Name: inducing apical periodontitis in mice
Uploaded: 2019-08-06T13:30:00
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Nos gustaría reconocer al Dr. Oded Heyman por su ayuda con el posicionamiento animal, A Rafael Lieber por su ayuda con el análisis de micro-CT, y la Prof. Andiara De Rossi Daldegan por su consejo sobre la preformación del experimento. También nos gustaría reconocer al Dr. Sidney Cohen por su lectura y edición críticas.
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Dr. Izador I. Cabakoff Research Endowment Fund a MK e IA, y una beca Yitzhak Navon del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel a EG.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Hebrea (Ethics no. MD-17-15093-5).
1. Anestesia animal y posicionamiento
<ol><li>Prepare soluciones estériles como se describe a continuación.<ol>
<li>Preparar 5 ml de 7 mg/ml de ketamina y 0,09 mg/ml de medetomidina diluida en solución tampón de fosfato (PBS)/Saline.</li>
		<li>Preparar una solución estéril de Atipamezol (0,4 mg/ml) diluida en PBS/S...

<ol>
	<li>Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IL-6+on+apical+periodontitis:+a+systematic+review.">The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review.</a> International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).</li><li>Marton, I. J., Kiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+protective+and+destructive+regulatory+pathways+in+apical+periodontitis.">Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis.</a> Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).</li><li>Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+apical+periodontitis:+a+literature+review.">Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).</li><li>Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+Associated+with+Apical+Periodontitis:+A+Multilevel+Analysis.">Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis.</a> Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).</li><li>Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+immunoglobulin-synthesizing+cells+in+human+dental+periapical+lesions+by+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry.">Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry.</a> Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).</li><li>Lin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+lipoteichoic+acid+regulates+macrophages+autophagy+via+PI3K/Akt/mTOR+pathway.">Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway.</a> Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).</li><li>Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Lipoxygenase+Knockout+Aggravated+Apical+Periodontitis+in+a+Murine+Model.">5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model.</a> Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).</li><li>Barreiros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+mRNA+expression+of+RANK,+RANKL,+OPG,+TLR2+and+MyD88+during+apical+periodontitis+progression+in+mice.">Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice.</a> Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).</li><li>Barreiros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP2+and+MMP9+are+Associated+with+Apical+Periodontitis+Progression+and+Might+be+Modulated+by+TLR2+and+MyD88.">MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88.</a> Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).</li><li>Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR-2+reduces+while+combined+VEGFR-2+and+-3+signaling+increases+inflammation+in+apical+periodontitis.">VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis.</a> Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).</li><li>De Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cementocytes+Express+Receptor+Activator+of+the+Nuclear+Factor+Kappa-B+Ligand+in+Response+to+Endodontic+Infection+in+Mice.">Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice.</a> Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).</li><li>Rider, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD14+(Cluster+of+Differentiation+14)+and+Toll-Like+Receptor+(TLR)+4+Signaling+Deteriorate+Periapical+Inflammation+in+TLR2+Deficient+Mice.">Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice.</a> Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).</li><li>Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+hypertension+and+periapical+lesion:+an+in+vitro+and+in+vivo+study.">Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study.</a> Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).</li><li>Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Periapical+Diseases+in+Medication-Related+Osteonecrosis+of+the+Jaws.">Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws.</a> Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).</li><li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preexisting+Periapical+Inflammatory+Condition+Exacerbates+Tooth+Extraction-induced+Bisphosphonate-related+Osteonecrosis+of+the+Jaw+Lesions+in+Mice.">Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice.</a> Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+Preconditioning+Enhances+Dental+Pulp+Stem+Cell+Therapy+for+Infection-Caused+Bone+Destruction.">Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction.</a> Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).</li><li>Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sodium+sulfate+colitis+murine+model:+An+indispensable+tool+for+advancing+our+understanding+of+inflammatory+bowel+diseases+pathogenesis.">Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).</li><li>Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+for+rheumatoid+arthritis.">Experimental animal models for rheumatoid arthritis.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).</li><li>Shah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clastic+cells+are+absent+around+the+root+surface+in+pulp-exposed+periapical+periodontitis+lesions+in+mice.">Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice.</a> Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).</li><li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+deficiency+increased+the+size+of+experimentally+induced+apical+periodontitis.">MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis.</a> Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).</li><li>Bezerra da Silva, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88+knockout+mice+develop+initial+enlarged+periapical+lesions+with+increased+numbers+of+neutrophils.">MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils.</a> International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).</li><li>Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+of+Apical+Periodontitis:+Emerging+Role+of+Epigenetic+Regulators.">Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators.</a> Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).</li><li>Metzger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+periapical+lesions.">Macrophages in periapical lesions.</a> Endodontics Dentisrty and Traumatology. 16 (1), 1-8 (2000).</li><li>Lungova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth-bone+morphogenesis+during+postnatal+stages+of+mouse+first+molar+development.">Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development.</a> Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).</li><li>Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+local+anaesthesia+on+anaesthetic+requirements+for+feline+ovariectomy.">The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy.</a> Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).</li><li>Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preemptive+analgesia+and+local+anesthesia+as+a+supplement+to+general+anesthesia:+a+review.">Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review.</a> Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).</li><li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Direct+Pulp-capping+Model+for+the+Evaluation+of+Pulpal+Wound+Healing+and+Reparative+Dentin+Formation+in+Mice.">Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice.</a> Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).</li><li>Yoneda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+root+canal+treatment+model+in+the+rat.">Development of a root canal treatment model in the rat.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).</li><li>AlShwaimi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+in+mouse+periapical+lesions.">Regulatory T cells in mouse periapical lesions.</a> Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).</li></ol>

Aquí se introduce un método para la inducción de la periodontitis apical en ratones. El objetivo del método es explotar la condición de periodontitis apical para el estudio de los mecanismos y consecuencias de este proceso inflamatorio. La periodontitis apical fue inducida en ratones de 6-8 semanas de edad, una edad en la que las raíces están completamente desarrolladas24. Con el fin de causar periodontitis apical en este modelo, la pulpa dental de los molares mandibulares del ...

El objetivo de este método es inducir la periodontitis apical en un ratón contaminando el ápice con la microflora natural, y luego estudiar varias características de este proceso patológico.
La periodontitis apical (AP) es una patología común de naturaleza inflamatoria en los tejidos periodontales que rodean la raíz dental. Esta enfermedad dental puede causar dolor intenso y debe ser tratada por un dentista. Las opciones de tratamiento incluyen tratamiento de conducto radicular (primario o secundario), cirugía de endodoncia, extracción dental o seguimiento dependiendo de los hallazgos clínicos y radiográficos, y la opinión del médico. El mecanismo de este proceso inflamatorio, aunque estudiado durante varias décadas1,2,3, todavía no se entiende exhaustivamente. Teniendo en cuenta la gravedad de esta patología, existe, por tanto, una clara necesidad de investigación que aborde su naturaleza fundamental. Por lo tanto, los sistemas donde el estudio de AP es posible son de gran interés científico.
Puesto que la AP es un proceso patológico complejo que involucra los tejidos locales y el sistema inmunológico, los estudios in vitro son insuficientes para una comprensión completa de los procesos. El estudio de muestras clínicas de esta enfermedad también son problemáticos debidoa limitaciones éticas y variabilidad significativa entre diferentes personas y diferentes etapas clínicas 4,5, y por lo tanto la necesidad de modelos in vivo. Estos modelos se basan en el concepto de exponer la pulpa dental a la contaminación y observar la reacción inflamatoria del cuerpo a este estímulo en los tejidos periapicales6,7. Los modelos in vivo comunes incluyen roedores o animales más grandes como perros. A pesar del desafío clínico en el tratamiento de ratones, que son animales muy pequeños con dientes en miniatura, las ventajas del modelo de ratón son significativas: prácticamente, trabajar con ratones es técnicamente simple en términos de instalaciones y es más rentable, y científicamente, el ratón es un modelo animal bien estudiado con herramientas genéticas y moleculares fácilmente disponibles y un genoma bien estudiado. De hecho, estudios previos utilizaron un modelo de ratón para estudiar señales de resorción inflamatorias y óseas y células implicadas en la periodontitis apical8,9,10,11. Por lo tanto, se necesita un protocolo claro sobre cómo utilizar un modelo de ratón para el estudio del AP. Aquí, describimos tal protocolo.
El protocolo descrito aquí tiene la gran ventaja de ser apropiado para estudiar ratones knock-out (KO) y aprender cómo la falta de un gen específico afecta la inflamación dental7,12. Otras aplicaciones útiles de este protocolo incluyen el estudio de los efectos de los medicamentos y las condiciones sistémicas en el desarrollo de la periodontitis apical13,el efecto de la periodontitis apical en el desarrollo de osteonecrosis de las mandíbulas14 , 15 y terapia con células madre para la regeneración ósea16.
Este protocolo también se puede generalizar como un modelo para estudiar la inflamación local. Para estudiar el proceso inflamatorio, se han desarrollado varios modelos de ratón, que incluyen por ejemplo colitis inducida o artritis17,18. Estos modelos tienen efectos sistémicos y no tienen control incorporado en el mismo animal. Los modelos de periodontitis apical inducida, que incluyen un control contralateral sin inflamación, tienen la ventaja de superar estas limitaciones14,19.
El protocolo descrito a continuación es por lo tanto útil para los investigadores que están interesados en los procesos inflamatorios locales. La naturaleza controlada de esta inflamación, su confinamiento a un lugar específico, y el diente de control contralateral, hacen que este protocolo sea valioso para el estudio de los mecanismos involucrados en este proceso. Además, el protocolo es útil para los investigadores interesados en los aspectos clínicos de la inflamación periapical. El modelo de ratón es ideal para estudiar diferentes variables de la enfermedad, además de la ventaja de poder realizar fácilmente manipulaciones genéticas en el modelo de ratón, para investigar la actividad de genes específicos en la inflamación periapical.
Técnicamente, el procedimiento clínico es difícil de llevar a cabo debido a las pequeñas dimensiones de los dientes de los ratones. Será beneficioso visualizar este procedimiento con el fin de aprender sobre el posicionamiento, el equipo necesario y el rendimiento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Eurovet Animal Health</td>
			<td>CAS 104075-48-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATR</td>
			<td>dentsply</td>
			<td>tecnika</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine</td>
			<td>vetmarket</td>
			<td>163451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clinical microscope/binocular</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Sz61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dental bur</td>
			<td>Komet dental</td>
			<td>ZR8801L 315 008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dental spatula</td>
			<td>Premier</td>
			<td>1003737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>8993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>entelan</td>
			<td>mercury</td>
			<td>1.07961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>HT110116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>MHS 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>CAS 1867-669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine hydrochloride (cepetor)</td>
			<td>CP-pharma GmbH</td>
			<td>CAS 86347-15-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mepivacaine HCl 3%</td>
			<td>Teva</td>
			<td>CAS 96-88-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microbrushes- adjustable precision applicators</td>
			<td>PARKELL</td>
			<td>S379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-ct scanner</td>
			<td>scanco</td>
			<td>uCT 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39602004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol eye ointment (5%)</td>
			<td>Rekah pharmaceutical</td>
			<td>CAS 56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tweezers</td>
			<td>WAM</td>
			<td>Ref-CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine</td>
			<td>Eurovet Animal Health</td>
			<td>CAS 7361-61-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>CAS 1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing apical periodontitis in mice

Los mecanismos involucrados en la inflamación inducida local se pueden estudiar utilizando varios modelos animales disponibles. Una de ellas es la inducción de la periodontitis apical (AP). La periodontitis apical es una patología común de naturaleza inflamatoria en los tejidos periodontales que rodean la raíz dental. Para entender mejor la naturaleza y el mecanismo de esta patología es ventajoso realizar el procedimiento en ratones. La inducción de esta inflamación odontogénica se logra perforando en el diente del ratón hasta que la pulpa dental esté expuesta. A continuación, la pulpa dental permanece expuesta a ser contaminada por la flora oral natural con el tiempo, causando periodontitis apical. Después de este período de tiempo, el animal es sacrificado, y el diente y el hueso de la mandíbula se pueden analizar de varias maneras. Los análisis típicos incluyen imágenes de micro-CT (para evaluar la resorción ósea), tinción histológica, inmunohistoquímica y expresión de ARN. Este protocolo es útil para la investigación en el campo de la biología oral para entender mejor este proceso inflamatorio en un entorno experimental in vivo con condiciones uniformes. El procedimiento requiere un manejo cuidadoso de los ratones y la mandíbula aislada, y una demostración visual de la técnica es útil. Se demuestran todos los aspectos técnicos de los procedimientos que conducen a la periodontitis apical inducida y su caracterización en un modelo de ratón.

En la Figura 1se presenta un diagrama de flujo de los pasos experimentales. Como se menciona en el protocolo, los ratones son anestesiados, y su primer molar mandibular en un lado se perfora hasta la exposición de la pulpa, mientras que el diente contralateral se deja como un control. A continuación, los dientes se dejan contaminar por la flora oral durante 42 días, durante los cuales son monitoreados y reciben analgésicos. Después de 42 días, los raton...

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Inducing Apical Periodontitis in Mice

Aquí, presentamos un protocolo para inducir localmente la periodontitis apical en ratones. Mostramos cómo perforar un agujero en el diente del ratón y exponer su pulpa, con el fin de causar inflamación local. También se demuestran métodos de análisis para investigar la naturaleza de esta inflamación, como la microtomografía y la histología.

Inducir la Periodontitis Apical en Ratones

The mechanisms involved in local induced inflammation can be studied using several available animal models. One of these is the induction of apical ...

Nuestro protocolo permite el estudio de la periodontitis periapical en un modelo de ratón accesible y controlado. Por lo tanto, este protocolo tiene ventajas sobre las muestras de pacientes o modelos in vitro. Las principales ventajas de esta técnica son que el ratón ha sido bien estudiado y que el método es técnicamente simple en términos de requisitos de la instalación y es rentable.Como este procedimiento es difícil debido a las pequeñas dimensiones de los dientes, es beneficioso visualizar el procedimiento para aprender sobre el posicionamiento y el rendimiento de la técnica. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, coloque el ratón en el lado dominante de la mano en una superficie de espuma de poliestireno extruido de celda cerrada y asegure las patas con cinta adhesiva. Usando una sola banda de goma por par de incisivos, y agujas largas ancladas a la superficie de espuma de poliestireno extruido de celda cerrada, apuntalar la boca abierta.Utilice fórceps cerrados pegados a la espuma para retraer la mejilla derecha. Y coloque la espuma y el ratón bajo un microscopio y una fuente de luz. Luego, retraiga la lengua usando una espátula dental y use una aguja de calibre 27 para inyectar 25 a 50 microlitros de anestesia local en el pliegue mucobcal adyacente al primer molar mandibular.Se debe observar hinchazón del tejido alrededor del lugar de la inyección. Para exponer la pulpa, utilice cualquier motor dental adecuado equipado con un diamante redondo de alta velocidad de 0,8 milímetros de bur dental a una velocidad de 800 rondas por minuto, para perforar la parte oclusal del primer molar mandibular derecho hasta que los cuernos de pulpa sean visibles a través de la dentina. Utilice un archivo K o H, el número ocho o el número 10 para perforar la pulpa y romper la dentina que cubre los cuernos de pulpa mesial y distal para permitir la inserción del archivo en los cuernos.Continúe trabajando con los archivos dentro de la pulpa tan profundamente como sea posible mientras se ensancha las aberturas con los archivos, el sangrado de la pulpa se observa típicamente alrededor de los bordes afilados del diente con la fresa y eliminar el diente de la aclusión para reducir el dolor durante el experimento. Use un micro cepillo para limpiar los restos. Y dejar el primer molar mandibular izquierdo contralateral como control.Durante los primeros tres días después del procedimiento, pesa los animales e inyecta 0,1 miligramos por kilogramo de buprenorfina por vía intraperitoneal una vez al día. Continúe monitoreando a los animales durante los próximos 42 días pesando y evaluando el comportamiento general de dos a tres veces por semana. Y entregar pellets de alimentos suavizados con agua en un plato de Petri en el suelo de la jaula durante el período de seguimiento.Al final del experimento, utilice tijeras quirúrgicas y fórceps para recoger la parte de la mandíbula que incluye los tres molares en ambos lados tratados y no tratados. Y usar fórceps para pelar la mayor cantidad posible de tejido blando, dejando principalmente hueso y dientes en las muestras. Enjuague brevemente el tejido en PBS.Antes de fijar en paraformaldehído al cuatro por ciento durante 24 a 48 horas. A continuación, enjuague las muestras tres veces en PBS fresco. Para la tomografía microcalculcular, o análisis de Micro-CT, coloque los tejidos cosechados en un tubo de 12 milímetros de diámetro que contenga 1,5 mililitros de PBS en la etapa del escáner.Con las muestras orientadas de modo que las superficies bucales o linguales del diente y la raíz se encuentran paralelas a la parte inferior del tubo. Use una esponja para separar las muestras. Y cubra la parte superior del tubo con película flexible.Seleccione el archivo de control y establezca la energía en 70 kilovoltas, la intensidad a 114 micro amperios y la resolución en un tamaño Voxel de seis micrómetros en cubos. Haga clic en Scout-View. Cuando aparezca la imagen, haga clic en Línea de referencia y marque el área de los ejemplos para escanearlas, haciendo clic en Agregar análisis después de cada muestra.Cuando se hayan marcado todos los ejemplos, vaya a la lista de tareas y seleccione Iniciar tareas de interacción. Para el contorno de las rodajas de Micro-CT, seleccione la rebanada que representa el centro aproximado del diente, en el que la pulpa coronal, la pulpa radicular de ambos canales y ambos foramens apicales están presentes. Haga clic en el panel de contorno y, a partir del punto distal del ápice de la raíz distal, marque el borde apical coronalmente al área apical de la clave radial, a través del borde mesial del ápice raíz de mesial, siguiendo el borde distal de la raíz mesial, y el borde mesial de la raíz distal, a través de la región de furcación.Copie y pegue el contorno resultante y ajuste el contorno en consecuencia a cinco sectores colocados a cada lado del sector medio. Para calcular el volumen de tejido del contorno marcado para cada muestra, en Evaluación de Micro-CT, seleccione Tarea y haga clic en Evaluación 3D. A continuación, en la ventana de Evaluación 3D, haga clic en Seleccionar y seleccione un filtro para calcular el volumen de tejido.Al final del análisis de Micro-CT, transfiera los tejidos del escáner a un tubo de micro centrífuga que contenga un mililitro de EDTA durante 10 días. Al final de la descalcificación, coloque las muestras en casetes histológicos que contengan concentraciones crecientes de etanol, durante una hora por concentración. Después de la segunda inmersión de etanol, transfiera las muestras al xileno para dos inmersiones de una hora, antes de transferir los casetes a 60 grados Celsius parafina líquida en una campana química durante la noche para permitir que el xileno se evapore.A la mañana siguiente, coloque las muestras deshidratadas con la corona y las raíces orientadas paralelas a la parte inferior del molde, en una máquina de bloqueo histológico para incrustar las muestras en la parafina. Para obtener secciones, fije la muestra del bloque de parafina en el bloque de corte de microtonos y recorte la muestra hasta que se alcance el tejido de interés. Cuando cualquier parte del diente es visible, comience a obtener secciones de seis micrómetros de espesor, ajustando el ángulo de corte hasta obtener secciones sagitales que incluyen la pulpa coronal y radicular y el foramen apical.Aquí, se muestra toda una mandíbula tratada. La ampliación del primer molar derecho tratado, permite la observación de la exposición de los cuernos de pulpa mesial y distal y la entrada a los canales. Las imágenes micro-CT permiten la visualización de la exposición a la pulpa mesial, y las áreas radiolúcidas periapicales mesiales y distales de la reabsorbencia ósea.De hecho, se mide una reabsorbción ósea periapical significativa del volumen tisular en los dientes tratados, en comparación con los controles. El análisis histológico indica que en el diente tratado, la pulpa dental en sí presenta necrosis, que se puede observar claramente después de la tinción H y E en comparación con el control del tejido pulpar organizado. Además, y lo que es más importante, en la región periapical del diente tratado, se observa una lesión periapical compuesta de células inmunitarias, que está ausente en los dientes de control.Es vital colocar el ratón correctamente durante la exposición a la pulpa ya que un posicionamiento correcto permite un buen acceso a la boca del animal y resultados óptimos. Se pueden realizar métodos adicionales de análisis de inflamación periapical como la tinción de tejido inmunohistoquímico y el fax y el análisis molecular detallado de las células siguiendo este protocolo. Este protocolo es significativo, no sólo para la investigación dental, sino también para la investigación inmunológica, ya que proporciona un modelo para la inflamación inducida local con un control interno incorporado.

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