvolgende selectieve absorptie analyse met behulp van golflengte van excitatie van het element van belang. Binnen de grenzen van de lineariteit van de bier-Lambert wet, de absorptie van licht door het metaal is direct evenredig aan de concentratie van de analyt. Vergeleken met andere methoden om Zn content te bepalen, detecteert GF-AAS zowel vrije als gecomplexeerde Zn in eiwitten en mogelijk in kleine intracellulaire moleculen met een hoge gevoeligheid in kleine sample volumes. Bovendien, GF-AAS is ook gemakkelijker toegankelijk dan inductief gekoppelde plasma massaspectrometrie (ICP-MS) of synchotron-based X-Ray fluorescentie. Bij deze methode wordt de systematische monstervoorbereiding van verschillende gekweekte cel lijnen voor analyses in een GF-AAS beschreven. Variaties in dit spoorelement werden vergeleken in zowel hele cel lysaten en subcellulaire fracties van proliferatie en gedifferentieerde cellen als bewijs van principe.

We testten het vermogen van de GF-AAS om de minieme niveaus van Zn in zoogdiercellen op te sporen (Figuur 1). Zo hebben we gekweekt primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen, en de gevestigde cel lijnen N2A (neuroblastoma afgeleid), 3T3 L1 (adipocyten), MCF10A (borst epitheel), en MDCK cellen (hond nier epitheel). Eerst, isoleerden wij gehele cel, cytosolische, en kern fracties van al deze cel types en evalueerden de zuiverheid van de fracties doo...

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten

Gekweekte primaire of gevestigde cel lijnen worden vaak gebruikt om fundamentele biologische en mechanistische vragen als een eerste aanpak aan te pakken voor het gebruik van dierlijke modellen. Dit protocol beschrijft hoe u hele cel extracten en subcellulaire fracties voor de studies van zink (Zn) en andere sporenelementen met atomaire absorptiespectroscopie voor te bereiden.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

De rol van overgangsmetalen in de ontwikkeling van zoogdieren wordt grotendeels onderschat. Opkomende gegevens tonen aan dat metalen homeostase blijft veranderen volgens de ontwikkelingsfase van cellen en weefsels. Bovendien, de specifieke cellulaire bestemmingen van metalen ook gevarieerd in ontwikkeling, en natuurlijk, het is een uitdaging om hun locatie te identificeren.Tot op heden zijn verschillende analytische technieken ontwikkeld om metalen te kwantificeren, maar de meeste zijn duur of ontoegankelijk. Intensief onderzoek is gericht op het verbeteren van metaalbepalingen op een meer toegankelijke en efficiënte manier. Grafietoven atoomabsorptiespectroscopie, GF-AAS, heeft twee belangrijke voordelen.Het biedt lage detectielimieten voor zink, waardoor nauwkeurige analyse van zink mogelijk is. Het is ook een techniek die geen grote hoeveelheden monster vereist, microliter van de oplossing hebben de neiging om genoeg te zijn om de analyse uit te voeren. De combinatie van deze twee voordelen maakt GF-AAS ideaal om sporenelementen in monsters met een laag volume te analyseren.Verschillende menselijke pathologische omstandigheden zijn gerelateerd aan metalen misbalansen. Enkele voorbeelden zijn bloedarmoede, acrodermatitis enteropathica, en Wilson en Menkes'ziekten. Daarom is het belangrijk om efficiënte en betrouwbare methoden te ontwikkelen om de niveaus van overgangsmetalen in biologische monsters met een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid te meten.GF-AAS is een uitstekend voorbeeld op een technologie die een bepaling van een bepaald metaal in normale fysiologische omstandigheden vergemakkelijkt, en in pathogene gevallen. De methode is zeer veelzijdig. Het kan worden toegepast op veel systemen en veel elementen kunnen worden geanalyseerd met behulp van GF-AAS.De uitdagingen zijn om de methodelimiet van detectie in de praktijk vast te stellen, om ervoor te zorgen dat de monsters binnen deze limiet vallen. Gezien het feit dat het volume van de monsters laag is, is er niet veel ruimte voor het testen, dus zorgvuldig onderzoek van de gegevens moet plaatsvinden sinds het allereerste begin. Na de eerste analyse van monsters, moeten we vaststellen wat de verdunningsfactor is die nodig is om de monsters tot de grenzen te brengen die nodig zijn voor kwantificering.Zorg ervoor dat u in staat bent om de kernen goed te fractioneren voordat u naar de AAS gaat. Westerse vlekken zijn altijd een goede validatie voorafgaand aan de spectroscopische analyse. Hoewel GF-AAS lage volumes vereist, bevinden intracellulaire pools zich al in lage volumes.Dat geeft weinig ruimte om te testen. De eerste metingen moeten zorgvuldig worden uitgevoerd en onderzocht, zodat monsterbehandeling kan worden geminimaliseerd tot slechts één verdunningsfactor. Om te beginnen, cultuur de cellen van belang in 55 vierkante centimeter platen.Gebruik een vacuümval om de cultuurmedia aan te halen. Zorg ervoor dat u alle sporen van de media te verwijderen. Gebruik ijskoude PBS vrij van calcium en magnesium om de cellen te spoelen van de gewenste tijdstippen, of cultuur voorwaarden, drie keer.Voeg vervolgens een milliliter ijskoude PBS toe aan de plaat en schraap de cellen van de plaat. Breng de celsuspensies over op een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en houd deze in het ijs. Centrifuge gedurende 10 seconden op 10.000 keer G, en verwijder de supernatant door aspiratie.Als metaalanalyse van cytoplasmatische en nucleaire fracties gewenst is, moet u de celpellet opnieuw opschonen in 400 microliter ijskoude PBS met 0,1%NP-40, een niet-ionisch wasmiddel. Breng 100 microliter naar een nieuwe microcentrifugebuis als het hele celmonster, en bewaar het op min 20 graden Celsius. Om kernen te isoleren, gebruik een P1000 micropipet tip om de 400 microliter celopening op en neer vijf tot 10 keer op ijs te pipetteen.Haal vervolgens vijf microliter van de celsuspensie eruit en breng deze over naar een glazen schuif. Plaats de vijf microliters onder een lichtmicroscoop met behulp van een 40 keer doel om de kernen integriteit te controleren. Centrifugeer de resterende 395 microliter cellysate suspensie gedurende 10 seconden bij 10.000 keer G.Breng de supernatant met de cytosolische fractie over naar een nieuwe microcentrifugebuis.Voeg vervolgens 500 microliter van de PBS met 0,1%NP-40 toe om de pellet met de kernfractie te spoelen en vercentrifuge gedurende 10 seconden op 10.000 keer G.Verwijder de supernatant en zet de pellet met de kernen opnieuw in 100 microliters van dezelfde oplossing. Om de cellen te lyse, gebruik een Bioruptor om de hele cel en kernen met oplossing drie keer sonisch, elk gedurende vijf minuten. Ga over tot kwaliteitscontrole van de zuiverheid van de fracties door westelijke vlek uit te voeren, met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor de nucleaire of cytosolische fracties.Voeg eerst een gelijk volume geconcentreerd salpeterzuur van spoormetaal aan de hele cel, cytoplasmatische en nucleaire fracties met 100, 500 en 100 microliter celsuspensie toe in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen en plaats ze in een thermisch blok bij 80 graden Celsius om de celkweek gedurende een uur te mineraliseren. Daarna, haal de buizen uit het thermische blok en leg ze in een rek om de zure spijsvertering 's nachts voort te zetten op 20 graden Celsius. Stop de reactie door 30% van het monstervolume waterstofperoxide toe te voegen.Breng het monstervolume naar 500 microliter met 18 mega Ohm gezuiverd water. Vervolgens, in een 15 milliliter Falcon buis verdunnen analytische kwaliteit standaard stikstofmonoxide in gezuiverd water op 18 mega Ohm voor te bereiden twee volume procent salpeterzuur oplossing als de lege oplossing tijdens kalibratie. Gebruik vervolgens de twee volume procent salpeterzuuroplossing om een commercieel beschikbare 1.000 ppm zinkvoorraadoplossing te verdunnen met een concentratie van 1.000 delen per miljard.Bereid werkende standaardoplossingen voor van de 1.000-part per miljoen zinkstandaardoplossing, de 1.000-part per miljard oplossing, en verdun deze vervolgens rechtstreeks tot 5, 8, 10, 15, 20 en 25 ppb met een 2 volume procent salpeterzuuroplossing. Plaats een milliliter van 0,1%magnesium nitraat matrix modifier in polypropyleen monster bekers, en laad de kopjes in de autosampler carrousel. Programmeer de atomaire absorptiespectrometer om automatisch vijf microliters van de matrixmodifier toe te voegen aan de zinknormen en de blanco.Stel dezelfde geoptimaliseerde toestand op de atomaire absorptiespectrometer voor de standaardoplossingen en de monsters, met introductiestroomsnelheid op 250 milliliter per minuut, injectietemperatuur op 20 graden Celsius en grafietoventemperatuur die in vier stappen processen 1,800 graden celsius bereikt. Alle normen en monsters van één enkel experiment moeten tegelijkertijd worden gemeten om fouten als gevolg van kalibratieverschillen of verdamping te voorkomen. Optimaliseer de lamp C-HCL tot een stroom van 20 ampère, golflengte van 213,9 nanometer en een spleet van 0,7 nanometer.Pipette de monsters in polypropyleen monster bekers, en plaats ze in de autosampler carrousel. De ondergrens van de detectie van zink is 0,01 delen per miljard. Door de concentratie van de normen te verhogen, wordt de bovengrens van de detectie van zink vastgesteld op 20 delen per miljard.Na verkregen zinknormcurve meet u de gemineraliseerde monsters om het metaalgehalte te bepalen. Als de verkregen gegevens de detectiegrens overschrijden, verdun dan de monsters met 18 mega Ohm gezuiverd water dat met 0,1% analytisch salpeterzuur is behandeld. In deze snelle isolatie van kernen protocol, een representatieve westelijke vlek van het onderscheiden van primaire myoblasten toont de zuiverheid van subcellulaire fracties.Het chromatine remodeler enzym Brg1 werd gebruikt om de kernfractie te identificeren, en tubuline werd gebruikt om de cytosolische fractie te identificeren. Deze figuur toont representatieve lichtmicrografen voor zich verspreidende en gedifferentieerde of samenvloeiende monolagen van elk celtype, en het overeenkomstige zinkgehalte in hele celextracten, cytosolische en nucleaire fracties. Alle cellijnen geanalyseerd in deze studie toonden zinkconcentraties in het nanomolar bereik.Gedifferentieerde primaire myobuizen vertoonden hogere niveaus van zink dan zich vermenigvuldigende cellen. Een soortgelijke subcellulaire verdeling van zink werd gedetecteerd in de neuroblastoom afgeleide cellijn N2A. Aan de andere kant vertoonde de gevestigde 3T3-L1-cellijn hogere zinkniveaus wanneer de pre-adipocyten zich vermenigvuldigden dan toen ze werden geïnduceerd of gedifferentieerd.MCF10A cellen toonden gelijke niveaus van zink tussen cytosolische en nucleaire fracties in zich vermenigvuldigende cellen. Zodra MCF10A cellen samenvloeiing bereiken, werd een 40% afname van het hele celzinkgehalte gedetecteerd en het metaal bleek het meest geconcentreerd te zijn in de cytosolische fractie. Grafietoven atoomabsorptiespectrometrie is een zeer gevoelige techniek om de overgang en zware metalen in biologische en milieumonsters te meten.Bijzondere zorg en reinheid bij de bereiding van subcellulaire breuken moet worden genomen, omdat minimale verontreiniging waarschijnlijk de analyse zal verstoren, vanwege de gevoeligheid van de apparatuur. Gezien de lage volumes en sporen van metalen in elk experiment, is het moeilijk om een betere en nauwkeurigere techniek te bedenken om zink te meten dan GF-AAS. Er zijn geen huidige technieken die de grenzen van detectie en een laag volume kunnen bieden die nodig zijn tegen de relatief lage kosten van GF-AAS.Grafietoven atoomabsorptiespectrometrie is nauwkeurig, gevoelig, kosteneffectief en toegankelijk. Deze analytische techniek zal blijven verbeteren naarmate elementaire detectietechnologieën zich blijven verbeteren. Toekomstige toepassing voor detectie van zink en andere metalen door GF-AAS omvat organen, weefsels verkregen uit diermodellen en biopten van patiënten met een ziekte die verband houden met systemische metaalonevenwichtigheden.Salpeterzuur is een extreem corrosief zuur dat zeer snel ernstige chemische brandwonden kan veroorzaken. Deze chemische stof kan ook heftig reageren met bepaalde verbindingen zoals metaalpoeders. Vanwege het gevaar van salpeterzuur, is het belangrijk om strenge veiligheidsmaatregelen te nemen bij het hanteren van salpeterzuur.Bij het hanteren van salpeterzuur raden we u ten zeerste aan een veiligheidsbril, gezichtsschild voor spatbescherming, handschoenen en goedgekeurde dampademhaling te dragen als de ventilatie niet voldoende is.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Dichtheidsgradiënt Ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Interne mitochondriale membraangevoeligheid voor Na + onthult gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...