Klasse 1 histone deacetylases som RpdA diskuteres som potentielle nye mål for behandling af svampeinfektioner. Men, renset enzym aktiviteter er nødvendige for yderligere karakterisering. Den største fordel ved denne protokol er den hurtige og tilstrækkelige adskillelse af oprindelige TAP-mærkede komplekser til aktivitetsbestemmelse i et enkelt trin.
HDAC-komplekser afledt af denne protokol kan anvendes til effektscreening af nye svampespecifikke deactylasehæmmere. Denne metode danner grundlag for ekstraktion og rensning af TAP-mærkede svampeproteiner, som kan anvendes som udgangspunkt for etablering af protokoller for andre enzymer og stammer. For at påbegynde denne procedure tilsættes 10 milliliter CSS til hver kolbe af tilberedt conidia.
Luk hver kolbe tæt med den medfølgende skruelåg, og ryst kraftigt. Efter dette, bruge en steril vaccination loop til helt skrabe eventuelle resterende conidia. Conidia gennem 40-mikrometercellesier placeret på et centrifugerør og opsamles suspensionen fra fem af kolben i et rør.
Derefter centrifuge prøverne til at kombinere og fortynde prøverne som skitseret i tekstprotokollen. Første sted ostelærred i en tragt på toppen af en kolbe. Filtrer den forberedte mycelia gennem kluden og vask kort med deioniseret vand.
Fjern så meget fugt som muligt fra mycelia ved at klemme ostelærred mellem blot hænder og derefter mellem papirhåndklæder. Derefter overføres den tørrede mycelia som flade plader til et plastik bægerglas med et skruelåg. Brug flydende nitrogen, flash-fryse mycelia og gemme det på minus 80 grader Celsius før lyophilization.
Så lyophilize mycelia natten over. Den næste dag, stoppe fryse-tørring proces, når temperaturen i mykelia forbliver konstant. Fjern bægeret og forsegle dem straks med de medfølgende skruehætter.
Først tilføje 1,5 gram mycelia og en slibning bolden i slibning krukke af en kuglemølle. Grind mycelial pulver på 25 hertz i 30 sekunder og overføre mycelial pulver til en 15-milliliter centrifuge rør. Vip røret for at tillade efterfølgende blanding af mycelia med bufferen, tilsæt derefter seks milliliter iskold ekstraktionsbuffer B250, herunder 1X proteasehæmmercocktail, pr. gram mycelialt pulver og blend med en lille spatel, indtil fuldstændig homogenisering af det rå ekstrakt er opnået;hold røret på is i fem minutter.
Næste sted røret og en balance rør i en centrifuge og spin på 40, 000 gange g og ved fire grader Celsius i mindst 20 minutter. Under centrifugering, der er fastsat en 10-milliliter engangskromatografi kolonne til at begynde ækvivilibrering af IgG harpiks. Pipette 300 mikroliter af velopstolereret IgG harpiks i kolonnen.
Fyld kolonnen til 10 milliliter med B250 og lad bufferen flyde igennem ved tyngdekraften. Tilføj en milliliter B250, herunder 1X proteasehæmmercocktail, og lad den flyde igennem, og sæt derefter bunden af kolonnen til. Efter centrifugering, fjerne 10 mikroliter af supernatant for SDS-PAGE analyse.
Prøven anbringes i et 1,5 milliliterrør med 40 mikroliter vand og 12,5 mikroliter 5X LSB. Ved hjælp af en serologisk pipette fjernes supernatanten forsigtigt og overføres til kolonnen, der indeholder de ligevægtede IgG perler. Luk kolonnen ved at fastgøre den medfølgende endehætte tæt.
Til at begynde, inkubere kromatografi kolonne på en roterende mixer ved 10 rpm og ved fire grader Celsius i to til fire timer. Derefter skal du fjerne hætten og åbne kolonnen nederst for at indsamle flow-through. For at vaske kolonnen skal du bruge en pipetter til at tilføje en milliliter vaskebuffer 250 til søjlehætten for at fjerne eventuelle fanget perler og overføre denne suspension i en flush på den afregnede harpiks for at opbruge perlerne.
Fyld derefter kolonnen op til toppen med vaskebuffer 250 og luk den ved hjælp af en stakhætte forbundet til en peristaltisk pumpe. Start peristaltiske pumpe og justere pumpen til en strømningshastighed på ca. en til fem milliliter i minuttet, gentag denne vaskeproces for i alt fire vaske, og gentag derefter denne vaskeproces tre gange ved hjælp af TEV equilibration buffer. Luk kromatografikolonnen nederst.
Resuspend IgG perler i en milliliter TEV spaltning buffer og tilsæt 20 mikroliter af 50X protease hæmmer cocktail samt 10 mikroliter TEV. Næste cap kolonnen og inkubere på en roterende mixer ved 10 rpm og ved fire grader Celsius natten til elute proteinkomplekser bundet via den mærkede HDAC. Den næste dag, åbne kolonnen og indsamle eluat i en to-milliliter centrifuge rør.
Brug 0,7 milliliter TEV spaltning buffer til at fjerne perlerne fra hætten og til at skylle væggen af kolonnen. Anbring centrifugerøret på to milliliter i et 50-millilitercentrifugerør, og kolonnen anbringes derefter på det åbne to milliliterrør. Overfør hele denne samling på en bordplade centrifuge og spin ved 300 gange g i to minutter for at opnå TEV eluate.
I denne undersøgelse udføres en et-trins berigelse af en TAP-mærket klasse 1 HDAC fra den filamentøse svamp Aspergillus nidulans til vurdering af in vitro deactylase aktivitet. Et typisk resultat af dette illustrerer klart effekten af det første affinitetstrin, som øges yderligere, når tandemrensningen udføres. De fleste af de fremtrædende proteiner til stede i proteinekstraktet og flow-through, dog allerede er forarmet i TEV eluate.
En immunoblot viser stærke signaler, der migrerer ved ca. 120 kilodalton svarende til CBP-mærket RpdA i TEV-eluatet, calmodulingennemstrømningen og eluatfraktioner. En repræsentativ deactylase aktivitetsanalyse med den specifikke HDAC-hæmmer Trichostatin A vises her. Aktivitetens følsomhed bekræfter, at de målte værdier skyldes RpdA og ikke er forårsaget af uspecifik proteaseaktivitet.
Dette er vigtigt, da det indikerer, at TEV protease, som er til stede ved temmelig høj koncentration, ikke forstyrrer HDAC aktivitetsanalyse. Interessant, HDAC aktivitet er væsentligt reduceret efter den anden affinitet rensning trin, CE, sammenlignet med TEV eluate. For at muliggøre effektiv proteinekstraktion skal du sikre, at mycelia er malet til fint pulver.
Dette er især kritisk, når ingen maskine er til rådighed, og mørtel og støder bruges til slibning. Tilføjelsen af det andet affinitetstrin til protokollen resulterer i fraktioner, der er rene nok til proteinidentifikation, men udført på massespektrometri. Når du arbejder med flydende nitrogen, skal du sørge for at bære sikkerhedsbriller og beskyttelseshandsker for at undgå personskade.
