Name: an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota
Uploaded: 2019-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

Os autores reconhecem com gratidão o apoio ao financiamento do centro de diabetes, obesidade e metabolismo e o centro de ciência clínica e translacional, a escola de medicina Wake Forest, o departamento de financiamento da defesa (número Grant: W81XWH-18-1-0118), a cadeira Kermit Glenn Phillips II em medicina cardiovascular; os institutos nacionais de saúde financiaram Claude D. Pepper mais velhos americanos centro (financiado por P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 e o centro de ciência clínica e translacional (unidade de pesquisa clínica, financiado por UL1TR001420), também é reconhecido felizmente. Agradecemos também aos voluntários por fornecer amostras fecais, e nossos outros membros do laboratório por suas ajudas técnicas durante este experimento.

Cuidado: consulte as fichas de dados de segurança do material apropriadas e siga as instruções e diretrizes para o treinamento adequado de nível 2 de biosseguridade (BSL-2). Siga todas as etapas de cultivo de acordo com as regras padrão de biossegurança e use um gabinete BSL-2 usando condições assépticas. Além disso, amostras fecais de diferentes modelos e indivíduos humanos podem apresentar risco potencial de disseminação de doenças transmitidas por microrganismos. Procure imediatamente ajuda médica na oc...

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	<li>Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiome+in+health+and+in+disease.">The gut microbiome in health and in disease.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).</li><li>Xu, Z., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+effects+on+human+gut+microbiome+diversity.">Dietary effects on human gut microbiome diversity.</a> British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).</li><li>Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+and+Alzheimer&#8217;s+disease.">The gut microbiota and Alzheimer&#8217;s disease.</a> Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).</li><li>Clemente, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Garcia-Villalba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+method+for+gas+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+short-chain+fatty+acids+in+faecal+samples.">Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples.</a> Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+vs+Fresh+Fecal+Microbiota+Transplantation+and+Clinical+Resolution+of+Diarrhea+in+Patients+With+Recurrent+Clostridium+difficile+Infection:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).</li><li>Chen, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+xylooligosaccharides+produced+from+Miscanthus&#215;+giganteus+by+human+fecal+microbiota.">In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus&#215; giganteus by human fecal microbiota.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).</li><li>Cook, S., Sellin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">Short chain fatty acids in health and disease.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).</li><li>Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbes+and+health:+a+focus+on+the+mechanisms+linking+microbes,+obesity,+and+related+disorders.">Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders.</a> Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-mediated+nourishment+of+gut+microbiota+protects+against+diet-induced+obesity+by+restoring+IL-22-mediated+colonic+health.">Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).</li><li>Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut&#8211;brain+axis+in+2016:+Brain&#8211;gut&#8211;microbiota+axis&#8212;mood,+metabolism+and+behaviour.">Gut&#8211;brain axis in 2016: Brain&#8211;gut&#8211;microbiota axis&#8212;mood, metabolism and behaviour.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 69 (2017).</li></ol>

O modelo de fermentação fecal in vitro aqui apresentado é um modelo simples de lote único para aproximar os efeitos de diferentes substratos e cepas microbianas (por exemplo, prebióticos e probióticos) sobre a composição da microbiota fecal humana, bem como sua atividades metabólicas em termos de pH fecal e níveis de SCFAs. Os resultados aqui apresentados demonstram que a inoculação da inulina diminui o pH fecal e aumenta significativamente os níveis de SCFAs e lactato em espécimes fecais tratados com inuli...

A microbiota humana é uma comunidade complexa constituída por bactérias, archaea, vírus e micróbios eucarióticos1, que habitam o corpo humano internamente e externamente. Evidências recentes estabeleceram o papel fundamental da microbiota intestinal e do microbioma intestinal (toda a coleção de micróbios e seus genes encontrados no trato gastrointestinal humano) em várias doenças humanas, incluindo obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares e câncer1,2,3. Além disso, os microrganismos que vivem em nosso intestino produzem um amplo espectro de metabólitos que afetam significativamente a nossa saúde e também podem contribuir para a fisiopatologia de várias doenças, bem como uma variedade de funções metabólicas4, as mudanças 5. anormais (perturbações) na composição e na função desta população microbiana do intestino são denominadas geralmente como o "dysbiosis do intestino". Dysbiosis é associado geralmente com um estado insalubre do anfitrião e daqui pode ser diferenciado da comunidade microbiana (Homeostatic) normal associada com um estado saudável do controle do anfitrião. Padrões específicos de disbiose do microbioma intestinal são freqüentemente encontrados em várias doenças diferentes1,2,3,6,7.
A fermentação de alimentos não digeridos, particularmente os carboidratos/fibras fermentáveis, pela microbiota intestinal não só produz energia, mas também produz metabólitos divergentes, incluindo ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs), lactato, formate, dióxido de carbono, metano, hidrogênio e etanol6. Além disso, a microbiota intestinal também produz uma série de outras substâncias bioativas, tais como folato, biotina, trimetilamina-N-óxido, serotonina, triptofano, ácido gama-aminobutírico, dopamina, norepinefrina, acetilcolina, histamina, ácido desoxicólico e sulfato de 4-etilfenil. Isso ocorre principalmente através da utilização de fluxos metabólicos intrínsecos dentro do nicho hospedeiro-micróbe, que contribui em vários processos corporais, funções metabólicas e alterações epigenéticas1,8,9, a 10. No entanto, os efeitos de várias intervenções em tais produtos microbianos permanecem não kown ou incerto devido à falta de protocolos fáceis, eficientes e reprodutíveis. A composição da microbiota do intestino humano é um ecossistema extremamente complexo e diversificado, e, portanto, muitas perguntas sobre seu papel na saúde humana e patologia da doença ainda permanecem sem resposta. Os efeitos de muitos moduladores comuns do microbioma do intestino (por exemplo, probióticos, prebióticos, antibióticos, transplantação fecal e infecções) na composição e nas funções metabólicas da microbiota intestinal permanecem pela maior parte indescritível. Além disso, o exame e validação desses efeitos in vivo é difícil, especialmente porque a maioria dos nutrientes e metabólitos produzidos pela microbiota intestinal são absorvidos ou eliminados simultaneamente e rapidamente no intestino; por conseguinte, a medição da produção, da quantidade e do tratamento destes metabolitos (por exemplo, SCFAs) in vivo continua a ser um desafio prático. De fato, modelos fisiológicos como animais e sujeitos humanos são críticos para determinar o papel do microbioma intestinal e sua modulação na saúde do hospedeiro, mas estes podem não ser adequados para a triagem em grande escala de diferentes tipos de moduladores de microbiomas devido à restrições éticas, monetárias ou temporais. Para este fim, os modelos in vitro e/ou ex vivo, como a cultura da microbiota intestinal in vitro e depois a intervenção com diferentes moduladores de microbiota, podem oferecer oportunidades de poupança de tempo e dinheiro e, portanto, podem permitir a triagem preliminar ou em grande escala de vários componentes (como probióticos, prebióticos e outros compostos intervencionistas) para examinar/prever seus efeitos sobre a diversidade de microbiota fecal, composição e perfis metabólicos. Estudos que utilizam tais sistemas in vitro e ex vivo do microbioma intestinal podem facilitar a compreensão das interações hospedeiro-microbioma que contribuem para a saúde e doença do hospedeiro, podendo também levar a encontrar novas terapias que visam o microbioma a melhorar a saúde do hospedeiro e prevenir e tratar várias doenças1.
Embora os sistemas in vitro da cultura da microbiota do intestino não possam verdadeiramente replicar as condições intestinais reais, diversos laboratórios esforçou-se para desenvolver tais modelos, alguns de que foram encontrados praticáveis até certo ponto e foram usados com sucesso para diferentes finalidades. Um dos modelos recentes do intestino é o simulador do ecossistema microbiano intestinal humano, que imita todo o trato gastrointestinal humano, incluindo o estômago, intestino delgado, e diferentes regiões do cólon. No entanto, tais modelos tecnicamente complexos podem não ser acessíveis a outras instalações de pesquisa em todo o mundo. Portanto, ainda há uma necessidade crítica para o desenvolvimento de novos modelos alternativos que são relativamente simples, acessíveis e práticos para laboratórios que estudam os moduladores de microbioma e seus efeitos na microbiota intestinal e na saúde do hospedeiro. Assim, o uso de um sistema de cultura da microbiota fecal in vitro (ou ex vivo) seria útil para o estudo dos efeitos de tais intervenções11,12. Especificamente, o efeito de diferentes prebióticos sobre a capacidade de fermentação da microbiota em termos de mudanças periódicas na diversidade e composição da microbiota intestinal, o pH fecal e os níveis de metabólitos microbianos, incluindo SCFAs e lactato, podem ser estudados 13. nisto, usando inulina (um dos componentes prebióticos mais estudados) como exemplo do modulador de microbioma, é descrito um protocolo passo a passo deste sistema simples de cultura de lotes ex vivo de microbiota para demonstrar seu uso para estimar a alterações na microbiota fecal e metabólitos microbianos após a intervenção com os moduladores de microbioma.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 </td>
			<td>TGI</td>
			<td>C2388</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2063450000</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-&#945;-methylbutyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W271918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovalerate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A18642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2&#8226;4H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin (Nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14366</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-valerate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-aminobenzoic acid</td>
			<td>MP China</td>
			<td>102569</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid (H3PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>206375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>148991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure magnetic purification beads</td>
			<td>Agencourt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber with incubatore</td>
			<td>Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina MiSeq sequencer</td>
			<td>Miseq reagent kit v3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PowerFecal kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit-3 fluorimeter</td>
			<td>InVitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters-2695 Alliance HPLC system</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota

O papel emergente do microbioma intestinal em várias doenças humanas exige um avanço de novas ferramentas, técnicas e tecnologias. Tais melhorias são necessárias para decifrar a utilização de moduladores de microbioma para benefícios de saúde humana. No entanto, a triagem de grande escala e a otimização de moduladores para validar a modulação de microbioma e prever benefícios de saúde relacionados podem ser praticamente difíceis devido à necessidade de grande número de animais e/ou indivíduos humanos. Para este fim, os modelos in vitro ou ex vivo podem facilitar a triagem preliminar de moduladores de microbioma. Nisto, é otimizado e demonstrou um sistema de cultura de microbiota fecal ex vivo que pode ser usado para examinar os efeitos de várias intervenções de moduladores de microbioma intestinal, incluindo probióticos, prebióticos e outros ingredientes alimentares, além de nutracêuticos e drogas, sobre a diversidade e composição da microbiota intestinal humana. A inulina, um dos compostos prebióticos mais estudados e moduladores de microbioma, é utilizada como exemplo aqui para examinar seu efeito sobre a composição saudável da microbiota fecal e suas atividades metabólicas, como o pH fecal e os níveis fecais de ácidos orgânicos incluindo lactato e ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). O protocolo pode ser útil para estudos que visem estimar os efeitos de diferentes intervenções de moduladores nos perfis de microbiota fecal e prever seus impactos na saúde.

O protocolo é utilizado para demonstrar o efeito de um prebiótico específico (i.e., inulina sobre a composição da microbiota e atividades metabólicas em termos de alterações no pH fecal e a concentração de lactato e SCFAs nas fezes de indivíduos saudáveis humanos ao longo diferentes pontos de tempo após o tratamento com inulina). O pH fecal, os níveis fecais de lactato e SCFAs (Figura 1) e a composição da microbiota (figura<strong class="xfig"...

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An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Este protocolo descreve um sistema de fermentação em lote-cultura in vitro de microbiota fecal humana, utilizando inulina (um prebiótico bem conhecido e um dos moduladores de microbiota mais amplamente estudados) para demonstrar o uso deste sistema na estimativa de efeitos de intervenções sobre a composição da microbiota fecal e atividades metabólicas.

Um modelo de cultura em lote in vitro para estimar os efeitos dos regimes intervencionistas na microbiota fecal humana

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Considerando o papel emergente do microbioma intestinal em várias doenças humanas, vários moduladores de microbioma intestinal, como probióticos, prebióticos, dietas e drogas podem ajudar na amenização de doenças de saúde associadas ao microbioma intestinal. No entanto, nenhum sistema de triagem rápido e acessível está disponível para prever os efeitos desses moduladores de microbioma intestinal, mas este sistema é simples o suficiente para prever como intervenções particulares podem impactar o microbioma intestinal que, em última análise, pode impactar a saúde do hospedeiro. Este protocolo é simples, acessível e prático para laboratórios que investigam os moduladores de microbioma intestinal e seus efeitos sobre a microbiota e a saúde do hospedeiro.A manutenção de condições assépticas e anaeróbicas é crucial para este experimento. Além disso, o espécime fecal deve ser usado de novo, imediatamente após a coleta. Caso contrário, se o experimento for planejado posteriormente, a amostra deve ser armazenada a menos 80 imediatamente após a coleta, sem qualquer exposição à temperatura ambiente e ao ar.A precisão de manuseio durante a preparação e a pipetação também é importante para manter a precisão e a reprodutibilidade. Levará menos de 12 horas durante o dia. Podemos construir uma cultura da noite para o dia se precisarem das amostras em 24 horas.Em seguida, seguido pelos ácidos graxos de cadeia curta e pela determinação do microbioma. Este processo será demonstrado por dois grandes estudantes da uni, Shokouh Ahmadi e Rabina Mainali do meu laboratório. Para preparar a mídia de fermentação sob uma capa de fumaça, em uma garrafa de reagente na mistura de ímã, misture a solução A, a solução mineral de traço, a solução mineral tracelada, a solução de vitaminas solúveis em água, a solução de biotina de folato, a solução de riboflavina, a solução de hemin, a mistura de ácidos graxos de cadeia curta e a resazurina.Em seguida, adicione no extrato de levedura da garrafa, carbonato de sódio, monohidroide de cloridrato de cisteína, e tripectose. Adicione 296,1 mililitros de água destilada, ajuste o pH com um cloridrato normal ou hidróxido de sódio para garantir que esteja em torno de 7,0. Transfira o béquer para uma estação de trabalho asséptica e use um filtro de vácuo com tamanho de poros a 0,22 micrômetros para filtrar a mídia para esterilizar.Para preparar uma solução de diluição anaeróbica de litro, dissolva cinco gramas de cloreto de sódio, dois gramas de glicose e 0,3 gramas de monohidrato de cloridrato de cínstea na água ionizada. Autoclave a garrafa de reagente com tampa a 121,1 graus Celsius por 15 minutos, e armazene-a dentro da câmara anaeróbica. Antes do início do experimento de fermentação, mantenha todos os materiais, soluções e ferramentas necessários para o experimento de fermentação dentro da câmara anaeróbica por pelo menos 48 horas, para garantir que qualquer oxigênio resíduo seja removido.Pelo menos 24 horas antes do experimento de fermentação, pesar 300 miligramas de inulina, e transferi-lo para um tubo de 50 mililitros, que é então colocado dentro da câmara anaeróbica. Adicione 26 mililitros de fermentação esterilizada no tubo e vórtice para misturar. Permitir a hidratação da fibra por aproximadamente 24 horas.O dia do experimento de fermentação, prepare o inóculo fecal. Primeiro, pesar cinco gramas de amostra fecal fresca em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione a solução de diluição anaeróbica ao tubo para atingir um volume final de 50 mililitros.Vórtice por 15 minutos, ou até que completamente homogeneizado. Mantenha os tubos inoculados a 37 graus Celsius dentro da câmara anaeróbica, e inverta suavemente uma vez a cada hora para resuspensar as fibras e o inóculo. Depois de três, seis, nove ou 24 horas, tire a quantidade adequada de mídia fermentada, e centrifugar as amostras a 14.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Congele imediatamente o supernascer e a pelota em nitrogênio líquido, depois de congelar, armazene o supernacido para análise de ácidos graxos de cadeia curta e pelota para análise de microbioma, a menos 80 graus Celsius. Este protocolo é usado para demonstrar o efeito de um prebiótico específico. As fezes de indivíduos humanos saudáveis, após o tratamento com inulina, apresentaram pH relativamente estável por nove horas, enquanto caíram drasticamente após 24 horas.A inoculação da inulina aumentou significativamente os níveis de ácidos graxos de cadeia curta e lactato em amostra fecal tratada com inulina é comparada com a cultura de microbiota fecal não tratada. A análise principal das coordenadas mostra diferentes a composição da microbiota às medidas unifrac ponderadas e não ponderadas da diversidade beta entre amostras tratadas com inulina e amostras não tratadas. Índices de diversidade alfa versus diversidade filogenética através de árvores inteiras de DP, riqueza de espécies, unidades taxonômicas operacionais, semelhança de espécies, bem como abundância relativa de filos e gêneros principais, todos apresentam diferentes assinaturas de microbiota intestinal entre amostras tratadas com inulina e amostras não tratadas.O cladograma taxonômico, derivado da análise do tamanho do efeito discriminante linear das sequências 16S, representa a taxa diferencialmente abundante entre diferentes grupos de amostras. Siga todos os passos com cuidado. O mais importante é manter rigorosas condições assépticas e anaeróbicas.O supernascido e do experimento pode ser usado para tratar mudanças de nível de ácidos graxos de cadeia curta como resultado da fermentação baseada em fibras. Além disso, o na pelota pode ser usado para analisar as alterações na composição do microbioma intestinal. Alguns produtos químicos usados para fazer a mídia cultural são potencialmente perigosos.Por favor, a folha MSDS e tome precauções em conformidade.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

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Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Imunologia e Infecção

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

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A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

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