Name: an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota
Uploaded: 2019-07-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

Författarna erkänner tacksamt finansiering stöd från centrum för diabetes, fetma och metabolism och den kliniska och translationella Science Center, Wake Forest School of Medicine, Department of Defense finansiering (Grant Number: W81XWH-18-1-0118), den Kermit Glenn Phillips II stol i kardiovaskulär medicin; de nationella instituten för hälso-finansierade Claude D. Pepper äldre amerikaner Center (finansierat av P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 och den kliniska och translationella Science Center (klinisk forskningsenhet, finansierad av UL1TR001420), är också tack och lov erkänt. Vi tackar också volontärer för att tillhandahålla fekal prover, och våra andra Lab medlemmar för deras tekniska hjälper under detta experiment.

FÖRSIKTIGHET: konsultera lämpliga material säkerhets data blad och följ instruktionerna och riktlinjerna för lämplig utbildning i biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). Följ alla odlings stegen enligt de vanliga biosäkerhets reglerna och Använd ett BSL-2-skåp med aseptiska förhållanden. Dessutom kan fekala prover från olika modeller och försökspersoner ha potentiell risk för spridning av mikrobiella sjukdomar. Omedelbart söka medicinsk hjälp i händelse av skada och infektion. Dessutom bör användningen av avf?...

<ol>
	<li>Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiome+in+health+and+in+disease.">The gut microbiome in health and in disease.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).</li><li>Xu, Z., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+effects+on+human+gut+microbiome+diversity.">Dietary effects on human gut microbiome diversity.</a> British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).</li><li>Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+and+Alzheimer&#8217;s+disease.">The gut microbiota and Alzheimer&#8217;s disease.</a> Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).</li><li>Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+gut+microbiota+on+human+health:+an+integrative+view.">The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view.</a> The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).</li><li>Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+mediated+modulation+of+gut+flora+might+be+biotherapeutical+approach+obesity+and+type+2+diabetes.">Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes.</a> Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).</li><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+Polysaccharides+in+the+Amelioration+of+Gut+Microbiome+Dysbiosis+and+Metabolic+Diseases.">Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases.</a> Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-Linked+Gut+Microbiome+Dysbiosis+Associated+with+Derangements+in+Gut+Permeability+and+Intestinal+Cellular+Homeostasis+Independent+of+Diet.">Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet.</a> Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).</li><li>Paul, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+diet+and+the+gut+microbiome+on+epigenetic+modulation+in+cancer+and+other+diseases.">Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases.</a> Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).</li><li>O&#8217;mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+tryptophan+metabolism+and+the+brain-gut-microbiome+axis.">Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis.</a> Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).</li><li>Sharon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+metabolites+from+the+microbiome+in+health+and+disease.">Specialized metabolites from the microbiome in health and disease.</a> Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).</li><li>Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+digestion+and+fermentation+characteristics+of+temulose+molasses,+a+coproduct+of+fiberboard+production,+and+select+temulose+fractions+using+canine+fecal+inoculum.">In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum.</a> Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).</li><li>Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetable+fiber+fermentation+by+human+fecal+bacteria:+cell+wall+polysaccharide+disappearance+and+short-chain+fatty+acid+production+during+in+vitro+fermentation+and+water-holding+capacity+of+unfermented+residues.">Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues.</a> Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-origin+probiotic+cocktail+increases+short-chain+fatty+acid+production+via+modulation+of+mice+and+human+gut+microbiome.">Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+microbiome+signatures+and+short-chain+fatty+acids+in+mouse,+rat,+non-human+primate+and+human+feces.">Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).</li><li>Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced+decreases+in+the+levels+of+microbial-derived+short-chain+fatty+acids+promote+gastrointestinal+colonization+of+Candida+albicans.">Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans.</a> bioRxiv. , 428474 (2018).</li><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prebiotics+from+acorn+and+sago+prevent+high-fat+diet-induced+insulin+resistance+via+microbiome-gut-brain+axis+modulation.">Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).</li><li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+Microbiome+Composition+in+Non-human+Primates+Consuming+a+Western+or+Mediterranean+Diet.">Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Garcia-Villalba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+method+for+gas+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+short-chain+fatty+acids+in+faecal+samples.">Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples.</a> Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+vs+Fresh+Fecal+Microbiota+Transplantation+and+Clinical+Resolution+of+Diarrhea+in+Patients+With+Recurrent+Clostridium+difficile+Infection:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).</li><li>Chen, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+xylooligosaccharides+produced+from+Miscanthus&#215;+giganteus+by+human+fecal+microbiota.">In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus&#215; giganteus by human fecal microbiota.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).</li><li>Cook, S., Sellin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">Short chain fatty acids in health and disease.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).</li><li>Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbes+and+health:+a+focus+on+the+mechanisms+linking+microbes,+obesity,+and+related+disorders.">Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders.</a> Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-mediated+nourishment+of+gut+microbiota+protects+against+diet-induced+obesity+by+restoring+IL-22-mediated+colonic+health.">Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health.</a> Cell Host &amp; Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).</li><li>Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut&#8211;brain+axis+in+2016:+Brain&#8211;gut&#8211;microbiota+axis&#8212;mood,+metabolism+and+behaviour.">Gut&#8211;brain axis in 2016: Brain&#8211;gut&#8211;microbiota axis&#8212;mood, metabolism and behaviour.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 69 (2017).</li></ol>

Den in vitro fekal flytgödsel jäsning modell som presenteras här är en enkel enda sats modell för att approximera effekterna av olika substrat och mikrobiella stammar (t. ex., prebiotika och probiotika) på sammansättningen av mänskliga fekal bakterieflora samt dess metaboliska aktiviteter i form av fekal pH och SCFAs nivåer. De resultat som presenteras häri visar att inympningen av inulin minskar fekal pH och signifikant ökar nivåerna av SCFAs och laktat i inulin-behandlade fekal prov jämfört med icke-behan...

Den mänskliga bakterieflora är en komplex gemenskap bestående av bakterier, Archaea, virus och eukaryota mikrober1, som lever i den mänskliga kroppen internt och externt. De senaste bevisen har fastställt den grundläggande roll som Gut bakterieflora och Gut mikrobiomet (hela samlingen av mikrober och deras gener som finns i den mänskliga mag-tarmkanalen) i olika mänskliga sjukdomar, inklusive fetma, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar och cancer1,2,3. Dessutom, de mikroorganismer som lever i vår Gut producera ett brett spektrum av metaboliter som signifikant påverkar vår hälsa och kan också bidra till patofysiologin av flera sjukdomar samt en mängd metabola funktioner4, 5. onormala förändringar (perturbationer) i sammansättningen och funktionen av denna Gut mikrobiella populationen betecknas allmänt som "Gut dysbios". Dysbios är vanligtvis förknippad med ett ohälsosamt tillstånd av värden och därmed kan skiljas från den normala (homeostatiska) mikrobiell gemenskap som är associerad med en hälsosam kontroll tillstånd av värden. Specifika mönster av Gut mikrobiomet dysbios finns ofta i olika olika sjukdomar1,2,3,6,7.
Jäsning av osmält mat, särskilt jäsbara kolhydrater/fibrer, genom tarmen bakterieflora inte bara ger energi utan också producerar olika metaboliter inklusive kortkedjiga fettsyror (scfas), laktat, formate, koldioxid, metan, väte och etanol6. Dessutom, den Gut bakterieflora producerar också ett antal andra bioaktiva substanser såsom folat, biotin, trimethylamine-N-oxid, serotonin, tryptofan, gamma-aminosmörsyra, dopamin, noradrenalin, acetylkolin, histamin, deoxycholsyra och 4-etylfenylsulfat. Detta sker främst genom utnyttjande av inneboende metaboliska flöden inom värd-Microbe nisch, som bidrar i flera kroppens processer, metaboliska funktioner och epigenetiska förändringar1,8,9, 10. Effekterna av olika interventioner på sådana mikrobiella produkter förblir dock otydliga eller oklara på grund av bristen på enkla, effektiva och reproducerbara protokoll. Sammansättningen av Human Gut bakterieflora är ett mycket komplext och mångsidigt ekosystem, och därför är många frågor om dess roll i människans hälsa och sjukdoms patologi fortfarande obesvarade. Effekterna av många vanliga Gut mikrobiomet modulatorer (t. ex., probiotika, prebiotika, antibiotika, fekal transplantation och infektioner) på sammansättningen och metaboliska funktioner i tarmbakterieflora fortfarande i stort sett svårfångade. Dessutom är det svårt att undersöka och validera dessa effekter in vivo, särskilt eftersom de flesta av de näringsämnen och metaboliter som produceras i tarmfloran absorberas eller bortskaffas samtidigt och snabbt i tarmen. Därför är det fortfarande en praktisk utmaning att mäta produktionen, mängden och bearbetningen av dessa metaboliter (t. ex. SCFAs) in vivo. Faktum är att fysiologiska modeller som djur och försökspersoner är avgörande för att fastställa den roll som Gut mikrobiomet och dess modulering på värd hälsan, men dessa kanske inte lämpar sig för storskalig screening av olika typer av mikrobiomet modulatorer på grund av etiska, monetära eller tidsbegränsningar. I detta syfte kan in vitro-och/eller ex vivo-modeller, såsom odling av tarmfloran in vitro och sedan ingripa med olika Mikrobiota-modulatorer, erbjuda tids-och penga sparande möjligheter och kan därför möjliggöra preliminär eller storskalig screening av olika komponenter (såsom probiotika, prebiotika, och andra interventionella föreningar) att undersöka/förutsäga deras effekter på fekal bakterieflora mångfald, sammansättning och metabola profiler. Studier som använder sådana in vitro-och ex vivo-system i tarmen mikrobiome kan underlätta ytterligare förståelse av värd-mikrobiomet interaktioner som bidrar till värd hälsa och sjukdom, och kan också leda till att hitta nya terapier som riktar sig till mikrobiomet att förbättra värd hälsa och förebygga och behandla olika sjukdomar1.
Även om kultur systemen in vitro Gut bakterieflora inte riktigt kan replikera de faktiska tarm förhållandena har flera laboratorier strävat efter att utveckla sådana modeller, av vilka några har hittats praktiskt i viss utsträckning och har använts framgångsrikt för olika ändamål. En av de senaste Gut modellerna är simulatorn av människans intestinal mikrobiella ekosystem, som härmar hela människans mag-tarmkanalen, inklusive magen, tunntarm, och olika regioner i tjocktarmen. Sådana tekniskt komplicerade modeller kan dock inte vara tillgängliga för andra forskningsanläggningar över hela världen. Därför finns det fortfarande ett kritiskt behov av utveckling av nya alternativa modeller som är relativt enkla, överkomliga och praktiska för laboratorier som studerar mikrobiomet modulatorer och deras effekter på tarmfloran och värd hälsan. Därför skulle användningen av ett in vitro-(eller ex vivo) fekalt Mikrobiota-kultursystem vara användbart för att studera effekterna av sådana interventioner11,12. Specifikt, effekten av olika prebiotika på bakterieflora jäsning kapacitet i form av periodiska förändringar i tarmfloran mångfald och sammansättning, fekal pH, och nivåerna av mikrobiella metaboliter inklusive SCFAs och laktat kan studeras 13. häri, med hjälp av inulin (en av de mest studerade prebiotiska komponenter) som ett exempel på mikrobiomet modulator, ett steg-för-steg-protokoll i detta enkla ex vivo bakterieflora batch-kultursystem beskrivs för att visa dess användning för att uppskatta förändringar i fekal bakterieflora och mikrobiella metaboliter efter intervention med mikrobiomet modulatorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 </td>
			<td>TGI</td>
			<td>C2388</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2063450000</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-&#945;-methylbutyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W271918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8263</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovalerate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A18642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2&#8226;4H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacin (Nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A14366</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-valerate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-aminobenzoic acid</td>
			<td>MP China</td>
			<td>102569</td>
			<td>Toxic, Irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid (H3PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4&#8226;2H2O)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>206375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>148991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4&#8226;7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure magnetic purification beads</td>
			<td>Agencourt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber with incubatore</td>
			<td>Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina MiSeq sequencer</td>
			<td>Miseq reagent kit v3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PowerFecal kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit-3 fluorimeter</td>
			<td>InVitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters-2695 Alliance HPLC system</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro batch-culture model to estimate the effects of interventional regimens on human fecal microbiota

Den framväxande roll Gut mikrobiomet i flera mänskliga sjukdomar kräver ett genombrott av nya verktyg, tekniker och teknik. Sådana förbättringar behövs för att dechiffrera utnyttjandet av mikrobiomet modulatorer för människors hälsa fördelar. Men den storskaliga screening och optimering av modulatorer för att validera mikrobiomet modulering och förutsäga relaterade hälsofördelar kan vara praktiskt taget svårt på grund av behovet av ett stort antal djur och/eller försökspersoner. För detta ändamål kan in vitro-eller ex vivo-modeller underlätta preliminär screening av mikrobiomet modulatorer. Häri, det är optimerat och visat en ex vivo fekal bakterieflora kultur system som kan användas för att undersöka effekterna av olika ingrepp i Gut mikrobiomet modulatorer inklusive probiotika, prebiotika och andra livsmedelsingredienser, bortsett från nutraceuticals och droger, om mångfalden och sammansättningen av den mänskliga Gut bakterieflora. Inulin, en av de mest studerade prebiotiska föreningar och mikrobiomet modulatorer, används som ett exempel här för att undersöka dess effekt på friska fekal bakterieflora sammansättning och dess metaboliska aktiviteter, såsom fekal pH och fekal nivåer av organiska syror inklusive laktat och kortkedjiga fettsyror (SCFAs). Protokollet kan vara användbart för studier som syftar till att uppskatta effekterna av olika interventioner av modulatorer på fekal bakterieflora profiler och att förutsäga deras hälsoeffekter.

Protokollet används för att påvisa effekten av en specifik prebiotiska (dvs inulin på bakterieflora sammansättning och metaboliska aktiviteter i form av förändringar i fekal pH och koncentrationen av laktat och SCFAs i avföring från friska försökspersoner över olika tidpunkter efter behandling med inulin). Fekal pH, fekal nivåer av laktat och SCFAs (figur 1), och sammansättningen av bakterieflora (figur 2 och <stron...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota at JoVE.com

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Detta protokoll beskriver ett in vitro-system för jäsning av Human fekal bakterieflora, med hjälp av inulin (en välkänd prebiotika och en av de mest studerade Mikrobiota modulatorer) för att demonstrera användningen av detta system för att uppskatta effekterna av specifika interventioner på fekal bakterieflora sammansättning och metaboliska aktiviteter.

En in vitro-modell för att uppskatta effekterna av interventionella regimer på human fekal Microbiota

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Med tanke på den framväxande roll gut mikrobiomet i olika mänskliga sjukdomar, flera gut mikrobiomet modulatorer som probiotika, prebiotika, kostvanor och läkemedel kan hjälpa till att förbättra gut mikrobiomet-associerade hälsa sjukdomar. Men ingen snabb och prisvärd screening system finns tillgängliga för att förutsäga effekterna av sådana gut mikrobiomet modulatorer, men detta system är enkel nog att förutsäga hur vissa insatser kan påverka tarmmikrobiomet som i slutändan kan påverka värdhälsa. Detta protokoll är enkelt, prisvärt och praktiskt för laboratorier som undersöker modulatorerna för tarmmikromet och deras effekter på mikrobiota och värdhälsa.Underhåll av aseptiska och anaeroba förhållanden är avgörande för detta experiment. Även fekala exemplaret bör användas på nytt, omedelbart vid insamling. Annars om försöket planeras senare, bör provet förvaras vid minus 80 omedelbart vid insamling, utan någon exponering för omgivningstemperatur och luft.Hantering av noggrannhet under alikvot prepping och pipettering är också viktigt för att bibehålla noggrannhet och reproducerbarhet. Det kommer att ta mindre än 12 timmar på dagtid. Vi kan bygga en kultur över natten om de behöver proverna på 24 timmar.Därefter, följt av kortkedjiga fettsyror och mikrobiomet bestämning. Denna process kommer att demonstreras av två stora uni studenter, Shokouh Ahmadi och Rabina Mainali från mitt labb. För att förbereda fermentationsmedia under en fume huva, i en reagensflaska på magnetblandning, blanda lösning A, lösning B, spårminerallösning, vattenlöslig vitaminlösning, folatbiotinlösning, riboflavinlösning, heminlösning, kortkedjig fettsyrablandning och resazurin.Tillsätt sedan i flaskan jästextrakt, natriumkarbonat, cystein hydroklorid monohydrat, och trypticase. Tillsätt 296,1 milliliter destillerat vatten, justera pH-värdet med en normal hydroklorid eller natriumhydroxid för att säkerställa att det är runt 7,0. Överför bägaren till en aseptisk arbetsstation, och använd ett vakuumfilter med porstorlek vid 0,22 mikrometer för att filtrera media för sterilisering.För att förbereda en liter anaerob utspädningslösning, lös fem gram natriumklorid, två gram glukos och 0,3 gram cysteinhydrokloridmonhydrat i joniserat vatten. Autoklavera reagensflaskan med lock vid 121,1 grader Celsius i 15 minuter, och förvara den inuti den anaeroba kammaren. Innan jäsningsexperimentets början, förvara alla material, lösningar och verktyg som behövs för jäsningsexperimentet inne i den anaeroba kammaren i minst 48 timmar, för att säkerställa att eventuellt rester syre avlägsnas.Minst 24 timmar före jäsningsexperimentet, väga 300 milligram inulin, och överföra den till en 50 milliliter rör, som sedan placeras inuti den anaeroba kammaren. Tillsätt 26 milliliter steriliserade jäsningsmedia i röret, och virvel att blanda. Tillåt hydrering av fiber i cirka 24 timmar.Dagen för jäsningsexperimentet, förbered fekal inokulat. Först, väga fem gram färskt fekalt prov i en 50 milliliter konisk rör. Tillsätt anaerob utspädningslösning i röret för att nå en slutlig volym på 50 milliliter.Vortex i 15 minuter, eller tills helt homogeniserad. Håll de inokulerade rören på 37 grader Celsius inuti den anaeroba kammaren, och invertera försiktigt en gång i timmen för att återanvända fibrer och inokulat. Efter tre, sex, nio eller 24 timmar, ta ut rätt mängd jästa medier, och centrifugerna proverna på 14, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Omedelbart frysa supernatant och pellet i flytande kväve, sedan efter snap frysning, lagra supernatant för kortkedjade fettsyror analys, och pellet för mikrobiomet analys, på minus 80 grader Celsius. Detta protokoll används för att demonstrera effekten av en specifik prebiotisk. Avföring av friska mänskliga försökspersoner, efter behandling med inulin, visade relativt stabilt pH i nio timmar, medan sjönk dramatiskt efter 24 timmar.Inokulationen av inulin ökade signifikant nivåerna av kortkedjiga fettsyror och laktat i inulinbehandlade fekala exemplar jämförs med icke-behandlad fekal mikrobiotakultur. Principal samordna analys visar olika mikrobiota sammansättning till den viktade och oviktade UniFrac åtgärder av beta mångfald mellan inulin behandlade och obehandlade prover. Index för alfa mångfald kontra fylogenetiska mångfald genom PD hela träd, arter rikedom, operativa taxonomiska enheter, art jämnhet, liksom relativa överflöd av stora fyla och släkten, alla presentera olika gut mikrobiota signaturer mellan inulin behandlade och obehandlade prover.Taxonomiskt kladogram, som härrör från linjära diskriminant effekt storlek analys av 16S sekvenser, representerar differentially riklig taxa mellan olika grupper av prover. Följ alla steg noggrant. Viktigast är att upprätthålla strikta aseptiska och anaeroba förhållanden.Den supernatant och från experimentet kan användas för att behandla Short-chain fettsyror nivå förändringar som ett resultat av jäsningen baserad på fibrer. Dessutom kan i pelleten användas för att analysera förändringar i gut mikrobiomet sammansättning. Vissa kemikalier som används för att göra kulturmedia är potentiellt farliga.Vänligen MSDS-arket och vidta försiktighetsåtgärder i enlighet med detta.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Ett<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera skillnader mellan de mänskliga makrofagdifferentiering och polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersöka effekterna av probiotika på Pneumococcal Colonization Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adherensanalysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell för mätning av immunsvar mot malaria som led av HIV-infektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av blod-hjärnbarriären Använda impedans spektroskopi: Fokus på T-cell-endotelceller interaktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overuttryck och rening av människa<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferas i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Effekterna av smak signalering Protein Abolishment på Gut Inflammation i en musmodell för inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analys av interaktioner mellan Endobiotika och Human Gut Microbiota med in vitro-system för bad jäsning

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...