6.4K Views
•
09:07 min
•
May 1st, 2019
DOI :
May 1st, 2019
•0:04
Title
0:53
Inoculum Preparation
1:34
Growth and Harvesting of Mycelia
2:36
Preparation of the Protein Extract and Equilibration of the IgG Resin
4:40
Batch Purification of TAP-tagged HDAC
6:50
Results: Analysis of the Purification and Enzymatic Activity Assay
8:29
Conclusion
Transcript
आरपीए जैसे कक्षा 1 हिस्टोन deacetylases फंगल संक्रमण के उपचार के लिए संभावित उपन्यास लक्ष्यों के रूप में चर्चा कर रहे हैं । हालांकि, आगे के लक्षण वर्णन के लिए शुद्ध एंजाइम गतिविधियों की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ एक ही चरण में गतिविधि निर्धारण के लिए देशी नल-टैग किए गए परिसरों का तेजी से और पर्याप्त पृथक्करण है।
इस प्रोटोकॉल से प्राप्त एचडीएसी परिसरों का उपयोग उपन्यास फंगल-विशिष्ट डिक्टाइलीज अवरोधकों की प्रभावकारिता स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है। यह विधि टैप-टैग किए गए फंगल प्रोटीन के निष्कर्षण और शुद्धिकरण का आधार प्रदान करती है, जिसका उपयोग अन्य एंजाइमों और उपभेदों के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में किया जा सकता है। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, तैयार कोनिडिया के प्रत्येक फ्लास्क में सीएसएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
प्रदान की गई स्क्रू कैप के साथ प्रत्येक फ्लास्क को कसकर बंद करें और सख्ती से हिलाएं। इसके बाद, किसी भी शेष कोनिडिया को पूरी तरह से कुरेदने के लिए बाँझ टीका लूप का उपयोग करें। एक अपकेंद्रित्र ट्यूब पर रखे गए 40-माइक्रोमीटर सेल छन्नी के माध्यम से कोनिडिया पास करें और पांच फ्लास्क से निलंबन को एक ट्यूब में एकत्र करें।
फिर पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित नमूनों को संयोजित और पतला करने के लिए नमूनों को अपक्रेस करें। एक फ्लास्क के शीर्ष पर एक कीप में पहली जगह चीज़क्लोथ। तैयार माइसेलिया को कपड़े के माध्यम से फ़िल्टर करें और डिएकाइज्ड पानी से संक्षेप में धोएं।
सिर्फ हाथों के बीच और फिर कागज तौलिए के बीच चीज़क्लोथ निचोड़कर मायसेलिया से जितना संभव हो उतना नमी निकालें। इसके बाद, सूखे माइसेलिया को एक प्लास्टिक बीकर में एक स्क्रू ढक्कन के साथ फ्लैट शीट के रूप में स्थानांतरित करें। तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके, माइकेलिया को फ्लैश-फ्रीज करें और इसे लिओफिलाइजेशन से पहले शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
फिर रातोंरात मायसेलिया को लिओफिलाइज करें। अगले दिन, फ्रीज सुखाने की प्रक्रिया को रोकें जब माइसेलिया का तापमान स्थिर रहता है। बीकर्स को हटा दें और तुरंत उन्हें प्रदान किए गए स्क्रू कैप के साथ सील करें।
सबसे पहले एक बॉल मिल के पीसने वाले जार में 1.5 ग्राम माइसेलिया और एक पीसने वाली गेंद डालें। माइसेसेलिक पाउडर को 25 हर्ट्ज पर 30 सेकंड के लिए पीस लें और माइसेल पाउडर को 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में ट्रांसफर करें । बफर के साथ माइसेलिया के बाद के मिश्रण की अनुमति देने के लिए ट्यूब को झुकाएं, फिर बर्फ-ठंडे निष्कर्षण बफर बी 250 के छह मिलीलीटर जोड़ें, जिसमें 1X प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल, प्रति ग्राम माइस्शेशियल पाउडर और मिश्रण शामिल हैं जब तक कि कच्चे तेल के अर्क का पूर्ण समरूपीकरण हासिल न हो जाए; ट्यूब को पांच मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
अगले एक अपकेंद्रित्र में ट्यूब और एक संतुलन ट्यूब जगह है और ४०, 000 बार जी पर स्पिन और कम से 20 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर । अपकेंद्रित्र के दौरान, आईजीजी राल को बराबरी से शुरू करने के लिए 10 मिलीलीटर डिस्पोजेबल क्रोमेटोग्राफी कॉलम निर्धारित करें। पिपेट कॉलम में अच्छी तरह से निलंबित आईजीजी राल के 300 माइक्रोलीटर।
B250 के साथ 10 मिलीलीटर के लिए कॉलम भरें और गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से बफर प्रवाह करते हैं । 1X प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल सहित B250 का एक मिलीलीटर जोड़ें और इसे प्रवाहित होने दें, फिर कॉलम के नीचे प्लग करें। अपकेंद्रित्र के बाद, एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए सुपरनेट के 10 माइक्रोलीटर निकालें।
नमूना 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें जिसमें 40 माइक्रोलीटर पानी और 5X एलएसबी के 12.5 माइक्रोलीटर शामिल हैं। एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, सावधानी से सुपरनेट को हटा दें और इसे समतुलीकृत आईजीजी मोतियों वाले कॉलम पर स्थानांतरित करें। प्रदान की गई एंड कैप को कसकर सुरक्षित करके कॉलम को बंद करें।
शुरू करने के लिए, 10 आरपीएम पर एक रोटरी मिक्सर पर क्रोमेटोग्राफी कॉलम और दो से चार घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । इसके बाद, टोपी निकालें और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने के लिए नीचे कॉलम खोलें। कॉलम को धोने के लिए, किसी भी फंसे हुए मोतियों को हटाने और मोतियों को फिर से खर्च करने के लिए बसे राल पर एक फ्लश में इस निलंबन को स्थानांतरित करने के लिए कॉलम कैप में बफर 250 धोने के एक मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक पिपेटर का उपयोग करें।
फिर बफर 250 धोने के साथ शीर्ष तक कॉलम भरें और एक पेरिस्टाल्टिक पंप से जुड़े स्टैक कैप का उपयोग करके इसे बंद करें। पेरिस्टाल्टिक पंप शुरू करें और पंप को प्रति मिनट लगभग एक से पांच मिलीलीटर की प्रवाह दर में समायोजित करें, कुल चार वॉश के लिए इस धोने की प्रक्रिया को दोहराएं, फिर टीईवी संतुलन बफर का उपयोग करके इस धोने की प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं। नीचे क्रोमेटोग्राफी कॉलम बंद करें।
टीईवी क्लीवेज बफर के एक मिलीलीटर में आईजीजी मोतियों को फिर से खर्च करें और 50X प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल के 20 माइक्रोलीटर के साथ-साथ तेव के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। अगले 10 आरपीएम पर एक रोटरी मिक्सर पर कॉलम और इनक्यूबेट टोपी और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर टैग HDAC के माध्यम से बंधे प्रोटीन परिसरों elute । अगले दिन, कॉलम खोलें और दो मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में एलुएट इकट्ठा करें।
टोपी से मोतियों को हटाने और कॉलम की दीवार को कुल्ला करने के लिए तेवी क्लीवेज बफर के 0.7 मिलीलीटर का उपयोग करें। दो मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब को 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें और फिर कॉलम को खुले दो मिलीलीटर ट्यूब पर रखें। इस पूरी असेंबली को एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र पर स्थानांतरित करें और टीईवी एलुएट प्राप्त करने के लिए दो मिनट के लिए 300 बार जी पर स्पिन करें।
इस अध्ययन में, इन विट्रो डिक्टाइलेज गतिविधि के मूल्यांकन के लिए फिलामेंटस फंगस एस्परगिलस निदुलन्स से टैप-टैग कक्षा 1 एचडीएसी का एक कदम संवर्धन किया जाता है। इसका एक विशिष्ट परिणाम स्पष्ट रूप से पहले आत्मीयता कदम की प्रभावकारिता को दर्शाता है, जो मिलकर शुद्धिकरण करते समय और भी बढ़ जाता है। प्रोटीन निकालने और प्रवाह के माध्यम से मौजूद अधिकांश प्रमुख प्रोटीन, हालांकि, पहले से ही TEV eluate में समाप्त हो रहे हैं ।
एक इम्यूनोब्लॉट टीईवी एलुएट में सीबीपी-टैग पूर्ण लंबाई आरपीए के अनुरूप लगभग 120 किलोदलटन पर माइग्रेट करने वाले मजबूत संकेतों को दिखाता है, शांत-प्रवाह के माध्यम से, और अंशों को एल्यूएट करें। विशिष्ट एचडीएसी अवरोधक ट्राइकोस्टेटिन ए के साथ एक प्रतिनिधि डिक्टाइल्स गतिविधि परख यहां दिखाई गई है। गतिविधि की संवेदनशीलता इस बात की पुष्टि करती है कि मापा गया मूल्य आरपीडीए के कारण होता है और अविशिष्ट प्रोटीज गतिविधि के कारण नहीं होता है।
यह महत्वपूर्ण है क्योंकि यह इंगित करता है कि तेईव प्रोटीज, जो उच्च एकाग्रता पर मौजूद है, एचडीएसी गतिविधि परख में हस्तक्षेप नहीं करता है। दिलचस्प बात यह है कि टीईवी एलुएट की तुलना में दूसरे आत्मीयता शुद्धिकरण कदम, सीई के बाद एचडीएसी गतिविधि काफी कम हो जाती है। कुशल प्रोटीन निष्कर्षण की अनुमति देने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि माइसेलिया ठीक पाउडर के लिए जमीन हैं।
यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब कोई मशीन उपलब्ध नहीं है और मोर्टार और मूसल पीसने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रोटोकॉल के लिए दूसरे आत्मीयता कदम के अलावा प्रोटीन पहचान के लिए पर्याप्त शुद्ध अंश में परिणाम है, लेकिन बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री पर किया । तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय, व्यक्तिगत चोट से बचने के लिए सुरक्षा चश्मे और सुरक्षात्मक दस्ताने पहनना सुनिश्चित करें।
RpdA की तरह कक्षा 1 हिटोन deacetylases (HDACs) संभावित लक्ष्य के रूप में फंगल संक्रमण के इलाज के महत्व को प्राप्त किया है । यहां हम नल के विशिष्ट संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल-टैग की गईं एक hdac गतिविधि परख कि हिस्टोन deacetylase अवरोधकों की विट्रो प्रभावकारिता परीक्षण में अनुमति देता है के साथ संयुक्त rpda ।
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved