Name: an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota
Uploaded: 2019-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

Forfatterne anerkender taknemmeligt støtte fra Center for diabetes, fedme og metabolisme og det kliniske og translationelle videnskabscenter, Wake Forest School of Medicine, Department of Defense finansiering (tilskudsnummer: W81XWH-18-1-0118), Kermit Glenn Phillips II stol i hjerte-kar-medicin; National Institutes of Health finansierede Claude D. Pepper ældre amerikanere Center (finansieret af P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 og det kliniske og translationelle videnskabs Center (klinisk forskningsenhed, finansieret af UL1TR001420), er også heldigvis anerkendt. Vi takker også de frivillige for at levere fækale prøver, og vores andre Lab medlemmer for deres tekniske hjælper under dette eksperiment.

Forsigtig: Se de relevante materiale sikkerheds data blade, og følg instruktionerne og retningslinjerne for passende biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) træning. Følg alle dyrknings trinene i forhold til standardreglerne for biosikkerhed, og brug et BSL-2 kabinet med aseptiske forhold. Desuden, fækale prøver fra forskellige modeller og mennesker kan have en potentiel risiko for spredning af mikrobielle bårne sygdomme. Straks søge lægehjælp i tilfælde af skade og infektion. Desuden bør brugen af prøver fra mennesker...

<ol>
	<li>Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiome+in+health+and+in+disease.">The gut microbiome in health and in disease.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).</li><li>Xu, Z., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+effects+on+human+gut+microbiome+diversity.">Dietary effects on human gut microbiome diversity.</a> British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).</li><li>Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+and+Alzheimer&#8217;s+disease.">The gut microbiota and Alzheimer&#8217;s disease.</a> Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).</li><li>Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+gut+microbiota+on+human+health:+an+integrative+view.">The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view.</a> The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).</li><li>Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+mediated+modulation+of+gut+flora+might+be+biotherapeutical+approach+obesity+and+type+2+diabetes.">Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes.</a> Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).</li><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+Polysaccharides+in+the+Amelioration+of+Gut+Microbiome+Dysbiosis+and+Metabolic+Diseases.">Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases.</a> Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-Linked+Gut+Microbiome+Dysbiosis+Associated+with+Derangements+in+Gut+Permeability+and+Intestinal+Cellular+Homeostasis+Independent+of+Diet.">Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet.</a> Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).</li><li>Paul, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+diet+and+the+gut+microbiome+on+epigenetic+modulation+in+cancer+and+other+diseases.">Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases.</a> Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).</li><li>O&#8217;mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+tryptophan+metabolism+and+the+brain-gut-microbiome+axis.">Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis.</a> Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).</li><li>Sharon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+metabolites+from+the+microbiome+in+health+and+disease.">Specialized metabolites from the microbiome in health and disease.</a> Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).</li><li>Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+digestion+and+fermentation+characteristics+of+temulose+molasses,+a+coproduct+of+fiberboard+production,+and+select+temulose+fractions+using+canine+fecal+inoculum.">In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum.</a> Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).</li><li>Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetable+fiber+fermentation+by+human+fecal+bacteria:+cell+wall+polysaccharide+disappearance+and+short-chain+fatty+acid+production+during+in+vitro+fermentation+and+water-holding+capacity+of+unfermented+residues.">Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues.</a> Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-origin+probiotic+cocktail+increases+short-chain+fatty+acid+production+via+modulation+of+mice+and+human+gut+microbiome.">Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+microbiome+signatures+and+short-chain+fatty+acids+in+mouse,+rat,+non-human+primate+and+human+feces.">Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).</li><li>Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced+decreases+in+the+levels+of+microbial-derived+short-chain+fatty+acids+promote+gastrointestinal+colonization+of+Candida+albicans.">Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans.</a> bioRxiv. , 428474 (2018).</li><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prebiotics+from+acorn+and+sago+prevent+high-fat+diet-induced+insulin+resistance+via+microbiome-gut-brain+axis+modulation.">Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+Microbiome+Composition+in+Non-human+Primates+Consuming+a+Western+or+Mediterranean+Diet.">Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Garcia-Villalba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+method+for+gas+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+short-chain+fatty+acids+in+faecal+samples.">Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples.</a> Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+vs+Fresh+Fecal+Microbiota+Transplantation+and+Clinical+Resolution+of+Diarrhea+in+Patients+With+Recurrent+Clostridium+difficile+Infection:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).</li><li>Chen, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+xylooligosaccharides+produced+from+Miscanthus&#215;+giganteus+by+human+fecal+microbiota.">In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus&#215; giganteus by human fecal microbiota.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).</li><li>Cook, S., Sellin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">Short chain fatty acids in health and disease.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).</li><li>Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbes+and+health:+a+focus+on+the+mechanisms+linking+microbes,+obesity,+and+related+disorders.">Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders.</a> Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-mediated+nourishment+of+gut+microbiota+protects+against+diet-induced+obesity+by+restoring+IL-22-mediated+colonic+health.">Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).</li><li>Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut&#8211;brain+axis+in+2016:+Brain&#8211;gut&#8211;microbiota+axis&#8212;mood,+metabolism+and+behaviour.">Gut&#8211;brain axis in 2016: Brain&#8211;gut&#8211;microbiota axis&#8212;mood, metabolism and behaviour.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 69 (2017).</li></ol>

In vitro fækal gylle fermenterings model præsenteret her er en simpel single-batch model til at tilnærme virkningerne af forskellige substrater og mikrobielle stammer (f. eks prebiotics og probiotika) på sammensætningen af human fækal mikrobiota samt dens metaboliske aktiviteter i form af fækal pH og SCFAs niveauer. Resultaterne præsenteres heri viser, at inokulering af inulin nedsætter fækal pH og øger niveauet af SCFAs og lactat i inulin-behandlet fækal model i forhold til ikke-behandlede fækale mikrobiota...

Den humane mikrobiota er et komplekst fællesskab bestående af bakterier, archaea, vira og eukaryote mikrober1, der bebor den menneskelige krop internt og eksternt. Nylige beviser har fastlagt den grundlæggende rolle, som Gut mikrobiota og tarm mikrobiome (hele samlingen af mikrober og deres gener findes i den menneskelige mave-tarmkanalen) i forskellige sygdomme hos mennesker, herunder fedme, diabetes, hjerte-kar-sygdomme, og kræft1,2,3. Derudover producerer de mikroorganismer, der lever i vores tarm, et bredt spektrum af metabolitter, som i væsentlig grad påvirker vores helbred og kan også bidrage til patofysiologien af flere sygdomme samt en række metaboliske funktioner4, 5. unormale ændringer (perturbationer) i sammensætningen og funktionen af denne Gut mikrobielle population er generelt betegnes som "Gut dysbiosis". Dysbiosis er normalt forbundet med en usund tilstand af værten og dermed kan differentieres fra den normale (homeostatisk) mikrobielle samfund forbundet med en sund kontroltilstand af værten. Specifikke mønstre af Gut mikrobiome dysbiosis findes ofte i forskellige forskellige sygdomme1,2,3,6,7.
Fermentering af ufordøjet mad, især de fermenterbare kulhydrater/fibre, af Gut mikrobiota ikke kun giver energi, men også producerer divergerende metabolitter, herunder kortkædede fedtsyrer (scfas), lactat, formate, carbondioxid, metan, brint og ethanol6. Desuden producerer Gut mikrobiota også en række andre bioaktive stoffer såsom folat, biotin, trimethylamin-N-oxid, serotonin, tryptophan, gamma-aminosmørsyre, dopamin, noradrenalin, acetylcholin, histamin, deoxycholic Acid og 4-ethylphenyl sulfat. Dette sker primært gennem udnyttelse af iboende metaboliske strømme inden for værten-Microbe niche, som bidrager i flere krops processer, metaboliske funktioner og epigenetiske ændringer1,8,9, 10. Virkningerne af forskellige interventioner på sådanne mikrobielle produkter forbliver imidlertid ukendte eller uklare på grund af manglen på enkle, effektive og reproducerbare protokoller. Den menneskelige tarm mikrobiota sammensætning er et yderst komplekst og mangfoldigt økosystem, og derfor er mange spørgsmål om dets rolle i menneskers sundhed og sygdoms patologi stadig ubesvarede. Virkningerne af mange almindelige tarm mikrobiome modulatorer (fx probiotika, prebiotics, antibiotika, fækal transplantation og infektioner) på sammensætningen og metaboliske funktioner i tarm mikrobiota forbliver stort set undvigende. Desuden er undersøgelse og validering af disse virkninger in vivo vanskelig, især fordi de fleste af de næringsstoffer og metabolitter, der produceres af tarmen mikrobiota absorberes eller bortskaffes samtidigt og hurtigt i tarmen; Derfor er det stadig en praktisk udfordring at måle produktionen, mængden og forarbejdningen af disse metabolitter (f. eks. SCFAs) in vivo. Fysiologiske modeller såsom dyr og mennesker er afgørende for at bestemme rollen for Gut-mikrobiom og dets graduering på værts sundheden, men disse kan ikke være egnede til storstilet screening af forskellige typer af mikrobiome modulatorer på grund af etiske, monetære eller tidsmæssige begrænsninger. Med henblik herpå kan in vitro-og/eller ex vivo-modeller, såsom dyrkning af Gut mikrobiota in vitro og derefter intervenere med forskellige mikrobiota-modulatorer, tilbyde tids-og pengebesparende muligheder og kan derfor give mulighed for foreløbig eller storstilet screening af forskellige komponenter (såsom probiotika, prebiotics, og andre interventionelle forbindelser) til at undersøge/forudsige deres virkninger på fækal mikrobiota mangfoldighed, sammensætning og metaboliske profiler. Undersøgelser, der anvender sådanne in vitro-og ex vivo-systemer i tarm mikrobielle stoffer, kan fremme en yderligere forståelse af værts-mikrobiom-interaktioner, som bidrager til at være vært for sundhed og sygdom, og kan også føre til at finde nye terapier, der er målrettet mod mikrobiomet, til forbedre Host sundhed og forebygge og behandle forskellige sygdomme1.
Selv om in vitro Gut mikrobiota kultur systemer ikke rigtig kan replikere de faktiske tarm betingelser, har flere laboratorier bestræbt sig på at udvikle sådanne modeller, hvoraf nogle er blevet fundet praktisk gennemførligt til en vis grad og er blevet anvendt med succes til forskellige formål. En af de seneste Gut modeller er simulatoren af den menneskelige tarm mikrobielle økosystem, som efterligner hele menneskelige mave-tarmkanalen, herunder maven, tyndtarmen, og forskellige regioner i tyktarmen. Men sådanne teknisk komplekse modeller er muligvis ikke tilgængelige for andre forskningsfaciliteter på verdensplan. Der er derfor stadig et kritisk behov for udvikling af nye alternative modeller, der er relativt enkle, overkommelige og praktiske for laboratorier, som studerer mikrobiome modulatorer og deres virkninger på tarm mikrobiota og værts sundhed. Derfor ville brugen af et in vitro (eller ex vivo) fækale mikrobiota-kultur system være nyttigt til at studere virkningerne af sådanne interventioner11,12. Specifikt, virkningen af forskellige prebiotics på mikrobiota fermenterings kapacitet i form af periodiske ændringer i tarm mikrobiota mangfoldighed og sammensætning, fækal pH, og niveauerne af mikrobielle metabolitter, herunder SCFAs og lactat kan undersøgt 13. heri, ved hjælp af inulin (en af de mest udbredte undersøgt prebiotiske komponenter) som et eksempel på mikrobiome modulator, en trin-for-trin protokol af denne simple ex vivo mikrobiota batch-kultur system er beskrevet for at demonstrere dets anvendelse til at anslå ændringer i fækale mikrobiota og mikrobielle metabolitter efter intervention med mikrobiome modulatorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 </td>
			<td>TGI</td>
			<td>C2388</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2063450000</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-&#945;-methylbutyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W271918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovalerate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A18642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2&#8226;4H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin (Nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14366</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-valerate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-aminobenzoic acid</td>
			<td>MP China</td>
			<td>102569</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid (H3PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>206375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>148991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure magnetic purification beads</td>
			<td>Agencourt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber with incubatore</td>
			<td>Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina MiSeq sequencer</td>
			<td>Miseq reagent kit v3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PowerFecal kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit-3 fluorimeter</td>
			<td>InVitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters-2695 Alliance HPLC system</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota

Den nye rolle, som tarm mikrobiomet spiller i flere menneskelige sygdomme, kræver et gennembrud af nye værktøjer, teknikker og teknologier. Sådanne forbedringer er nødvendige for at dechifrere udnyttelsen af mikrobiome modulatorer til gavn for menneskers sundhed. Men den omfattende screening og optimering af modulatorer til validering af mikrobiome modulation og forudsige relaterede sundhedsmæssige fordele kan være praktisk vanskeligt på grund af behovet for et stort antal dyr og/eller menneskelige. Med henblik herpå kan in vitro-eller ex vivo-modeller lette den foreløbige screening af mikrobiome modulatorer. Heri, det er optimeret og demonstreret en ex vivo fækal mikrobiota kultur system, der kan anvendes til at undersøge virkningerne af forskellige interventioner af Gut mikrobiome modulatorer herunder probiotika, prebiotics og andre fødevareingredienser, bortset fra nutraceuticals og narkotika, om mangfoldigheden og sammensætningen af den humane tarm mikrobiota. Inulin, en af de mest udbredte undersøgte prebiotiske forbindelser og mikrobiome modulatorer, bruges som et eksempel her for at undersøge dens virkning på den sunde fækale mikrobiota sammensætning og dens metaboliske aktiviteter, såsom fækal pH og fækale niveauer af organiske syrer herunder laktat og kortkædede fedtsyrer (SCFAs). Protokollen kan være nyttig for undersøgelser, der har til formål at anslå virkningerne af forskellige interventioner af modulatorer på fækale mikrobiota profiler og at forudsige deres sundhedsmæssige konsekvenser.

Protokollen anvendes til at påvise virkningen af en specifik prebiotiske (dvs. inulin på mikrobiota sammensætning og metaboliske aktiviteter i form af ændringer i fækal ph og koncentrationen af lactat og scfas i afføring af raske humane personer over forskellige tidspunkter efter behandling med inulin). Fækal pH, fækale niveauer af lactat og SCFAs (figur 1), og mikrobiota sammensætning (figur 2 og fi...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Denne protokol beskriver en in vitro batch-kultur fermenterings system af humant fækal mikrobiota, ved hjælp af inulin (en velkendt prebiotiske og en af de mest udbredte studerede mikrobiota modulatorer) at demonstrere brugen af dette system til at anslå virkningerne af specifikke interventioner på fækal mikrobiota sammensætning og metaboliske aktiviteter.

En in vitro-batch-kultur model til at estimere virkningerne af interventionelle regimer på human fecal microbiota

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

I betragtning af den nye rolle tarm mikrobiom i forskellige menneskelige sygdomme, flere gut mikrobiom modulatorer som probiotika, prebiotics, kost og narkotika kan hjælpe med at forbedre gut mikrobiom-associerede sundhedsmæssige lidelser. Men ingen hurtig og overkommelig screening system er tilgængelige til at forudsige virkningerne af sådanne gut mikrobiom modulatorer, men dette system er simpelt nok til at forudsige, hvordan særlige interventioner kan påvirke tarm mikrobiom, der i sidste ende kan påvirke værten sundhed. Denne protokol er enkel, overkommelig og praktisk for laboratorier, der undersøger tarmmikrobiusmodulatorerne og deres virkninger på mikrobiota og værtssundhed.Vedligeholdelse af aseptiske og anaerobe forhold er afgørende for dette eksperiment. Også fækal prøven skal anvendes på ny, umiddelbart efter indsamling. Ellers skal prøven opbevares på minus 80 umiddelbart efter indsamlingen, hvis forsøget planlægges senere, uden at den er udsat for omgivende temperatur og luft.Håndtering nøjagtighed under aliquot prepping og pipettering er også vigtigt for at opretholde nøjagtighed og reproducerbarhed. Det vil tage mindre end 12 timer i dagtimerne. Vi kan bygge en kultur fra den ene dag til den anden, hvis de har brug for prøverne om 24 timer.Derefter, efterfulgt af den korte kæde fedtsyrer og mikrobiom bestemmelse. Denne proces vil blive demonstreret af to store uni studerende, Shokouh Ahmadi og Rabina Mainali fra mit laboratorium. For at forberede fermenteringsmedier under en røghætte, i en reagensflaske på magnetblanding, bland opløsning A, opløsning B, spormineralopløsning, vandopløselig vitaminopløsning, folatbiotinopløsning, riboflavinopløsning, heminopløsning, kortkædet fedtsyreblanding og resazurin.Derefter tilsættes i flasken gær ekstrakt, natriumcarbonat, cystein hydrochlorid monohydrat, og trypticase. Der tilsættes 296,1 milliliter destilleret vand, og pH-chloren justeres med én normal hydrochlorid eller natriumhydroxid for at sikre, at den er omkring 7,0. Overfør bægeret til en aseptisk arbejdsstation, og brug et vakuumfilter med porestørrelse på 0,22 mikrometer til at filtrere mediet til sterilisering.For at forberede en liter anaerob fortyndingsopløsning, opløse fem gram natriumchlorid, to gram glukose, og 0,3 gram cystein hydrochlorid monohydrat i det ioniserede vand. Autoklave reagens flasken med hætte ved 121,1 grader Celsius i 15 minutter, og gemme det inde i anaerobe kammer. Før gæringsforsøget påbegyndes, skal alle de materialer, opløsninger og værktøjer, der er nødvendige for gæringsforsøget, opbevares inde i det anaerobe kammer i mindst 48 timer for at sikre, at eventuel restilning fjernes.Mindst 24 timer før gæringsforsøget vejes 300 mg inulin og overføres til et 50 milliliterrør, som derefter placeres inde i det anaerobe kammer. Tilsæt 26 milliliter steriliseret fermenteringsmedie i røret, og vortex til at blande. Tillad hydrering af fiber i ca 24 timer.Dagen for gæringsforsøget, forberede fækal inoculum. Først vejes fem gram frisk fækal prøve i en 50 milliliter konisk rør. Der tilsættes anaerob fortyndingsopløsning til røret for at nå et endeligt volumen på 50 milliliter.Vortex i 15 minutter, eller indtil helt homogeniseret. Hold de podede rør ved 37 grader Celsius inde i anaerobe kammer, og invertere forsigtigt en gang hver time for at resuspending fibrene og inokulum. Efter tre, seks, ni eller 24 timer, tage den rette mængde gærede medier, og centrifuge prøverne ved 14, 000 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Straks fryse supernatant og pellet i flydende nitrogen, derefter efter snap frysning, gemme supernatant for kortkædede fedtsyrer analyse, og pellet til mikrobiom analyse, på minus 80 grader Celsius. Denne protokol bruges til at demonstrere effekten af en specifik prebiotisk. Afføring af raske mennesker, efter behandling med inulin, viste relativt stabil pH i ni timer, mens faldt dramatisk efter 24 timer.Inokulering af inulin signifikant øget niveauet af kortkædede fedtsyrer og laktat i inulin-behandlet fækal prøve sammenlignes med ikke-behandlet fækal mikrobiota kultur. Hovedkoordinatanalyse viser forskellige mikrobiotasammensætninger end de vægtede og uvægtede UniFrac-målinger af betamangfoldighed mellem inulinbehandlede og ubehandlede prøver. Indekser for alfa mangfoldighed versus fylogenetisk mangfoldighed gennem PD hele træet, arter rigdom, operationelle taksonomiske enheder, arter jævnhed, samt relativ overflod af større phyla og slægter, alle præsentere forskellige gut mikrobiota signaturer mellem inulin behandlet og ubehandlede prøver.Taksonomisk klædte, der er afledt af lineær diskriminant effektstørrelsesanalyse af 16S-sekvenser, repræsenterer det differentierede rigelige taxa mellem forskellige grupper af prøver. Følg alle trinnene nøje. Vigtigst er at opretholde strenge aseptiske og anaerobe betingelser.Supernatanten og fra eksperimentet kan bruges til behandling af kortkædede fedtsyrer niveau ændringer som følge af gæring baseret på fibre. Derudover kan i pellet bruges til at analysere ændringerne i tarm mikrobiom sammensætning. Nogle kemikalier, der anvendes til at gøre kulturmedierne, er potentielt farlige.Venligst MSDS ark og tage forholdsregler i overensstemmelse hermed.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til Studieinformationen Heterogeneity for Human Makrofag Differentiering og polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersøge effekterne af probiotika på Pneumokok Colonization Brug af en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adhærenceprøven

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til måling immunresponser på malaria i forbindelse med hiv co-infektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af blodhjernebarrieren Brug Impedans Spektroskopi: En Fokus på T-celle-endotel Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere virkningerne af sputum på Biofilm Development Ved hjælp af en Chambered dækglas Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af humant blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspression og oprensning af mennesket<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Vurdering af den cytotoksiske og immunmodulerende virkninger af stoffer i menneskelige præcision-cut lunge skiver

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Virkningerne af smag signalerer Protein afskaffelse på Gut betændelse i en inflammatorisk tarm sygdom musen Model

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...