Name: an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota
Uploaded: 2019-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

Die Autoren danken der Förderung durch das Center for Diabetes, Adipositas and Metabolism und das Clinical and Translational Science Center, die Wake Forest School of Medicine, die Finanzierung des Department of Defense (Grant-Nummer: W81XWH-18-1-0118), kermit Glenn Phillips II Lehrstuhl für Herz-Kreislauf-Medizin; die National Institutes of Health finanziert Claude D. Pepper Older Americans Center (finanziert von P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 und das Clinical and Translational Science Center (Clinical Research Unit, finanziert von UL1TR001420) werden ebenfalls dankend anerkannt. Wir danken auch den Freiwilligen für die Bereitstellung von Fäkalienproben und unseren anderen Labormitgliedern für ihre technische Hilfe während dieses Experiments.

VORSICHT: Konsultieren Sie die entsprechenden Materialsicherheitsdatenblätter und befolgen Sie die Anweisungen und Richtlinien für ein entsprechendes Training der Biosafety Level 2 (BSL-2). Befolgen Sie alle Kultivierungsschritte gemäß den Standard-Biosicherheitsregeln und verwenden Sie einen BSL-2-Schrank unter aseptischen Bedingungen. Darüber hinaus können Fäkalienproben aus verschiedenen Modellen und menschliche Probanden ein potenzielles Risiko für die Verbreitung mikrobiellen übertragener Krankheiten haben....

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	<li>Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Garcia-Villalba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+method+for+gas+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+short-chain+fatty+acids+in+faecal+samples.">Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples.</a> Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+vs+Fresh+Fecal+Microbiota+Transplantation+and+Clinical+Resolution+of+Diarrhea+in+Patients+With+Recurrent+Clostridium+difficile+Infection:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).</li><li>Chen, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+xylooligosaccharides+produced+from+Miscanthus&#215;+giganteus+by+human+fecal+microbiota.">In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus&#215; giganteus by human fecal microbiota.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).</li><li>Cook, S., Sellin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">Short chain fatty acids in health and disease.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).</li><li>Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. 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Das hier vorgestellte In-vitro-Fäkalien-Gärungsmodell ist ein einfaches Einzel-Batch-Modell, um die Auswirkungen verschiedener Substrate und mikrobiellen Stämme (z. B. Präbiotika und Probiotika) auf die Zusammensetzung der menschlichen Fäkalmikrobiota sowie deren Metabolische Aktivitäten in Bezug auf den pH-Wert und die SCFAs-Spiegel. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die Inokulation von Inulin den pH-Wert des Fäkalien verringert und die SCFAs und laktatiniert in inulin behandelten Fäkalien im Vergle...

Die menschliche Mikrobiota ist eine komplexe Gemeinschaft, die aus Bakterien, Archaeen, Viren und eukaryotischen Mikroben1besteht, die den menschlichen Körper innerlich und äußerlich bewohnen. Jüngste Erkenntnisse haben die grundlegende Rolle der Darmmikrobiota und des Darmmikrobioms (die gesamte Sammlung von Mikroben und deren Gene im menschlichen Magen-Darm-Trakt) bei verschiedenen menschlichen Krankheiten wie Fettleibigkeit, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs1,2,3. Darüber hinaus produzieren die in unserem Darm lebenden Mikroorganismen ein breites Spektrum an Metaboliten, die unsere Gesundheit erheblich beeinträchtigen und auch zur Pathophysiologie mehrerer Krankheiten sowie einer Vielzahl von Stoffwechselfunktionen beitragen können4, 5. Abnorme Veränderungen (Störungen) in der Zusammensetzung und Funktion dieser darm mikrobiellen Population werden im Allgemeinen als "gut dysbiose" bezeichnet. Dysbiose ist in der Regel mit einem ungesunden Zustand des Hosts verbunden und kann daher von der normalen (patostatischen) mikrobiellen Gemeinschaft unterschieden werden, die mit einem gesunden Kontrollzustand des Hosts verbunden ist. Spezifische Muster der Darmmikrobiom Dysbiose sind oft in verschiedenen Krankheiten gefunden1,2,3,6,7.
Die Fermentation von unverdauten Lebensmitteln, insbesondere der fermentierbaren Kohlenhydrate/Fasern, durch die Darmmikrobiota liefert nicht nur Energie, sondern produziert auch divergierende Metaboliten wie kurzkettige Fettsäuren (SCFAs), Laktat, Formate, Kohlendioxid, Methan, Wasserstoff und Ethanol6. Darüber hinaus produziert die Darmmikrobiota auch eine Reihe anderer bioaktiver Substanzen wie Folat,Biotin, Trimethylamin-N-Oxid, Serotonin, Tryptophan, Gamma-Aminobuttersäure, Dopamin, Noradrenalin, Acetylcholin, Histamin, Desoxycholsäure und 4-Ethylphenylsulfat. Dies geschieht in erster Linie durch die Nutzung intrinsischer Stoffwechselflüsse innerhalb der Host-Mikroben-Nische, die zu mehreren Körperprozessen, Stoffwechselfunktionen und epigenetischen Veränderungenbeiträgt 1,8,9, 10. Die Auswirkungen verschiedener Eingriffe auf solche mikrobiellen Produkte bleiben jedoch aufgrund des Fehlens einfacher, effizienter und reproduzierbarer Protokolle unentdeckt oder unklar. Die Zusammensetzung der menschlichen Darmmikrobiota ist ein äußerst komplexes und vielfältiges Ökosystem, und daher bleiben viele Fragen über seine Rolle in der menschlichen Gesundheit und Krankheitspathologie unbeantwortet. Die Auswirkungen vieler gängiger Darmmikrobiommodulatoren (z.B. Probiotika, Präbiotika, Antibiotika, Fäkalientransplantationen und Infektionen) auf die Zusammensetzung und metabolische Funktionen der Darmmikrobiota bleiben weitgehend schwer fassbar. Darüber hinaus ist die Untersuchung und Validierung dieser Effekte in vivo schwierig, insbesondere weil die meisten Nährstoffe und Metaboliten, die von der Darmmikrobiota produziert werden, gleichzeitig und schnell im Darm absorbiert oder entsorgt werden; Daher bleibt die Messung der Produktion, Menge und Verarbeitung dieser Metaboliten (z. B. SCFAs) in vivo nach wie vor eine praktische Herausforderung. Tatsächlich sind physiologische Modelle wie Tiere und menschliche Probanden entscheidend für die Bestimmung der Rolle des Darmmikrobioms und seiner Modulation auf die Gesundheit des Wirts, aber diese sind möglicherweise nicht für großangelegte Screenings verschiedener Arten von Mikrobiommodulatoren aufgrund ethischen, monetären oder zeitlichen Zwängen. Zu diesem Zweck können In-vitro- und/oder Ex-vivo-Modelle, wie die Kultivierung von Darmmikrobiota in vitro und dann das Eingreifen mit verschiedenen Mikrobiota-Modulatoren, zeit- und kostensparende Möglichkeiten bieten und somit ein vorläufiges oder großangelegtes Screening von verschiedene Komponenten (wie Probiotika, Präbiotika, und andere interventionelle Verbindungen) zu untersuchen / ihre Auswirkungen auf die fäkale Mikrobiota Vielfalt zu untersuchen/ vorherzusagen. Studien, die solche In-vitro- und Ex-vivo-Systeme des Darmmikrobioms verwenden, können ein besseres Verständnis der Wirts-Mikrobiom-Wechselwirkungen erleichtern, die zur Gesundheit und Krankheit des Wirts beitragen, und könnten auch dazu führen, dass neuartige Therapien gefunden werden, die auf das Mikrobiom abzielen, um Gesundheit des Wirts zu verbessern und verschiedene Krankheiten zu verhindern und zu behandeln1.
Obwohl die In-vitro-Darm-Mikrobiota-Kultursysteme die tatsächlichen Darmerkrankungen nicht wirklich replizieren können, haben sich mehrere Laboratorien bemüht, solche Modelle zu entwickeln, von denen einige bis zu einem gewissen Grad praktikabel wurden und erfolgreich für verschiedenen Zwecken. Eines der jüngsten Darmmodelle ist der Simulator des Human Intestinal Microbial Ecosystem, das den gesamten menschlichen Magen-Darm-Trakt imitiert, einschließlich des Magens, dünndarm, und verschiedene Regionen des Dickdarms. Solche technisch komplexen Modelle sind jedoch möglicherweise nicht für andere Forschungseinrichtungen weltweit zugänglich. Daher besteht nach wie vor ein kritischer Bedarf an der Entwicklung neuer alternativer Modelle, die relativ einfach, erschwinglich und praktisch für Laboratorien sind, die die Mikrobiommodulatoren und ihre Auswirkungen auf Darmmikrobiota und wirtsgesundheit untersuchen. Daher wäre die Verwendung eines in vitro (oder ex vivo) fäkalen Mikrobiota-Kultursystems nützlich, um die Auswirkungen solcher Interventionen zu untersuchen11,12. Insbesondere kann die Wirkung verschiedener Präbiotika auf die Mikrobiota-Fermentationskapazität in Bezug auf periodische Veränderungen in der Darmmikrobiota-Vielfalt und -Zusammensetzung, dem pH-Wert von Fäkalien und dem Gehalt an mikrobiellen Metaboliten, einschließlich SCFAs und Laktat, untersucht werden. 13. Hierin wird unter Verwendung von Inulin (einer der am häufigsten untersuchten präbiotischen Komponenten) als Beispiel für den Mikrobiommodulator ein Schritt-für-Schritt-Protokoll dieses einfachen ex vivo Mikrobiota-Batchkultursystems beschrieben, um seine Verwendung zur Schätzung der Veränderungen der fäkalen Mikrobiota und mikrobiellen Metaboliten nach Intervention mit den Mikrobiommodulatoren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 </td>
			<td>TGI</td>
			<td>C2388</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2063450000</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-&#945;-methylbutyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W271918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovalerate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A18642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2&#8226;4H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin (Nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14366</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-valerate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-aminobenzoic acid</td>
			<td>MP China</td>
			<td>102569</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid (H3PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>206375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>148991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure magnetic purification beads</td>
			<td>Agencourt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber with incubatore</td>
			<td>Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina MiSeq sequencer</td>
			<td>Miseq reagent kit v3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PowerFecal kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit-3 fluorimeter</td>
			<td>InVitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters-2695 Alliance HPLC system</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota

Die sich abzeichnende Rolle des Darmmikrobioms bei mehreren menschlichen Krankheiten erfordert einen Durchbruch neuer Werkzeuge, Techniken und Technologien. Solche Verbesserungen sind notwendig, um die Verwendung von Mikrobiom-Modulatoren für den Nutzen der menschlichen Gesundheit zu entschlüsseln. Das groß angelegte Screening und die Optimierung von Modulatoren zur Validierung der Mikrobiommodulation und zur Vorhersage der damit verbundenen gesundheitlichen Vorteile kann jedoch aufgrund der Notwendigkeit einer großen Anzahl von Tieren und/oder menschlichen Probanden praktisch schwierig sein. Zu diesem Zweck können In-vitro- oder Ex-vivo-Modelle das vorläufige Screening von Mikrobiommodulatoren erleichtern. Hierin, Es ist optimiert und demonstriert ein ex vivo fäkale Mikrobiota Kultursystem, das für die Untersuchung der Auswirkungen der verschiedenen Interventionen von Darm-Mikrobiom-Modulatoren einschließlich Probiotika, Präbiotika und andere Lebensmittelzutaten verwendet werden kann, abgesehen von Nutraceuticals und Medikamente, über die Vielfalt und Zusammensetzung der menschlichen Darmmikrobiota. Inulin, eine der am häufigsten untersuchten präbiotischen Verbindungen und Mikrobiommodulatoren, wird hier als Beispiel verwendet, um seine Wirkung auf die gesunde fäkale Mikrobiotazusammensetzung und ihre metabolischen Aktivitäten, wie z. B. den pH-Wert von Fäkalien und den Fäkaliengehalte organischer Säuren, zu untersuchen. einschließlich Laktat und kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs). Das Protokoll kann für Studien nützlich sein, die darauf abzielen, die Auswirkungen verschiedener Interventionen von Modulatoren auf fäkale Mikrobiotaprofile abzuschätzen und ihre gesundheitlichen Auswirkungen vorherzusagen.

Das Protokoll wird verwendet, um die Wirkung eines bestimmten Präbiotikums (d. h. Inulin auf die Mikrobiotazusammensetzung und metabolische Aktivitäten in Bezug auf Veränderungen des pH-Werts und die Konzentration von Laktat und SCFAs im Kot gesunder verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung mit Inulin). Der pH-Wert von Fäkalien, die Fäkalienspiegel von Laktat und SCFAs (Abbildung 1) und die Mikrobiotazusammensetzung (Abbildung 2...

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An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Dieses Protokoll beschreibt ein In-vitro-Batchkultur-Fermentationssystem menschlicher Fäkalienmikrobiota unter Verwendung von Inulin (einem bekannten Präbiotikum und einem der am häufigsten untersuchten Mikrobiotamodulatoren), um die Verwendung dieses Systems bei der Abschätzung der Interventionen auf fäkale Mikrobiota Zusammensetzung und metabolische Aktivitäten.

Ein In-Vitro-Batch-Kulturmodell zur Abschätzung der Auswirkungen interventionaler Regimen auf humane fäkale Mikrobiota

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

In Anbetracht der aufkommenden Rolle des Darmmikrobioms in verschiedenen menschlichen Krankheiten, mehrere Darm-Mikrobiom-Modulatoren wie Probiotika, Präbiotika, Diäten und Medikamente können bei der Linderung von Darm-Mikrobiom-assoziierten gesundheitlichen Beschwerden helfen. Allerdings gibt es kein schnelles und erschwingliches Screening-System, um die Auswirkungen solcher Darmmikrobiom-Modulatoren vorherzusagen, aber dieses System ist einfach genug, um vorherzusagen, wie bestimmte Interventionen Darmmikrobiom beeinflussen können, die letztlich die Gesundheit des Gastgebers beeinflussen können. Dieses Protokoll ist einfach, erschwinglich und praktisch für Laboratorien, die die Darmmikrobiommodulatoren und ihre Auswirkungen auf Mikrobiota und Wirtgesundheit untersuchen.Die Aufrechterhaltung aseptischer und anaerober Bedingungen ist für dieses Experiment von entscheidender Bedeutung. Auch die Fäkalienprobe sollte sofort nach der Entnahme neu verwendet werden. Andernfalls sollte die Probe, wenn das Experiment später geplant wird, sofort nach der Entnahme bei minus 80 gelagert werden, ohne dass Umgebungstemperatur und Luft ausgesetzt sind.Die Handhabungsgenauigkeit beim aliquot-Prepping und Pipettieren ist auch wichtig für die Aufrechterhaltung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit. Es dauert weniger als 12 Stunden am Tag. Wir können über Nacht eine Kultur aufbauen, wenn sie die Proben in 24 Stunden benötigen.Dann folgen die kurzkettigen Fettsäuren und die Mikrobiombestimmung. Dieser Prozess wird von zwei großen Uni-Studenten, Shokouh Ahmadi und Rabina Mainali aus meinem Labor, demonstriert. Zur Herstellung von Fermentationsmedien unter einer Dunstabzugshaube, in einer Reagenzflasche auf Magnetmischung, Mischen Vonlösung A, Lösung B, Spurenminerallösung, wasserlösliche Vitaminlösung, Folatbiotinlösung, Riboflavinlösung, Heminlösung, kurzkettige Fettsäuremischung und Resazurin.Dann in die Flasche Hefe-Extrakt, Natriumcarbonat, Cysteinhydrochlorid-Monohydrat hinzufügen, und Trypticase. Fügen Sie 296,1 Milliliter destilliertes Wasser hinzu, stellen Sie den pH-Wert mit einem normalen Hydrochlorid oder Natriumhydroxid ein, um sicherzustellen, dass es bei 7,0 liegt. Übertragen Sie das Becherglas an einen aseptischen Arbeitsplatz und verwenden Sie einen Vakuumfilter mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern, um die Medien für die Sterilisation zu filtern.Um einen Liter anaerobe Verdünnungslösung vorzubereiten, lösen Sie fünf Gramm Natriumchlorid, zwei Gramm Glukose und 0,3 Gramm Cysteinhydrochlorid-Monohydrat im ionisierten Wasser auf. Autoclavdiere die Reagenzflasche mit Kappe bei 121,1 Grad Celsius für 15 Minuten und lagern Sie sie in der anaeroben Kammer. Bewahren Sie vor Beginn des Fermentationsexperiments alle Materialien, Lösungen und Werkzeuge, die für das Fermentationsexperiment benötigt werden, mindestens 48 Stunden in der anaeroben Kammer auf, um sicherzustellen, dass eventuelle Rückstände entfernt werden.Mindestens 24 Stunden vor dem Fermentationsexperiment 300 Milligramm Inulin wiegen und in eine 50-Milliliter-Röhre geben, die dann in die anaerobe Kammer gelegt wird. Fügen Sie 26 Milliliter sterilisierte Fermentationsmedien in die Röhre und Wirbel zu mischen. Hydratation der Faser für ca. 24 Stunden zulassen.Am Tag des Fermentationsexperiments fäkales Inokulum zubereiten. Wiegen Sie zunächst fünf Gramm frischer Fäkalienprobe in einem 50 Milliliter konischen Rohr. Fügen Sie der Röhre eine anaerobe Verdünnungslösung hinzu, um ein Endvolumen von 50 Millilitern zu erreichen.Wirbel für 15 Minuten, oder bis vollständig homogenisiert. Bewahren Sie die geimpften Rohre bei 37 Grad Celsius in der anaeroben Kammer auf und kehren Sie einmal pro Stunde sanft um, um die Fasern und das Inokulum wieder aufzuhängen. Nach drei, sechs, neun oder 24 Stunden die richtige Menge an fermentierten Medien herausnehmen und die Proben bei 14.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Sofort den Überstand und das Pellet in flüssigem Stickstoff einfrieren, dann nach dem Einfrieren des Drucks den Überstand für die Kurzkett-Fettsäurenanalyse und Pellet für die Mikrobiomanalyse bei minus 80 Grad Celsius lagern. Dieses Protokoll wird verwendet, um die Wirkung eines bestimmten Präbiotikums zu demonstrieren. Der Kot gesunder menschlicher Probanden zeigte nach der Behandlung mit Inulin neun Stunden lang einen relativ stabilen pH-Wert, während er nach 24 Stunden dramatisch sank.Die Inokulation von Inulin erhöht signifikant den Gehalt an kurzkettigen Fettsäuren und Laktat in inulin behandelten Fäkalienproben wird mit der nicht behandelten fäkalen Mikrobiotakultur verglichen. Die Hauptkoordinatenanalyse zeigt eine unterschiedliche Mikrobiotazusammensetzung zu den gewichteten und ungewichteten UniFrac-Messungen der Beta-Diversität zwischen inulin behandelten und unbehandelten Proben. Indizes der Alpha-Vielfalt im Vergleich zur phylogenetischen Vielfalt durch PD-Gesamtbaum, Artenreichtum, operative taxonomische Einheiten, Artengleichmäßigkeit, sowie relative Fülle von großen Phyla und Gattungen, alle präsentieren verschiedene Darm-Mikrobiota-Signaturen zwischen inulin behandelten und unbehandelten Proben.Taxonomisches Cladogramm, abgeleitet aus der linearen Diskriminanteneffektgrößenanalyse von 16S-Sequenzen, stellt die unterschiedlich reichlich vorhandenen Taxa zwischen verschiedenen Probengruppen dar. Befolgen Sie alle Schritte sorgfältig. Das Wichtigste ist, strenge aseptische und anaerobe Bedingungen beizubehalten.Der Überstand und aus dem Experiment können verwendet werden, um Kurzkettige Fettsäuren Füllstandänderungen als Folge der Fermentation basierend auf Fasern zu behandeln. Zusätzlich kann das in der Pellet zur Analyse der Veränderungen in der Darmmikrobiomzusammensetzung verwendet werden. Einige Chemikalien, die für die Herstellung der Kulturmedien verwendet werden, sind potenziell gefährlich.Bitte stellen Sie das MSDS-Blatt auf, und treffen Sie entsprechende Vorsichtsmaßnahmen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

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Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

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Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

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Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

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Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

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Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorische Wirkung von Substanzen im menschlichen Precision-Cut Lung Slices

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Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...