Name: an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota
Uploaded: 2019-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

De auteurs geven dankbaar steun aan de financiering van het centrum voor diabetes, obesitas en metabolisme en het klinisch en translationeel wetenschapscentrum, de Wake Forest School of Medicine, het ministerie van defensie financiering (subsidie nummer: W81XWH-18-1-0118), de Kermit Glenn Phillips II stoel in cardiovasculaire geneeskunde; de National Institutes of Health gefinancierd Claude D. Pepper oudere Amerikanen Center (gefinancierd door P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 en het klinisch en translationeel wetenschapscentrum (Clinical Research Unit, gefinancierd door UL1TR001420), wordt ook gelukkig erkend. We bedanken ook de vrijwilligers voor het verstrekken van fecale monsters, en onze andere Lab leden voor hun technische helpt tijdens dit experiment.

Let op: Raadpleeg de juiste veiligheidsinformatiebladen en volg de instructies en richtlijnen voor de juiste training voor Biosafety level 2 (BSL-2). Volg alle kweek stappen volgens de standaard bioveiligheidsregels en gebruik een BSL-2 kast met aseptische condities. Bovendien kunnen fecale monsters van verschillende modellen en menselijke proefpersonen potentieel risico lopen om microbiële overgedragen ziekten te verspreiden. Onmiddellijk medische hulp inroepen bij het optreden van een verwonding en infectie. Bovendien...

<ol>
	<li>Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiome+in+health+and+in+disease.">The gut microbiome in health and in disease.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).</li><li>Xu, Z., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+effects+on+human+gut+microbiome+diversity.">Dietary effects on human gut microbiome diversity.</a> British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).</li><li>Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+and+Alzheimer&#8217;s+disease.">The gut microbiota and Alzheimer&#8217;s disease.</a> Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).</li><li>Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+gut+microbiota+on+human+health:+an+integrative+view.">The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view.</a> The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).</li><li>Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+mediated+modulation+of+gut+flora+might+be+biotherapeutical+approach+obesity+and+type+2+diabetes.">Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes.</a> Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).</li><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+Polysaccharides+in+the+Amelioration+of+Gut+Microbiome+Dysbiosis+and+Metabolic+Diseases.">Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases.</a> Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-Linked+Gut+Microbiome+Dysbiosis+Associated+with+Derangements+in+Gut+Permeability+and+Intestinal+Cellular+Homeostasis+Independent+of+Diet.">Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet.</a> Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).</li><li>Paul, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+diet+and+the+gut+microbiome+on+epigenetic+modulation+in+cancer+and+other+diseases.">Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases.</a> Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).</li><li>O&#8217;mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+tryptophan+metabolism+and+the+brain-gut-microbiome+axis.">Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis.</a> Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).</li><li>Sharon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+metabolites+from+the+microbiome+in+health+and+disease.">Specialized metabolites from the microbiome in health and disease.</a> Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).</li><li>Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+digestion+and+fermentation+characteristics+of+temulose+molasses,+a+coproduct+of+fiberboard+production,+and+select+temulose+fractions+using+canine+fecal+inoculum.">In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum.</a> Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).</li><li>Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetable+fiber+fermentation+by+human+fecal+bacteria:+cell+wall+polysaccharide+disappearance+and+short-chain+fatty+acid+production+during+in+vitro+fermentation+and+water-holding+capacity+of+unfermented+residues.">Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues.</a> Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-origin+probiotic+cocktail+increases+short-chain+fatty+acid+production+via+modulation+of+mice+and+human+gut+microbiome.">Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+microbiome+signatures+and+short-chain+fatty+acids+in+mouse,+rat,+non-human+primate+and+human+feces.">Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).</li><li>Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced+decreases+in+the+levels+of+microbial-derived+short-chain+fatty+acids+promote+gastrointestinal+colonization+of+Candida+albicans.">Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans.</a> bioRxiv. , 428474 (2018).</li><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prebiotics+from+acorn+and+sago+prevent+high-fat+diet-induced+insulin+resistance+via+microbiome-gut-brain+axis+modulation.">Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+Microbiome+Composition+in+Non-human+Primates+Consuming+a+Western+or+Mediterranean+Diet.">Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Garcia-Villalba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+method+for+gas+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+short-chain+fatty+acids+in+faecal+samples.">Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples.</a> Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+vs+Fresh+Fecal+Microbiota+Transplantation+and+Clinical+Resolution+of+Diarrhea+in+Patients+With+Recurrent+Clostridium+difficile+Infection:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).</li><li>Chen, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+xylooligosaccharides+produced+from+Miscanthus&#215;+giganteus+by+human+fecal+microbiota.">In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus&#215; giganteus by human fecal microbiota.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).</li><li>Cook, S., Sellin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">Short chain fatty acids in health and disease.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).</li><li>Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbes+and+health:+a+focus+on+the+mechanisms+linking+microbes,+obesity,+and+related+disorders.">Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders.</a> Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-mediated+nourishment+of+gut+microbiota+protects+against+diet-induced+obesity+by+restoring+IL-22-mediated+colonic+health.">Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).</li><li>Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut&#8211;brain+axis+in+2016:+Brain&#8211;gut&#8211;microbiota+axis&#8212;mood,+metabolism+and+behaviour.">Gut&#8211;brain axis in 2016: Brain&#8211;gut&#8211;microbiota axis&#8212;mood, metabolism and behaviour.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 69 (2017).</li></ol>

De in vitro fecale slurry fermentatie model hier gepresenteerd is een eenvoudige single-batch model om de effecten van verschillende substraten en microbiële stammen (bijvoorbeeld prebiotica en probiotica) op de samenstelling van menselijke fecale microbiota evenals haar metabole activiteiten in termen van fecale pH en SCFAs niveaus. De hierin gepresenteerde resultaten tonen aan dat de inoculatie van inuline de fecale pH vermindert en de niveaus van SCFAs en lactaat in inuline behandelde fecale specimen aanzienlijk verh...

De humane microbiota is een complexe Gemeenschap bestaande uit bacteriën, Archaea, virussen en eukaryotische microben1, die het menselijk lichaam zowel intern als extern bewonen. Recente bewijzen hebben de fundamentele rol van de darm microbiota en het darm-microbiome (de gehele verzameling van microben en hun genen gevonden in het menselijk maagdarmkanaal) vastgesteld in verschillende menselijke ziekten, waaronder obesitas, diabetes, hart-en vaatziekten, en kanker1,2,3. Bovendien produceren de micro-organismen die in onze darmen leven een breed spectrum van metabolieten die een aanzienlijke invloed hebben op onze gezondheid en kunnen ook bijdragen aan de pathofysiologie van verschillende ziekten, evenals een verscheidenheid aan metabole functies4, 5. abnormale veranderingen (verstoringen) in de samenstelling en functie van deze darm microbiële populatie worden over het algemeen aangeduid als "gut dysbiosis". Dysbiosis wordt meestal geassocieerd met een ongezonde toestand van de gastheer en kan dus worden onderscheiden van de normale (homeostatische) microbiële Gemeenschap die is gekoppeld aan een gezonde controle staat van de gastheer. Specifieke patronen van gut microbiome dysbiosis worden vaak gevonden in verschillende ziekten1,2,3,6,7.
De fermentatie van onverteerd voedsel, in het bijzonder de fermenteerbare koolhydraten/vezels, door de darm microbiota levert niet alleen energie op, maar produceert ook afwijkende metabolieten, waaronder korte-keten vetzuren (SCFAs), lactaat, formaat, koolstofdioxide, methaan, waterstof en ethanol6. Bovendien, de darm microbiota produceert ook een aantal andere bioactieve stoffen zoals folaat, biotine, trimethylamine-N-oxide, serotonine, tryptofaan, Gamma-aminoboterzuur, dopamine, noradrenaline, acetylcholine, histamine, deoxycholzuur en 4-ethylfenylsulfaat. Dit gebeurt voornamelijk door het gebruik van intrinsieke metabole fluxen binnen de host-microbe niche, die bijdraagt aan verschillende lichaamsprocessen, metabole functies en epigenetische veranderingen1,8,9, 10. De effecten van verschillende interventies op dergelijke microbiële producten blijven echter onkown of onduidelijk vanwege het ontbreken van eenvoudige, efficiënte en reproduceerbare protocollen. De humane gut microbiota samenstelling is een extreem complex en divers ecosysteem, en daarom blijven veel vragen over haar rol in de menselijke gezondheid en ziekte pathologie nog steeds onbeantwoord. De effecten van vele gemeenschappelijke gut microbiome modulatoren (bv., probiotica, prebiotica, antibiotica, fecale transplantatie en infecties) op de samenstelling en metabole functies van de intestinale microbiota blijven grotendeels ongrijpbaar. Bovendien is het onderzoek en de validering van deze effecten in vivo moeilijk, vooral omdat de meeste nutriënten en metabolieten die door de darm microbiota worden geproduceerd, gelijktijdig en snel in de darmen worden geabsorbeerd of afgevoerd; Daarom blijft het meten van de productie, de hoeveelheid en de verwerking van deze metabolieten (bijv. SCFAs) in vivo nog steeds een praktische uitdaging. Inderdaad, fysiologische modellen zoals dieren en menselijke proefpersonen zijn van cruciaal belang voor het bepalen van de rol van gut microbiome en de modulatie ervan op gastheer gezondheid, maar deze mogelijk niet geschikt voor grootschalige screening van verschillende soorten microbiome modulatoren als gevolg van ethische, monetaire of tijdsbeperkingen. Hiertoe kunnen in vitro en/of ex vivo-modellen, zoals het kweken van gut microbiota in vitro en vervolgens interveniëren met verschillende microbiota-modulatoren, tijd-en geldbesparings mogelijkheden bieden en kunnen daarom voorlopige of grootschalige screening van verschillende componenten (zoals probiotica, prebiotica, en andere Interventionele verbindingen) om te onderzoeken/voorspellen hun effecten op de fecale microbiota diversiteit, samenstelling en metabole profielen. Studies met behulp van dergelijke in vitro en ex vivo systemen van het microbioom van de darmen kunnen meer inzicht in de interacties van gastheer-microbiome die bijdragen tot gastheer gezondheid en ziekte te vergemakkelijken, en kan ook leiden tot het vinden van nieuwe therapieën die gericht zijn op de microbiome te verbetering van de gezondheid van de gastheer en voorkomen en behandelen van verschillende ziekten1.
Hoewel de in vitro gut microbiota cultuur systemen niet echt de werkelijke intestinale omstandigheden kunnen repliceren, hebben verschillende laboratoria getracht dergelijke modellen te ontwikkelen, waarvan sommige tot op zekere hoogte uitvoerbaar zijn bevonden en met succes zijn gebruikt voor verschillende doeleinden. Een van de recente gut modellen is de Simulator van de menselijke intestinale microbiële ecosysteem, die het hele menselijke maagdarmkanaal nabootst, met inbegrip van de maag, dunne darm, en verschillende gebieden van de dikke darm. Dergelijke technisch complexe modellen zijn echter mogelijk niet toegankelijk voor andere onderzoeksfaciliteiten wereldwijd. Daarom is er nog steeds een kritische behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe alternatieve modellen die relatief eenvoudig, betaalbaar en praktisch zijn voor laboratoria die de microbiome modulatoren bestuderen en hun effecten op gut microbiota en host Health. Daarom zou het gebruik van een in vitro (of ex vivo) fecaal microbiota-cultuur systeem nuttig zijn voor het bestuderen van de effecten van dergelijke interventies11,12. Specifiek, het effect van verschillende prebiotica op de microbiota fermentatie capaciteit in termen van periodieke veranderingen in de darm microbiota diversiteit en samenstelling, de fecale pH, en de niveaus van microbiële metabolieten, met inbegrip van SCFAs en lactaat kan worden bestudeerd 13. hierin wordt, met behulp van inuline (een van de meest bestudeerde prebiotische componenten) als voorbeeld van de microbiome modulator, een stapsgewijs Protocol van dit eenvoudige ex vivo microbiota batch-cultuur systeem beschreven om het gebruik ervan aan te tonen om de veranderingen in de fecale microbiota en microbiële metabolieten na interventie met de microbiome modulatoren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 </td>
			<td>TGI</td>
			<td>C2388</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2063450000</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-&#945;-methylbutyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W271918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovalerate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A18642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2&#8226;4H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin (Nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14366</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-valerate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-aminobenzoic acid</td>
			<td>MP China</td>
			<td>102569</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid (H3PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>206375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>148991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure magnetic purification beads</td>
			<td>Agencourt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber with incubatore</td>
			<td>Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina MiSeq sequencer</td>
			<td>Miseq reagent kit v3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PowerFecal kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit-3 fluorimeter</td>
			<td>InVitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters-2695 Alliance HPLC system</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota

De opkomende rol van het microbioom van de darmen bij verschillende menselijke ziekten vereist een doorbraak van nieuwe instrumenten, technieken en technologieën. Dergelijke verbeteringen zijn nodig om te ontcijferen van het gebruik van microbiome modulatoren voor voordelen voor de menselijke gezondheid. Echter, de grootschalige screening en optimalisatie van modulatoren om te valideren microbiome modulatie en voorspel gerelateerde gezondheidsvoordelen kunnen praktisch moeilijk zijn als gevolg van de noodzaak voor een groot aantal dieren en/of menselijke proefpersonen. Hiertoe kunnen in vitro-of ex vivo-modellen een voorafgaande screening van microbiome-modulatoren vergemakkelijken. Hierin, het is geoptimaliseerd en aangetoond een ex vivo fecale microbiota cultuur systeem dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van verschillende interventies van gut microbiome modulatoren met inbegrip van probiotica, prebiotica en andere voedselingrediënten, afgezien van nutraceuticals en drugs, over de diversiteit en samenstelling van de menselijke gut microbiota. Inuline, een van de meest bestudeerde prebiotische verbindingen en microbiome modulatoren, wordt gebruikt als een voorbeeld hier te onderzoeken van het effect ervan op de gezonde fecale microbiota samenstelling en de metabole activiteiten, zoals fecale pH en de fecale niveaus van organische zuren met inbegrip van lactaat en korte-keten vetzuren (SCFAs). Het protocol kan nuttig zijn voor studies die gericht zijn op het inschatten van de effecten van verschillende interventies van modulatoren op fecale microbiota-profielen en op het voorspellen van hun gevolgen voor de gezondheid.

Het protocol wordt gebruikt om het effect van een specifiek prebioticum (d.w.z. inuline op de microbiota-samenstelling en metabolische activiteiten in termen van veranderingen in de fecale pH en de concentratie van lactaat en SCFAs in de uitwerpselen van gezonde menselijke proefpersonen over verschillende tijdspunten na behandeling met inuline). De fecale pH, de fecale niveaus van lactaat en SCFAs (Figuur 1) en de microbiota-samenstelling (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Dit protocol beschrijft een in vitro batch cultuur fermentatiesysteem van menselijke fecale microbiota, met behulp van inuline (een bekende prebiotisch en een van de meest bestudeerde microbiota modulatoren) om het gebruik van dit systeem te demonstreren bij het inschatten van de effecten van specifieke interventies op fecale microbiota samenstelling en metabole activiteiten.

Een in vitro batch cultuur model om de effecten van Interventionele regimes op menselijke fecale microbiota te schatten

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Gezien de opkomende rol van darmmicrobioom in verschillende menselijke ziekten, verschillende darmmicrobioom modulators zoals probiotica, prebiotica, diëten en drugs kunnen helpen bij het verbeteren van darmmicrobioom-geassocieerde gezondheidsaandoeningen. Er is echter geen snel en betaalbaar screeningsysteem beschikbaar om de effecten van dergelijke darmmicrobioommodulatoren te voorspellen, maar dit systeem is eenvoudig genoeg om te voorspellen hoe bepaalde interventies van invloed kunnen zijn op darmmicrobioom dat uiteindelijk de gezondheid van de gastheer kan beïnvloeden. Dit protocol is eenvoudig, betaalbaar en praktisch voor laboratoria die de darmmicrobioommodulatoren onderzoeken en hun effecten op microbiota en de gezondheid van de gastheer.Onderhoud van aseptische en anaërobe omstandigheden is cruciaal voor dit experiment. Ook het fecale monster moet opnieuw worden gebruikt, onmiddellijk na het verzamelen. Anders, als het experiment later wordt gepland, moet het monster onmiddellijk na het verzamelen bij min 80 worden opgeslagen, zonder blootstelling aan omgevingstemperatuur en lucht.Handling nauwkeurigheid tijdens aliquot prepping en pipetting is ook belangrijk voor het behoud van nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. Het duurt minder dan 12 uur overdag. We kunnen 's nachts een cultuur opbouwen als ze de monsters binnen 24 uur nodig hebben.Daarna volgen de korte-keten vetzuren en de bepaling van het microbioom. Dit proces zal worden aangetoond door twee grote uni studenten, Shokouh Ahmadi en Rabina Mainali uit mijn lab. Om fermentatiemedia onder een rookkap voor te bereiden, in een reagensfles op magneetmengsel, meng oplossing A, oplossing B, spoorminerale oplossing, in water oplosbare vitamineoplossing, foliumzuurbiotineoplossing, riboflavineoplossing, hemineoplossing, korte keten vetzuurmix en rezursain.Voeg vervolgens in de fles gisextract, natriumcarbonaat, cysteïne hydrochloride monohydraat, en trypticase. Voeg 296,1 milliliter gedestilleerd water toe, pas de pH aan met een normale hydrochloride of natriumhydroxide om er zeker van te zijn dat deze rond 7,0 ligt. Breng het bekerglas naar een aseptisch werkstation en gebruik een vacuümfilter met poriegrootte op 0,22 micrometer om de media te steriliseren.Om een liter anaerobe verdunningsoplossing voor te bereiden, los je vijf gram natriumchloride, twee gram glucose en 0,3 gram cysteïnehydrochloridemonohydraat in het geïoniseerde water op. Autoclave de reagens fles met dop op 121,1 graden Celsius gedurende 15 minuten, en bewaar het in de anaerobe kamer. Bewaar voor het begin van het fermentatie-experiment alle materialen, oplossingen en gereedschappen die nodig zijn voor het fermentatie-experiment minstens 48 uur in de anaerobe kamer, om ervoor te zorgen dat eventuele residuestof wordt verwijderd.Ten minste 24 uur voor het fermentatie-experiment weegt u 300 milligram inuline en breng deze over op een buis van 50 milliliter, die vervolgens in de anaerobe kamer wordt geplaatst. Voeg 26 milliliter gesteriliseerde fermentatiemedia toe aan de buis en vortex om te mengen. Laat hydratatie van vezels voor ongeveer 24 uur.De dag van het fermentatie-experiment, bereid fecale entmateriaal. Weeg eerst vijf gram vers fecale monster in een conische buis van 50 milliliter. Voeg anaerobe verdunningsoplossing toe aan de buis om een eindvolume van 50 milliliter te bereiken.Vortex gedurende 15 minuten, of tot volledig gehomogeniseerd. Houd de ingeënte buizen op 37 graden Celsius in de anaerobe kamer, en om te keren zachtjes een keer per uur om de vezels en enentmateriaal resuspend. Na drie, zes, negen of 24 uur, neem de juiste hoeveelheid gefermenteerde media, en centrifugeren de monsters op 14,000 keer g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.Bevries onmiddellijk de supernatant en pellet in vloeibare stikstof, dan na snap bevriezing, bewaar de supernatant voor korte keten vetzuren analyse, en pellet voor microbioom analyse, op min 80 graden Celsius. Dit protocol wordt gebruikt om het effect van een specifiek prebioticum aan te tonen. De ontlasting van gezonde menselijke proefpersonen, na behandeling met inuline, vertoonde negen uur lang een relatief stabiele pH, terwijl ze na 24 uur dramatisch daalden.De inenting van inuline aanzienlijk verhoogd de niveaus van korte-keten vetzuren en lactaat in inuline behandeld fecale specimen wordt vergeleken met niet-behandelde fecale microbiota cultuur. De belangrijkste coördinatenanalyse toont verschillende microbiotasamenstelling aan de gewogen en ongewogen UniFrac-metingen van bètadiversiteit tussen inulinebehandelde en onbehandelde monsters. Indexen van alfadiversiteit versus fylogenetische diversiteit door PD hele boom, soorten rijkdom, operationele taxonomische eenheden, soorten gelijkmatigheid, evenals relatieve overvloed van grote phyla en geslachten, alle aanwezig verschillende gut microbiota handtekeningen tussen inuline behandelde en onbehandelde monsters.Taxonomisch cladogram, afgeleid van lineaire discriminante effectgrootteanalyse van 16S-sequenties, vertegenwoordigt de differentiaal overvloedige taxa tussen verschillende groepen monsters. Volg alle stappen zorgvuldig. Het belangrijkste is om strikte aseptische en anaërobe voorwaarden te handhaven.De supernatant en van het experiment kan worden gebruikt voor de behandeling van korte-keten vetzuren niveau veranderingen als gevolg van de fermentatie op basis van vezels. Bovendien kan de in de pellet worden gebruikt voor het analyseren van de veranderingen in de samenstelling van het darmmicrobioom. Sommige chemische stoffen die worden gebruikt voor het maken van de cultuur media zijn potentieel gevaarlijk.Gelieve het MSDS-blad en neem dienovereenkomstig voorzorgsmaatregelen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Onderzoek naar de effecten van probiotica op Pneumococcal Kolonisatie Met behulp van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Hechting Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model voor het meten van immuunrespons op Malaria in de context van HIV Co-infectie

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpressie en zuivering van het menselijk<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Beoordeling van de cytotoxische en immunomodulerende effecten van stoffen in menselijke precisie-cut Lung plakjes

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Effecten van smaak signalering eiwitten afschaffing op ontsteking van de darm in een muismodel van Inflammatory Bowel Disease

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...