Name: an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota
Uploaded: 2019-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

Forfatterne takknemlig erkjenner finansiering støtte fra senter for diabetes, fedme og metabolisme og klinisk og translational Science Center, den Wake Forest School of Medicine, Department of Defense finansiering (Grant nummer: W81XWH-18-1-0118), den Kermit Glenn Phillips II Chair i kardiovaskulær medisin; National Institutes of Health finansiert Claude D. pepper eldre amerikanere Center (finansiert av P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 og klinisk og translational Science Center (Clinical Research Unit, finansiert av UL1TR001420), er også Heldigvis anerkjent. Vi takker også de frivillige for å gi avføringsprøver, og våre andre Lab-medlemmer for deres tekniske hjelper under dette eksperimentet.

FORSIKTIG: ta kontakt med de nødvendige sikkerhets data arkene og følg instruksjonene og retningslinjene for passende opplæring i biosafety Level 2 (BSL-2). Følg alle dyrking trinnene i henhold til standard biosafety regler og bruk en BSL-2 kabinett ved hjelp av aseptisk forhold. Videre kan avføringsprøver fra forskjellige modeller og mennesker ha potensiell risiko for å spre mikrobielle sykdommer. Umiddelbart søke medisinsk hjelp i forekomsten av eventuelle skader og infeksjoner. I tillegg bør bruk av mennesker...

<ol>
	<li>Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiome+in+health+and+in+disease.">The gut microbiome in health and in disease.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).</li><li>Xu, Z., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+effects+on+human+gut+microbiome+diversity.">Dietary effects on human gut microbiome diversity.</a> British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).</li><li>Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+and+Alzheimer&#8217;s+disease.">The gut microbiota and Alzheimer&#8217;s disease.</a> Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).</li><li>Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+gut+microbiota+on+human+health:+an+integrative+view.">The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view.</a> The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).</li><li>Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+mediated+modulation+of+gut+flora+might+be+biotherapeutical+approach+obesity+and+type+2+diabetes.">Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes.</a> Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).</li><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+Polysaccharides+in+the+Amelioration+of+Gut+Microbiome+Dysbiosis+and+Metabolic+Diseases.">Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases.</a> Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-Linked+Gut+Microbiome+Dysbiosis+Associated+with+Derangements+in+Gut+Permeability+and+Intestinal+Cellular+Homeostasis+Independent+of+Diet.">Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet.</a> Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).</li><li>Paul, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+diet+and+the+gut+microbiome+on+epigenetic+modulation+in+cancer+and+other+diseases.">Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases.</a> Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).</li><li>O&#8217;mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+tryptophan+metabolism+and+the+brain-gut-microbiome+axis.">Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis.</a> Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).</li><li>Sharon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+metabolites+from+the+microbiome+in+health+and+disease.">Specialized metabolites from the microbiome in health and disease.</a> Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).</li><li>Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+digestion+and+fermentation+characteristics+of+temulose+molasses,+a+coproduct+of+fiberboard+production,+and+select+temulose+fractions+using+canine+fecal+inoculum.">In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum.</a> Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).</li><li>Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetable+fiber+fermentation+by+human+fecal+bacteria:+cell+wall+polysaccharide+disappearance+and+short-chain+fatty+acid+production+during+in+vitro+fermentation+and+water-holding+capacity+of+unfermented+residues.">Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues.</a> Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-origin+probiotic+cocktail+increases+short-chain+fatty+acid+production+via+modulation+of+mice+and+human+gut+microbiome.">Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+microbiome+signatures+and+short-chain+fatty+acids+in+mouse,+rat,+non-human+primate+and+human+feces.">Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).</li><li>Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced+decreases+in+the+levels+of+microbial-derived+short-chain+fatty+acids+promote+gastrointestinal+colonization+of+Candida+albicans.">Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans.</a> bioRxiv. , 428474 (2018).</li><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prebiotics+from+acorn+and+sago+prevent+high-fat+diet-induced+insulin+resistance+via+microbiome-gut-brain+axis+modulation.">Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+Microbiome+Composition+in+Non-human+Primates+Consuming+a+Western+or+Mediterranean+Diet.">Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Garcia-Villalba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+method+for+gas+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+short-chain+fatty+acids+in+faecal+samples.">Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples.</a> Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+vs+Fresh+Fecal+Microbiota+Transplantation+and+Clinical+Resolution+of+Diarrhea+in+Patients+With+Recurrent+Clostridium+difficile+Infection:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).</li><li>Chen, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+xylooligosaccharides+produced+from+Miscanthus&#215;+giganteus+by+human+fecal+microbiota.">In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus&#215; giganteus by human fecal microbiota.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).</li><li>Cook, S., Sellin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">Short chain fatty acids in health and disease.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).</li><li>Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbes+and+health:+a+focus+on+the+mechanisms+linking+microbes,+obesity,+and+related+disorders.">Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders.</a> Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-mediated+nourishment+of+gut+microbiota+protects+against+diet-induced+obesity+by+restoring+IL-22-mediated+colonic+health.">Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).</li><li>Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut&#8211;brain+axis+in+2016:+Brain&#8211;gut&#8211;microbiota+axis&#8212;mood,+metabolism+and+behaviour.">Gut&#8211;brain axis in 2016: Brain&#8211;gut&#8211;microbiota axis&#8212;mood, metabolism and behaviour.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 69 (2017).</li></ol>

The in vitro avførings slurry gjæring modell som presenteres her er en enkel single-batch-modell for å omtrentlige effekten av ulike underlag og mikrobielle stammer (f. eks, Prebiotics og probiotika) på sammensetningen av menneskelig avføring bakterieflora så vel som dens metabolske aktiviteter i form av avføring pH og SCFAs nivåer. Resultatene presentert her viser at inoculation av inulin reduserer avføring pH og signifikant øker nivåene av SCFAs og melkesyre i inulin avføring i forhold til ikke-behandlet av...

Den menneskelige bakterieflora er et komplekst samfunn bestående av bakterier, Archaea, virus og eukaryote mikrober1, som bor i menneskekroppen internt og eksternt. Nylige bevis har etablert den grunnleggende rollen til tarmen bakterieflora og tarmen mikrobiomet (hele samlingen av mikrober og deres gener som finnes i den menneskelige mage-tarmkanalen) i ulike menneskelige sykdommer, inkludert fedme, diabetes, kardiovaskulære sykdommer, og kreft1,2,3. I tillegg mikroorganismer som lever i vår gut produsere et bredt spekter av metabolitter som i betydelig grad påvirker vår helse og kan også bidra til patofysiologi av flere sykdommer, samt en rekke metabolske funksjoner4, 5. unormale forandringer (forstyrrelser) i sammensetningen og funksjon av denne tarmen mikrobiell befolkning er generelt betegnet som "gut dysbiosis". Dysbiosis er vanligvis forbundet med en usunn tilstand av verten og dermed kan skilles fra den normale (homøostatisk) mikrobielle samfunn forbundet med en sunn kontroll tilstand verten. Spesifikke mønstre av gut mikrobiomet dysbiosis er ofte funnet i ulike sykdommer1,2,3,6,7.
Gjæring av ufordøyd mat, spesielt fermentable karbohydrater/fibre, av tarmen bakterieflora ikke bare gir energi, men også produserer avvikende metabolitter inkludert Short-Chain fettsyrer (SCFAs), melkesyre, formiat, karbondioksid, metan, hydrogen og etanol6. I tillegg, tarmen bakterieflora produserer også en rekke andre bioaktive stoffer som folat, biotin, trimetylamin-N-oksid, serotonin, tryptofan, gamma-aminobutyric acid, dopamin, noradrenalin, acetylkolin, histamin, deoxycholic syre, og 4-ethylphenyl sulfat. Dette skjer hovedsakelig gjennom utnyttelse av indre metabolske flukser innenfor Host-mikrobe nisje, som bidrar i flere kroppens prosesser, metabolske funksjoner og epigenetic endringer1,8,9, 10i. Men virkningene av ulike intervensjoner på slike mikrobielle produkter forblir ukjent eller uklart på grunn av mangel på enkel, effektiv og reproduserbar protokoller. Den menneskelige gut bakterieflora sammensetning er en svært kompleks og mangfoldig økosystem, og dermed mange spørsmål om sin rolle i menneskers helse og sykdom patologi fortsatt forblir ubesvart. Effekten av mange vanlige gut mikrobiomet modulatorer (f. eks, probiotika, Prebiotics, antibiotika, avføring transplantasjon og infeksjoner) på sammensetningen og metabolske funksjoner av intestinal bakterieflora fortsatt i stor grad unnvikende. I tillegg er undersøkelse og validering av disse effektene i vivo vanskelig, spesielt fordi de fleste av næringsstoffene og metabolitter som produseres av tarmen bakterieflora absorberes eller kastes samtidig og raskt i tarmen; Derfor er det fortsatt en praktisk utfordring å måle produksjonen, mengden og behandlingen av disse metabolitter (f.eks. SCFAs) in vivo. Faktisk, fysiologiske modeller som dyr og mennesker er avgjørende for å bestemme hvilken rolle gut mikrobiomet og modulering på verten helse, men disse kan ikke være egnet for stor skala screening av ulike typer mikrobiomet modulatorer grunn etiske, monetære eller tidspress. For dette formål, in vitro og/eller ex vivo-modeller, slik som dyrking av gut bakterieflora in vitro og deretter intervenere med ulike bakterieflora modulatorer, kan tilby tid-og penger-sparing muligheter og dermed kan tillate for foreløpige eller stor skala screening av ulike komponenter (for eksempel probiotika, Prebiotics, og andre interventional forbindelser) for å undersøke/forutsi deres virkninger på avføring bakterieflora mangfold, sammensetning og metabolske profiler. Studier som bruker slike in vitro-og ex vivo-systemer i tarmen mikrobiomet kan legge til rette for ytterligere forståelse av mikrobiomet interaksjoner som bidrar til å være vert for helse og sykdom, og kan også føre til å finne romanen behandlinger som mål mikrobiomet til forbedre verten helse og forebygge og behandle ulike sykdommer1.
Selv om in vitro gut bakterieflora kultur systemer ikke kan virkelig gjenskape den faktiske tarm forhold, flere laboratorier har forsøkte å utvikle slike modeller, noen som har blitt funnet praktisk mulig til en viss grad og har blitt brukt til forskjellige formål. En av de siste gut modellene er Simulator av Human intestinal mikrobiell økosystem, som etterligner hele den menneskelige mage-tarmkanalen, inkludert magen, tynntarmen, og ulike regioner i tykktarmen. Imidlertid kan slike teknisk komplekse modeller ikke være tilgjengelig for andre forskningsanlegg over hele verden. Derfor er det fortsatt et kritisk behov for utvikling av nye alternative modeller som er relativt enkle, rimelige og praktiske for laboratorier studere mikrobiomet modulatorer og deres virkninger på Gut bakterieflora og Host helse. Derfor vil bruken av en in vitro (eller ex vivo) avføring bakterieflora kultur system være nyttig for å studere virkningene av slike intervensjoner11,12. Nærmere bestemt, effekten av ulike Prebiotics på bakterieflora gjæring kapasitet i form av periodiske endringer i tarmen bakterieflora mangfold og sammensetning, den avføring pH, og nivåene av mikrobielle metabolitter inkludert SCFAs og melkesyre kan bli studert 13. heri, ved hjelp av inulin (en av de mest studerte prebiotiske komponenter) som et eksempel på mikrobiomet modulator, en trinnvis protokoll for denne enkle ex vivo bakterieflora batch-kultur systemet er beskrevet for å demonstrere sin bruk for å anslå endringer i avføring bakterieflora og mikrobielle metabolitter etter intervensjon med mikrobiomet modulatorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 </td>
			<td>TGI</td>
			<td>C2388</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2063450000</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-&#945;-methylbutyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W271918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovalerate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A18642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2&#8226;4H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin (Nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14366</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-valerate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-aminobenzoic acid</td>
			<td>MP China</td>
			<td>102569</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid (H3PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>206375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>148991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure magnetic purification beads</td>
			<td>Agencourt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber with incubatore</td>
			<td>Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina MiSeq sequencer</td>
			<td>Miseq reagent kit v3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PowerFecal kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit-3 fluorimeter</td>
			<td>InVitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters-2695 Alliance HPLC system</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota

Den nye rollen til tarmen mikrobiomet i flere menneskelige sykdommer krever et gjennombrudd av nye verktøy, teknikker og teknologier. Slike forbedringer er nødvendig for å dechiffrere utnyttelsen av mikrobiomet modulatorer for menneskers helse fordeler. Imidlertid, det stor-skalaen skjermen og optimering av modulatorer å godkjenne mikrobiomet modulering og forutsi i slekt sunnhet fordeler kanskje være praktisk talt vanskelig på grunn av behovet for stor mengde av dyrene og/eller Human emner. For dette formål, in vitro eller ex vivo-modeller kan forenkle foreløpige screening av mikrobiomet modulatorer. Heri er det optimalisert og demonstrert en ex vivo avføring bakterieflora kultur system som kan brukes til å undersøke virkningene av ulike intervensjoner av gut mikrobiomet modulatorer inkludert probiotika, Prebiotics og andre mat ingredienser, bortsett fra nutraceuticals og narkotika, på mangfoldet og sammensetningen av den menneskelige tarmen bakterieflora. Inulin, en av de mest studerte prebiotiske forbindelser og mikrobiomet modulatorer, brukes som et eksempel her for å undersøke dens effekt på sunne avføring bakterieflora sammensetning og dens metabolske aktiviteter, som for eksempel avføring pH og avføring nivåer av organiske syrer inkludert melkesyre og kort kjede fettsyrer (SCFAs). Protokollen kan være nyttig for studier med sikte på å estimere virkningene av ulike intervensjoner av modulatorer på avføring bakterieflora profiler og til å forutsi deres helsemessige virkninger.

Protokollen brukes til å demonstrere effekten av en bestemt prebiotiske (dvs. inulin på bakterieflora sammensetning og metabolske aktiviteter i form av endringer i avførings pH og konsentrasjonen av melkesyre og SCFAs i avføringen til friske menneskelige over forskjellige tids punkter etter behandling med inulin). PH i avføring, avførings nivåene av melkesyre og SCFAs (figur 1), og bakterieflora sammensetning (figur 2 og <...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Denne protokollen beskriver en in vitro batch-kultur gjæring system av menneskelig avføring bakterieflora, ved hjelp inulin (en velkjent prebiotiske og en av de mest studerte bakterieflora modulatorer) for å demonstrere bruken av dette systemet i estimering effekter av spesifikke av avførings bakterieflora sammensetning og metabolske aktiviteter.

An in vitro batch-kultur modell for å anslå virkningene av interventional regimer på Human avføring bakterieflora

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Tatt i tanke på den nye rollen som tarmmikrobiome i ulike menneskelige sykdommer, kan flere tarmmikrobiomemodulatorer som probiotika, prebiotika, dietter og legemidler bidra til å lindre tarmmikrobiomerelaterte helseplager. Men ingen rask og rimelig screening system er tilgjengelig for å forutsi effekten av slike gut mikrobiome modulatorer, men dette systemet er enkelt nok til å forutsi hvordan bestemte intervensjoner kan påvirke tarmen mikrobiome som til slutt kan påvirke vertens helse. Denne protokollen er enkel, rimelig og praktisk for laboratorier som undersøker tarmmikrobiomemodulatorene og deres effekter på mikrobiota og vertshelse.Vedlikehold av aseptiske og anaerobe forhold er avgjørende for dette eksperimentet. Også fekal prøven skal brukes på nytt, umiddelbart etter innsamling. Ellers hvis eksperimentet er planlagt senere, bør prøven lagres på minus 80 umiddelbart etter innsamling, uten eksponering for omgivelsestemperatur og luft.Håndteringsnøyaktighet under aliquot prepping og pipettering er også viktig for å opprettholde nøyaktighet og reproduserbarhet. Det vil ta mindre enn 12 timer på dagtid. Vi kan bygge en kultur over natten hvis de trenger prøvene om 24 timer.Deretter, etterfulgt av de kortkjedede fettsyrene og mikrobiomebestemmelsen. Denne prosessen vil bli demonstrert av to store uni studenter, Shokouh Ahmadi og Rabina Mainali fra laboratoriet mitt. For å forberede gjæringsmedier under en røykhette, i en reagensflaske på magnetblanding, bland løsning A, løsning B, spormineralløsning, vannløselig vitaminløsning, folatbiotinløsning, riboflavinløsning, heminløsning, kortkjedede fettsyreblanding og resazurin.Deretter legger du til flasken gjær ekstrakt, natriumkarbonat, cysteinhydroklorid monohydrat, og trypticase. Tilsett 296,1 milliliter destillert vann, juster pH med en normal hydroklorid eller natriumhydroksid for å sikre at den er rundt 7,0. Overfør begeret til en aseptisk arbeidsstasjon, og bruk et vakuumfilter med porestørrelse på 0,22 mikrometer for å filtrere mediet for sterilisering.For å forberede en liter anaerob fortynningsløsning, oppløs fem gram natriumklorid, to gram glukose og 0,3 gram cysteinhydrokloridmonohydrat i det ioniserte vannet. Autoklav reagensflasken med hette på 121,1 grader Celsius i 15 minutter, og lagre den inne i det anaerobe kammeret. Før starten av gjæringseksperimentet, hold alle materialer, løsninger og verktøy som trengs for gjæringseksperimentet inne i det anaerobe kammeret i minst 48 timer, for å sikre at eventuelle rester oksygen fjernes.Minst 24 timer før gjæringseksperimentet, veie 300 milligram inulin, og overfør det til et 50 milliliter rør, som deretter plasseres inne i det anaerobe kammeret. Tilsett 26 milliliter sterilisert gjæringsmedie i røret, og vortex å blande. Tillat hydrering av fiber i ca 24 timer.Dagen for gjæringseksperimentet, lag fekal inoculum. Først veie fem gram fersk fekal prøve i en 50 milliliter konisk rør. Tilsett anaerob fortynningsløsning til røret for å nå et endelig volum på 50 milliliter.Vortex i 15 minutter, eller til helt homogenisert. Hold de inokulerte rørene på 37 grader Celsius inne i det anaerobe kammeret, og inverter forsiktig en gang i timen for å gjenbruke fibrene og inokulumet. Etter tre, seks, ni eller 24 timer, ta ut riktig mengde fermenterte medier, og sentrifuge prøvene på 14.000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Umiddelbart fryse supernatant og pellet i flytende nitrogen, deretter etter snap frysing, lagre supernatant for kortkjedede fettsyrer analyse, og pellet for mikrobiome analyse, på minus 80 grader Celsius. Denne protokollen brukes til å demonstrere effekten av en bestemt prebiotisk. Avføringen av friske mennesker, etter behandling med inulin, viste relativt stabil pH i ni timer, mens falt dramatisk etter 24 timer.Inokulasjonen av inulin økte signifikant nivåene av kortkjedede fettsyrer og laktat i inulinbehandlet fekal prøve sammenlignes med ikke-behandlet fekal mikrobiotakultur. Hovedkoordinatanalyse viser forskjellig mikrobiotasammensetning til de vektede og uvektede UniFrac-målene for betamangfold mellom inulinbehandlede og ubehandlede prøver. Indekser av alfa mangfold versus fylogenetisk mangfold gjennom PD hele treet, arter rikdom, operasjonelle taksonomiske enheter, arter jevnhet, samt relativ overflod av store phyla og slekter, alle presentere ulike gut mikrobiota signaturer mellom inulin behandlet og ubehandlet prøver.Taksonomisk kladokgram, avledet fra lineær diskriminant effektstørrelsesanalyse av 16S-sekvenser, representerer differensialsk rikelig taksa mellom ulike grupper av prøver. Følg alle trinnene nøye. Det viktigste er å opprettholde strenge aseptiske og anaerobe forhold.Det supernatante og fra eksperimentet kan brukes til å behandle kortkjedede fettsyrer nivå endringer som følge av gjæring basert på fibre. I tillegg kan i pellet brukes til å analysere endringene i tarmmikrobiomesammensetningen. Noen kjemikalier som brukes til å lage kulturmediene er potensielt farlige.Vennligst MSDS-arket og ta forholdsregler tilsvarende.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere heterogenitet of Human Macrophage Differensiering og Polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Gransker effekten av Probiotika på Pneumokokk Colonization Bruke en<em&gt; In Vitro</em&gt; Overholdelse analysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell for måling av immunresponser mot Malaria i sammenheng med HIV Samtidig infeksjon

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av blod-hjernebarrieren Bruke impedansspektroskopi: En Fokus på T Cell-endotelceller Interaksjon

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere effekten av Sputum på Biofilm Development Ved hjelp av en Chambered dekkglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspresjon og rensing av menneske<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Effekter av smak signalering Protein oppløsning på Gut betennelse i en inflammatorisk tarm sykdom musemodell

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analyse av interaksjoner mellom Endobiotics og Human gut bakterieflora bruke in vitro Bath Gjærings systemer

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...