Name: an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota
Uploaded: 2019-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

Les auteurs remercient le soutien financier du Center for Diabetes, Obesity and Metabolism et du Clinical and Translational Science Center, de la Wake Forest School of Medicine, du financement du ministère de la Défense (numéro de subvention : W81XWH-18-1-0118), la Chaire Kermit Glenn Phillips II en médecine cardiovasculaire; les National Institutes of Health ont financé le Claude D. Pepper Older Americans Center (financé par P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 et le Clinical and Translational Science Center (Clinical Research Unit, financé par UL1TR001420), sont également reconnus avec reconnaissance. Nous remercions également les bénévoles d'avoir fourni des échantillons de matières fécales, ainsi que nos autres membres du laboratoire pour leur aide technique au cours de cette expérience.

CAUTION : Consultez les fiches de données sur la sécurité des matériaux appropriées et suivez les instructions et les lignes directrices pour la formation appropriée de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Suivez toutes les étapes de culture selon les règles de biosécurité standard et utilisez un coffret BSL-2 en utilisant des conditions aseptiques. En outre, les échantillons fécaux de différents modèles et sujets humains peuvent avoir un risque potentiel de propagation de maladies microbiennes. Demandez imm?...

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	<li>Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiome+in+health+and+in+disease.">The gut microbiome in health and in disease.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).</li><li>Xu, Z., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+effects+on+human+gut+microbiome+diversity.">Dietary effects on human gut microbiome diversity.</a> British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).</li><li>Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+and+Alzheimer&#8217;s+disease.">The gut microbiota and Alzheimer&#8217;s disease.</a> Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).</li><li>Clemente, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Garcia-Villalba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+method+for+gas+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+short-chain+fatty+acids+in+faecal+samples.">Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples.</a> Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+vs+Fresh+Fecal+Microbiota+Transplantation+and+Clinical+Resolution+of+Diarrhea+in+Patients+With+Recurrent+Clostridium+difficile+Infection:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).</li><li>Chen, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+xylooligosaccharides+produced+from+Miscanthus&#215;+giganteus+by+human+fecal+microbiota.">In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus&#215; giganteus by human fecal microbiota.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).</li><li>Cook, S., Sellin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">Short chain fatty acids in health and disease.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).</li><li>Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbes+and+health:+a+focus+on+the+mechanisms+linking+microbes,+obesity,+and+related+disorders.">Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders.</a> Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-mediated+nourishment+of+gut+microbiota+protects+against+diet-induced+obesity+by+restoring+IL-22-mediated+colonic+health.">Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).</li><li>Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut&#8211;brain+axis+in+2016:+Brain&#8211;gut&#8211;microbiota+axis&#8212;mood,+metabolism+and+behaviour.">Gut&#8211;brain axis in 2016: Brain&#8211;gut&#8211;microbiota axis&#8212;mood, metabolism and behaviour.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 69 (2017).</li></ol>

Le modèle in vitro de fermentation de lisier fécal présenté ici est un modèle simple à un seul lot pour approximer les effets de différents substrats et souches microbiennes (par exemple, prébiotiques et probiotiques) sur la composition du microbiote fécal humain ainsi que son les activités métaboliques en termes de pH fécal et de niveaux de SCFA. Les résultats présentés ici démontrent que l'inoculation de l'inuline diminue le pH fécal et augmente de manière significative les niveaux de SCFA et de lacta...

Le microbiote humain est une communauté complexe composée de bactéries, d'archées, de virus et de microbes eucaryotes1, qui habitent le corps humain à l'intérieur et à l'extérieur. Des preuves récentes ont établi le rôle fondamental du microbiote intestinal et du microbiome intestinal (toute la collection de microbes et de leurs gènes présents dans le tractus gastro-intestinal humain) dans diverses maladies humaines, y compris l'obésité, le diabète, maladies cardiovasculaires, et le cancer1,2,3. En outre, les micro-organismes vivant dans notre intestin produisent un large spectre de métabolites qui affectent de manière significative notre santé et peuvent également contribuer à la physiopathologie de plusieurs maladies aussi bien qu'à une variété de fonctions métaboliques4, 5. Les changements anormaux (perturbations) dans la composition et la fonction de cette population microbienne intestinale sont généralement appelés « dysbiose intestinale ». La dysbiose est habituellement associée à un état malsain de l'hôte et peut donc être différenciée de la communauté microbienne normale (homéostatique) associée à un état de contrôle sain de l'hôte. Des modèles spécifiques de dysbiose de microbiome intestinal sont souvent trouvés dans diverses maladies différentes1,2,3,6,7.
La fermentation d'aliments non digérés, en particulier les glucides fermentables/fibres, par le microbiote intestinal non seulement produit de l'énergie, mais produit également des métabolites divergents, y compris les acides gras à chaîne courte (SCFA), lactate, formate, dioxyde de carbone, méthane, hydrogène et éthanol6. En outre, le microbiote intestinal produit également un certain nombre d'autres substances bioactivestelles que le folate, la biotine, la triméthylamine- N-oxyde, la sérotonine, le tryptophane, l'acide gamma-aminobutyrique, la dopamine, la noradrénaline, l'acétylcholine, l'histamine, acide désoxycholique, et sulfate de 4-éthylphényl. Cela se produit principalement par l'utilisation de flux métaboliques intrinsèques dans la niche hôte-microbe, qui contribue à plusieurs processus du corps, fonctions métaboliques et changements épigénétiques1,8,9, 10. Cependant, les effets de diverses interventions sur ces produits microbiens restent inconnus ou peu clairs en raison de l'absence de protocoles faciles, efficaces et reproductibles. La composition du microbiote intestinal humain est un écosystème extrêmement complexe et diversifié, et par conséquent, de nombreuses questions sur son rôle dans la santé humaine et la pathologie des maladies restent sans réponse. Les effets de nombreux modulateurs de microbiome intestinal communs (p. ex. probiotiques, prébiotiques, antibiotiques, transplantations fécales et infections) sur la composition et les fonctions métaboliques du microbiote intestinal demeurent largement insaisissables. En outre, l'examen et la validation de ces effets in vivo est difficile, en particulier parce que la plupart des nutriments et des métabolites produits par le microbiote intestinal sont absorbés ou éliminés simultanément et rapidement dans l'intestin; par conséquent, la mesure in vivo de la production, de la quantité et du traitement de ces métabolites (p. ex., les SCFA) demeure un défi pratique. En effet, les modèles physiologiques tels que les animaux et les sujets humains sont essentiels pour déterminer le rôle du microbiome intestinal et sa modulation sur la santé de l'hôte, mais ceux-ci peuvent ne pas convenir au dépistage à grande échelle de différents types de modulateurs de microbiome en raison de contraintes éthiques, monétaires ou temporelles. À cette fin, les modèles in vitro et/ou ex vivo, tels que la culture du microbiote intestinal in vitro, puis l'intervention avec différents modulateurs de microbiote, peuvent offrir des possibilités d'économie de temps et d'argent et peuvent donc permettre un dépistage préliminaire ou à grande échelle de divers composants (tels que les probiotiques, les prébiotiques et d'autres composés interventionnels) pour examiner/prédire leurs effets sur la diversité, la composition et les profils métaboliques du microbiote fécal. Les études utilisant ces systèmes in vitro et ex vivo du microbiome intestinal peuvent faciliter une meilleure compréhension des interactions hôte-microbiome qui contribuent à la santé et à la maladie de l'hôte, et pourraient également mener à la recherche de nouvelles thérapies qui ciblent le microbiome à améliorer la santé de l'hôte et prévenir et traiter diverses maladies1.
Bien que les systèmes de culture in vitro de microbiote intestinal ne puissent pas vraiment reproduire les conditions intestinales réelles, plusieurs laboratoires se sont efforcés de développer de tels modèles, dont certains ont été jugés réalisables dans une certaine mesure et ont été utilisés avec succès pour à des fins différentes. L'un des modèles intestinaux récents est le simulateur de l'écosystème microbien intestinal humain, qui imite l'ensemble du tractus gastro-intestinal humain, y compris l'estomac, l'intestin grêle et différentes régions du côlon. Cependant, de tels modèles techniquement complexes peuvent ne pas être accessibles à d'autres installations de recherche dans le monde entier. Par conséquent, il y a encore un besoin critique pour le développement de nouveaux modèles alternatifs qui sont relativement simples, abordables et pratiques pour les laboratoires qui étudient les modulateurs de microbiome et leurs effets sur le microbiote intestinal et la santé de l'hôte. Par conséquent, l'utilisation d'un système de culture du microbiote fécal in vitro (ou ex vivo) serait utile pour étudier les effets de telles interventions11,12. Plus précisément, l'effet de différents prébiotiques sur la capacité de fermentation du microbiote en termes de changements périodiques dans la diversité et la composition du microbiote intestinal, le pH fécal et les niveaux de métabolites microbiens, y compris les SCFA et le lactate, peut être étudié 13. Dans la herein, en utilisant l'inuline (l'un des composants prébiotiques les plus étudiés) comme exemple du modulateur de microbiome, un protocole étape par étape de ce système simple de culture par lots de microbiote ex vivo est décrit pour démontrer son utilisation pour estimer le changements dans le microbiote fécal et les métabolites microbiens suivant l'intervention avec les modulateurs de microbiome.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 </td>
			<td>TGI</td>
			<td>C2388</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2063450000</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-&#945;-methylbutyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W271918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovalerate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A18642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2&#8226;4H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin (Nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14366</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-valerate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-aminobenzoic acid</td>
			<td>MP China</td>
			<td>102569</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid (H3PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>206375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>148991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure magnetic purification beads</td>
			<td>Agencourt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber with incubatore</td>
			<td>Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina MiSeq sequencer</td>
			<td>Miseq reagent kit v3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PowerFecal kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit-3 fluorimeter</td>
			<td>InVitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters-2695 Alliance HPLC system</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota

Le rôle émergent du microbiome intestinal dans plusieurs maladies humaines exige une percée de nouveaux outils, techniques et technologies. De telles améliorations sont nécessaires pour déchiffrer l'utilisation des modulateurs de microbiome pour les bienfaits pour la santé humaine. Cependant, le dépistage à grande échelle et l'optimisation des modulateurs pour valider la modulation du microbiome et prédire les avantages connexes pour la santé peuvent être pratiquement difficiles en raison de la nécessité d'un grand nombre d'animaux et / ou des sujets humains. À cette fin, les modèles in vitro ou ex vivo peuvent faciliter le dépistage préliminaire des modulateurs de microbiome. Ici, il est optimisé et a démontré un système de culture de microbiote fécal ex vivo qui peut être employé pour examiner les effets de diverses interventions des modulateurs de microbiome d'intestin comprenant des probiotiques, des prebiotiques et d'autres ingrédients alimentaires, en dehors de nutraceutiques et de drogues, sur la diversité et la composition du microbiote intestinal humain. L'inuline, l'un des composés prébiotiques et modulateurs de microbiome les plus étudiés, est utilisée comme exemple ici pour examiner son effet sur la composition saine du microbiote fécal et ses activités métaboliques, telles que le pH fécal et les niveaux fécaux d'acides organiques y compris les acides gras à chaîne courte (SCFA). Le protocole peut être utile pour les études visant à estimer les effets des différentes interventions des modulateurs sur les profils de microbiotes fécaux et à prédire leurs impacts sur la santé.

Le protocole est utilisé pour démontrer l'effet d'un prébiotique spécifique (c.-à-d. inuline sur la composition du microbiote et les activités métaboliques en termes de changements dans le pH fécal et la concentration de lactate et de SCFA dans les excréments de sujets humains sains sur différents moments après le traitement à l'inuline). Le pH fécal, les niveaux fécaux de lactate et de SCFA (figure 1) et la composition du microbiote (<strong cl...

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An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Ce protocole décrit un système in vitro de fermentation par lots-culture du microbiote fécal humain, utilisant l'inuline (un prébiotique bien connu et l'un des modulateurs de microbiote les plus largement étudiés) pour démontrer l'utilisation de ce système dans l'estimation des effets de sur la composition du microbiote fécal et les activités métaboliques.

Un modèle de culture de lots in vitro pour estimer les effets des régimes interventionnels sur le microbiote fécal humain

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Compte tenu du rôle émergent du microbiome intestinal dans diverses maladies humaines, plusieurs modulateurs de microbiome intestinal comme les probiotiques, les prébiotiques, les régimes alimentaires et les médicaments peuvent aider à améliorer les affections de santé associées au microbiome intestinal. Cependant, aucun système de dépistage rapide et abordable n’est disponible pour prédire les effets de ces modulateurs de microbiome intestinal, mais ce système est assez simple pour prédire comment des interventions particulières peuvent avoir un impact sur le microbiome intestinal qui, en fin de compte, peut avoir un impact sur la santé de l’hôte. Ce protocole est simple, abordable et pratique pour les laboratoires qui étudient les modulateurs du microbiome intestinal et leurs effets sur le microbiote et la santé de l’hôte.Le maintien des conditions aseptiques et anaérobies est crucial pour cette expérience. Aussi le spécimen fécal doit être utilisé à nouveau, immédiatement après la collecte. Dans le cas contraire, si l’expérience est planifiée plus tard, l’échantillon doit être conservé à moins 80 immédiatement après la collecte, sans aucune exposition à la température ambiante et à l’air.La précision de manipulation pendant le préparation et le pipetage d’aliquot est également importante pour maintenir la précision et la reproductibilité. Cela prendra moins de 12 heures dans la journée. Nous pouvons construire une culture du jour au lendemain s’ils ont besoin des échantillons en 24 heures.Puis, suivi par les acides gras à chaîne courte et la détermination du microbiome. Ce processus sera démontré par deux grands étudiants uni, Shokouh Ahmadi et Rabina Mainali de mon laboratoire. Pour préparer les supports de fermentation sous un capot de fumée, dans une bouteille de réapprovisionnement sur le mélange d’aimant, mélanger la solution A, la solution B, la solution minérale de trace, la solution soluble dans l’eau de vitamine, la solution folique de biotine, la solution de riboflavine, la solution d’hemin, le mélange d’acide gras à chaîne courte, et la resazurin.Ajouter ensuite dans la bouteille l’extrait de levure, le carbonate de sodium, l’hydrochlorure de cystéine monohydrate et la trypticase. Ajouter 296,1 millilitres d’eau distillée, ajuster le pH avec un hydrochlorure normal ou hydroxyde de sodium pour s’assurer qu’il est d’environ 7,0. Transférez le bécher à un poste de travail aseptique et utilisez un filtre à vide dont la taille des pores est de 0,22 micromètre pour filtrer le média pour la stérilisation.Pour préparer une solution de dilution anaérobie d’un litre, dissoudre cinq grammes de chlorure de sodium, deux grammes de glucose et 0,3 gramme de monohydrate d’hydrochlorure de cystéine dans l’eau ionisée. Autoclavez la bouteille de reagent avec le capuchon à 121.1 degrés Celsius pendant 15 minutes, et stockez-la à l’intérieur de la chambre anaérobie. Avant le début de l’expérience de fermentation, gardez tous les matériaux, solutions et outils nécessaires à l’expérience de fermentation à l’intérieur de la chambre anaérobie pendant au moins 48 heures, afin de s’assurer que tout résidu d’oxygène est éliminé.Au moins 24 heures avant l’expérience de fermentation, peser 300 milligrammes d’inuline, et le transférer dans un tube de 50 millilitres, qui est ensuite placé à l’intérieur de la chambre anaérobie. Ajouter 26 millilitres de supports de fermentation stérilisés dans le tube et le vortex pour mélanger. Permettre l’hydratation des fibres pendant environ 24 heures.Le jour de l’expérience de fermentation, préparer l’inoculum fécal. Tout d’abord, peser cinq grammes d’échantillon fécal frais dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter une solution de dilution anaérobie au tube pour atteindre un volume final de 50 millilitres.Vortex pendant 15 minutes, ou jusqu’à homogénéisation complète. Gardez les tubes inoculés à 37 degrés Celsius à l’intérieur de la chambre anaérobie, et inverser doucement une fois par heure pour résusquer les fibres et l’inoculum. Après trois, six, neuf ou 24 heures, sortez la bonne quantité de médias fermentés, et centrifugez les échantillons à 14 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Congelez immédiatement le supernatant et les granulés dans de l’azote liquide, puis après une congélation rapide, conservez le supernatant pour l’analyse des acides gras à chaîne courte et les granulés pour l’analyse du microbiome, à moins 80 degrés Celsius. Ce protocole est utilisé pour démontrer l’effet d’un prébiotique spécifique. Les excréments des sujets humains sains, suivant le traitement avec l’inuline, ont montré le pH relativement stable pendant neuf heures, alors qu’ont chuté de façon spectaculaire après 24 heures.L’inoculation de l’inuline a augmenté de manière significative les niveaux des acides gras à chaîne courte et du lactate dans le spécimen fécal inuline-traité est comparé à la culture fécale non traitée de microbiote. L’analyse principale des coordonnées montre différentes compositions de microbiotes par les mesures unifrac pondérées et non pondérées de la diversité bêta entre les échantillons traités à l’inuline et les échantillons non traités. Les indices de diversité alpha par rapport à la diversité phylogénétique par l’intermédiaire de l’arbre entier, de la richesse des espèces, des unités taxonomiques opérationnelles, de l’équilibre des espèces, ainsi que de l’abondance relative de phyla et de genres majeurs, présentent tous différentes signatures de microbiotes intestinaux entre les échantillons traités par inuline et les échantillons non traités.Le cladogram taxonomique, dérivé de l’analyse linéaire de la taille de l’effet discriminant des séquences 16S, représente le taxa différentiel abondant entre différents groupes d’échantillons. Suivez toutes les étapes avec soin. La chose la plus importante est de maintenir des conditions aseptiques et anaérobies strictes.Le supernatant et de l’expérience peut être utilisé pour traiter les changements de niveau d’acides gras à chaîne courte à la suite de la fermentation basée sur les fibres. En outre, le dans la pastille peut être utilisé pour analyser les changements dans la composition du microbiome intestinal. Certains produits chimiques utilisés pour fabriquer les supports de culture sont potentiellement dangereux.S’il vous plaît la feuille MSDS et prendre des précautions en conséquence.

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