Name: an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota
Uploaded: 2019-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

Gli autori riconoscono con gratitudine il supporto di finanziamento del Center for Diabetes, Obesity and Metabolism e del Clinical and Translational Science Center, della Wake Forest School of Medicine, del Department of Defense funding (Numero di sovvenzione: W81XWH-18-1-0118), la kermit Glenn Phillips II Presidente in Medicina Cardiovascolare; il National Institutes of Health ha finanziato il Claude D. Pepper Older Americans Center (finanziato da P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 e il Clinical and Translational Science Center (Clinical Research Unit, finanziato da UL1TR001420), sono stati riconosciuti per fortuna. Ringraziamo anche i volontari per aver fornito campioni fecali e gli altri membri del laboratorio per i loro aiuti tecnici durante questo esperimento.

INFORMATIVA: consultare le schede tecniche di sicurezza dei materiali appropriate e seguire le istruzioni e le linee guida per l'adeguata formazione sul livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Seguire tutti i passaggi di coltura secondo le regole standard di biosicurezza e utilizzare un cabinet BSL-2 utilizzando condizioni asettiche. Inoltre, campioni fecali provenienti da diversi modelli e soggetti umani possono avere il rischio potenziale di diffondere malattie microbiche. Immediatamente cercare aiuto medico nel verificarsi...

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	<li>Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Garcia-Villalba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+method+for+gas+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+short-chain+fatty+acids+in+faecal+samples.">Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples.</a> Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+vs+Fresh+Fecal+Microbiota+Transplantation+and+Clinical+Resolution+of+Diarrhea+in+Patients+With+Recurrent+Clostridium+difficile+Infection:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).</li><li>Chen, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+xylooligosaccharides+produced+from+Miscanthus&#215;+giganteus+by+human+fecal+microbiota.">In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus&#215; giganteus by human fecal microbiota.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).</li><li>Cook, S., Sellin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">Short chain fatty acids in health and disease.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).</li><li>Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbes+and+health:+a+focus+on+the+mechanisms+linking+microbes,+obesity,+and+related+disorders.">Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders.</a> Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-mediated+nourishment+of+gut+microbiota+protects+against+diet-induced+obesity+by+restoring+IL-22-mediated+colonic+health.">Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).</li><li>Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut&#8211;brain+axis+in+2016:+Brain&#8211;gut&#8211;microbiota+axis&#8212;mood,+metabolism+and+behaviour.">Gut&#8211;brain axis in 2016: Brain&#8211;gut&#8211;microbiota axis&#8212;mood, metabolism and behaviour.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 69 (2017).</li></ol>

Il modello di fermentazione dei liquami fecali in vitro qui presentato è un semplice modello monolotto per approssimare gli effetti di diversi substrati e ceppi microbici (ad esempio, prebiotici e probiotici) sulla composizione del microbiota fecale umano e la sua attività metaboliche in termini di pH fecale e livelli di SCFAs. I risultati qui presentati dimostrano che l'inoculazione dell'inulina diminuisce il pH fecale e aumenta significativamente i livelli di SCFA e lattato in esemplari fecali trattati inulina rispet...

Il microbiota umano è una comunità complessa composta da batteri, archei, virus e microbi eucarioti1, che abitano il corpo umano internamente ed esternamente. Prove recenti hanno stabilito il ruolo fondamentale del microbiota intestinale e del microbioma intestinale (l'intera raccolta di microbi e dei loro geni presenti nel tratto gastrointestinale umano) in varie malattie umane, tra cui l'obesità, il diabete, malattie cardiovascolari e il cancro1,2,3. Inoltre, i microrganismi che vivono nel nostro intestino producono un ampio spettro di metaboliti che influenzano significativamente la nostra salute e possono anche contribuire alla fisiopatologia di diverse malattie, nonché una varietà di funzioni metaboliche4, 5.I cambiamenti anomali (perturbazioni) nella composizione e nella funzione di questa popolazione microbica intestinale sono generalmente definita come "disbiosi intestinale". La disbiosi è di solito associata a uno stato malsano dell'ospite e quindi può essere differenziata dalla normale comunità microbica (omeostatica) associata a uno stato di controllo sano dell'ospite. Modelli specifici di disbiosi del microbioma intestinale si trovano spesso in varie malattie diverse1,2,3,6,7.
La fermentazione di alimenti non digeriti, in particolare i carboidrati/fibre fermentabili, da parte del microbiota intestinale non solo produce energia, ma produce anche metaboliti divergenti tra cui acidi grassi a catena corta (SFA), lattati, formate, anidride carbonica, metano, idrogeno ed etanolo6. Inoltre, il microbiota intestinale produce anche una serie di altre sostanze bioattive come folato, biotina, trimetilamina-N-ossido, serotonina, tritofano, acido gamma-aminobutirico, dopamina, noradrenalina, acetilcolina, istamina, deossicolico acido, e 4-ethylphenyl solfato. Ciò avviene principalmente attraverso l'utilizzo di flussi metabolici intrinseci all'interno della nicchia host-microbe, che contribuisce in diversi processi del corpo, funzioni metaboliche e cambiamenti epigenetici1,8,9, 10. Tuttavia, gli effetti di vari interventi su tali prodotti microbici rimangono sconosciuti o poco chiari a causa della mancanza di protocolli facili, efficienti e riproducibili. La composizione del microbiota intestinale umano è un ecosistema estremamente complesso e diversificato, e quindi, molte domande sul suo ruolo nella salute umana e nella patologia della malattia rimangono ancora senza risposta. Gli effetti di molti modulatori comuni del microbioma intestinale (ad esempio, probiotici, prebiotici, antibiotici, trapianti fecali e infezioni) sulla composizione e sulle funzioni metaboliche del microbiota intestinale rimangono in gran parte sfuggenti. Inoltre, l'esame e la convalida di questi effetti in vivo è difficile, in particolare perché la maggior parte dei nutrienti e dei metaboliti prodotti dal microbiota intestinale vengono assorbiti o smaltiti simultaneamente e rapidamente nell'intestino; pertanto, misurare la produzione, la quantità e la lavorazione di questi metaboliti (ad esempio, SCFA) in vivo rimane ancora una sfida pratica. Infatti, modelli fisiologici come animali e soggetti umani sono fondamentali per determinare il ruolo del microbioma intestinale e la sua modulazione sulla salute dell'ospite, ma questi potrebbero non essere adatti per lo screening su larga scala di diversi tipi di modulatori del microbioma a causa vincoli etici, monetari o temporali. A tal fine, i modelli in vitro e/o ex vivo, come la coltura del microbiota intestinale in vitro e poi intervenendo con diversi modulatori del microbiota, possono offrire opportunità di risparmio di tempo e denaro e quindi possono consentire uno screening preliminare o su larga scala vari componenti (come probiotici, prebiotici e altri composti interventistici) per esaminare/prevedere i loro effetti sulla diversità del microbiota fecale, composizione e profili metabolici. Studi che utilizzano tali sistemi in vitro ed ex vivo del microbioma intestinale possono facilitare un'ulteriore comprensione delle interazioni ospite-microbioma che contribuiscono alla salute e alla malattia dell'ospite e potrebbero anche portare a trovare nuove terapie che colpisce il microbioma migliorare la salute dell'ospite e prevenire e trattare varie malattie1.
Anche se i sistemi di coltura del microbiota intestinale in vitro non sono in grado di replicare realmente le condizioni intestinali effettive, diversi laboratori si sono sforzati di sviluppare tali modelli, alcuni dei quali sono stati ritenuti attuabili in una certa misura e sono stati utilizzati con successo per scopi diversi. Uno dei modelli intestinali recenti è il Simulatore dell'ecosistema microbico intestinale umano, che imita l'intero tratto gastrointestinale umano, tra cui lo stomaco, l'intestino tenue e diverse regioni del colon. Tuttavia, tali modelli tecnicamente complessi potrebbero non essere accessibili ad altre strutture di ricerca in tutto il mondo. Pertanto, c'è ancora una necessità critica per lo sviluppo di nuovi modelli alternativi che sono relativamente semplici, convenienti e pratici per i laboratori che studiano i modulatori del microbioma e i loro effetti sul microbiota intestinale e sulla salute dell'ospite. Quindi, l'uso di un sistema di coltura del microbiota fecale in vitro (o ex vivo) sarebbe utile per studiare gli effetti di tali interventi11,12. In particolare, l'effetto di diversi prebiotici sulla capacità di fermentazione del microbiota in termini di cambiamenti periodici nella diversità e nella composizione del microbiota intestinale, nel pH fecale e nei livelli di metaboliti microbici, tra cui SCFA e lattato, può essere studiato 13. L'uso dell'inulina (uno dei componenti prebiotici più studiati) come esempio del modulatore del microbioma, viene descritto un protocollo passo-passo di questo semplice sistema di coltura in batch ex vivo microbiota per dimostrare il suo uso per stimare cambiamenti nel microbiota fecale e metaboliti microbici a seguito dell'intervento con i modulatori del microbioma.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 </td>
			<td>TGI</td>
			<td>C2388</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2063450000</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-&#945;-methylbutyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W271918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovalerate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A18642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2&#8226;4H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin (Nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14366</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-valerate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-aminobenzoic acid</td>
			<td>MP China</td>
			<td>102569</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid (H3PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>206375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>148991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure magnetic purification beads</td>
			<td>Agencourt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber with incubatore</td>
			<td>Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina MiSeq sequencer</td>
			<td>Miseq reagent kit v3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PowerFecal kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit-3 fluorimeter</td>
			<td>InVitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters-2695 Alliance HPLC system</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota

Il ruolo emergente del microbioma intestinale in diverse malattie umane richiede una svolta di nuovi strumenti, tecniche e tecnologie. Tali miglioramenti sono necessari per decifrare l'utilizzo dei modulatori del microbioma per i benefici per la salute umana. Tuttavia, lo screening su larga scala e l'ottimizzazione dei modulatori per convalidare la modulazione del microbioma e prevedere i benefici relativi alla salute può essere praticamente difficile a causa della necessità di un gran numero di animali e/o soggetti umani. A tal fine, i modelli in vitro o ex vivo possono facilitare lo screening preliminare dei modulatori del microbioma. Qui, è ottimizzato e dimostrato un sistema di coltura microbiota fecale ex vivo che può essere utilizzato per esaminare gli effetti di vari interventi di modulatori di microbioma intestinale tra cui probiotici, prebiotici e altri ingredienti alimentari, oltre a nutraceutici e droghe, sulla diversità e la composizione del microbiota intestinale umano. L'inulina, uno dei composti prebiotici e modulatori del microbioma più studiati, viene utilizzato come esempio qui per esaminarne l'effetto sulla composizione sana del microbiota fecale e sulle sue attività metaboliche, come il pH fecale e i livelli fecali di acidi organici compresi gli acidi grassi lattati e a catena corta (SCFA). Il protocollo può essere utile per studi volti a stimare gli effetti di diversi interventi di modulatori sui profili microbiota fecale e a prevedere il loro impatto sulla salute.

Il protocollo è utilizzato per dimostrare l'effetto di un prebiotico specifico (cioè l'inulina sulla composizione del microbiota e sulle attività metaboliche in termini di cambiamenti nel pH fecale e la concentrazione di lattato e SCFA nelle feci di soggetti umani sani diversi punti temporali dopo il trattamento con inulina). Il pH fecale, i livelli fecali di lattato e SCFA (Figura1) e la composizione del microbiota (Figura 2 ...

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An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Questo protocollo descrive un sistema di fermentazione in vitro a coltura batch del microbiota fecale umano, utilizzando l'inulina (un prebiotico ben noto e uno dei modulatori microbiota più studiati) per dimostrare l'uso di questo sistema nella stima degli effetti di interventi sulla composizione del microbiota fecale e sulle attività metaboliche.

Un modello di coltura batch in vitro per stimare gli effetti dei regimi interventistici sul microbiota fecale umano

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Considerando il ruolo emergente del microbioma intestinale in varie malattie umane, diversi modulatori del microbioma intestinale come probiotici, prebiotici, diete e farmaci possono aiutare a migliorare i disturbi della salute associati al microbioma intestinale. Tuttavia, non è disponibile un sistema di screening rapido e conveniente per prevedere gli effetti di tali modulatori del microbioma intestinale, ma questo sistema è abbastanza semplice da prevedere come particolari interventi possono influire sul microbioma intestinale che alla fine può influire sulla salute dell'ospite. Questo protocollo è semplice, conveniente e pratico per i laboratori che studiano i modulatori del microbioma intestinale e i loro effetti sul microbiota e sulla salute dell'ospite.Il mantenimento di condizioni asettiche e anaerobiche è fondamentale per questo esperimento. Anche l'esemplare fecale deve essere usato di nuovo, immediatamente dopo la raccolta. In caso contrario, se l'esperimento è previsto in un secondo momento, il campione deve essere conservato a meno 80 immediatamente dopo la raccolta, senza alcuna esposizione alla temperatura ambiente e all'aria.La precisione di movimentazione durante la preparazione e la pipettazione dell'aliquota è importante anche per mantenere precisione e riproducibilità. Ci saranno meno di 12 ore durante il giorno. Possiamo costruire una cultura durante la notte se hanno bisogno dei campioni in 24 ore.Quindi, seguito dagli acidi grassi a catena corta e dalla determinazione del microbioma. Questo processo sarà dimostrato da due grandi studenti universitari, Shokouh Ahmadi e Rabina Mainali del mio laboratorio. Per preparare i mezzi di fermentazione sotto una cappa aspirante, in una bottiglia di reagente su miscela magnetica, mescolare la soluzione A, la soluzione B, la soluzione minerale traccia, la soluzione vitaminica solubile in acqua, la soluzione di biotina folato, la soluzione di riboflavina, la soluzione di emina, la miscela di acidi grassi a catena corta e la resazurina.Quindi aggiungere nell'estratto di lievito di bottiglia, carbonato di sodio, cloridrato di cisteina monoidrato e triptasi. Aggiungere 296,1 millilitri di acqua distillata, regolare il pH con un normale cloridrato o idrossido di sodio per assicurarsi che sia intorno a 7,0. Trasferire il becher su una postazione aseptica e utilizzare un filtro sottovuoto con dimensioni dei pori a 0,22 micrometri per filtrare il supporto per la sterilizzazione.Per preparare una soluzione di diluizione anaerobica da un litro, sciogliere cinque grammi di cloruro di sodio, due grammi di glucosio e 0,3 grammi di cloridrato di cisteina monoidrato nell'acqua ionizzata. Autoclavare la bottiglia del reagente con tappo a 121,1 gradi Celsius per 15 minuti e conservarla all'interno della camera anaerobica. Prima dell'inizio dell'esperimento di fermentazione, conservare per almeno 48 ore tutti i materiali, le soluzioni e gli strumenti necessari per l'esperimento di fermentazione all'interno della camera anaerobica, per garantire che l'ossigeno residuo venga rimosso.Almeno 24 ore prima dell'esperimento di fermentazione, pesare 300 milligrammi di inulina e trasferirlo in un tubo da 50 millilitri, che viene quindi posto all'interno della camera anaerobica. Aggiungere 26 millilitri di mezzi di fermentazione sterilizzati nel tubo e vortice da mescolare. Consentire l'idratazione della fibra per circa 24 ore.Il giorno dell'esperimento di fermentazione, preparare l'inoculo fecale. In primo luogo, pesare cinque grammi di campione fecale fresco in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere la soluzione di diluizione anaerobica al tubo per raggiungere un volume finale di 50 millilitri.Vortice per 15 minuti, o fino a completa omogeneizzazione. Mantenere i tubi inoculati a 37 gradi Celsius all'interno della camera anaerobica e invertire delicatamente una volta ogni ora per rimescolare le fibre e l'inoculo. Dopo tre, sei, nove o 24 ore, eslevare la quantità corretta di mezzi fermentati e centrifugare i campioni a 14.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Congelare immediatamente il supernatante e il pellet in azoto liquido, quindi dopo il congelamento a scatto, conservare il supernatante per l'analisi degli acidi grassi a catena corta e il pellet per l'analisi del microbioma, a meno 80 gradi Celsius. Questo protocollo è usato per dimostrare l'effetto di uno specifico prebiotico. Le feci di soggetti umani sani, dopo il trattamento con inulina, hanno mostrato un pH relativamente stabile per nove ore, mentre sono diminuite drasticamente dopo 24 ore.L'inoculazione dell'inulina ha aumentato significativamente i livelli di acidi grassi a catena corta e il lattato nel campione fecale trattato con inulina viene confrontato con la coltura di microbiota fecale non trattata. L'analisi delle coordinate principali mostra diverse composizioni di microbiota rispetto alle misure UniFrac ponderate e non ponderate della diversità beta tra campioni trattati con inulina e non trattati. Indici di diversità alfa rispetto alla diversità filogenetica attraverso l'intero albero PD, ricchezza delle specie, unità tassonomiche operative, evenienza delle specie, nonché abbondanza relativa di phyla e generi principali, presentano tutti diverse firme microbiota intestinali tra campioni trattati inulina e non trattati.Il cladogramma tassonomico, derivato dall'analisi lineare delle dimensioni degli effetti discriminanti delle sequenze 16S, rappresenta il taxa differenziale abbondante tra diversi gruppi di campioni. Seguire attentamente tutti i passaggi. La cosa più importante è mantenere condizioni asettiche e anaerobiche rigorose.Il supernatante e dall'esperimento possono essere utilizzati per trattare i cambiamenti di livello degli acidi grassi a catena corta a seguito della fermentazione a base di fibre. Inoltre, il pellet può essere utilizzato per analizzare i cambiamenti nella composizione del microbioma intestinale. Alcune sostanze chimiche utilizzate per realizzare i mezzi di coltura sono potenzialmente pericolose.Si prega di il foglio MSDS e prendere precauzioni di conseguenza.

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