Klasse 1 histone deacetylases som RpdA diskuteres som potensielle nye mål for behandling av soppinfeksjoner. Imidlertid er rensede enzymaktiviteter nødvendig for videre karakterisering. Den største fordelen med denne protokollen er rask og tilstrekkelig separasjon av innfødte TAP-merkede komplekser for aktivitetsbestemmelse i ett enkelt trinn.
HDAC-komplekser avledet fra denne protokollen kan brukes til effektscreening av nye soppspesifikke deactylasehemmere. Denne metoden gir grunnlag for utvinning og rensing av TAP-merkede soppproteiner, som kan brukes som utgangspunkt for etablering av protokoller for andre enzymer og stammer. For å begynne denne prosedyren, legg til 10 milliliter CSS til hver kolbe forberedt conidia.
Lukk hver kolbe tett med den medfølgende skrukorken og rist kraftig. Etter dette, bruk en steril inokulasjonssløyfe for å fullstendig skrape av eventuell gjenværende conidia. Før konidiaen gjennom 40-mikrometercellesiler plassert på et sentrifugerør og samle suspensjonen fra fem av kolben til ett rør.
Sentrifuger deretter prøvene for å kombinere og fortynne prøvene som beskrevet i tekstprotokollen. Først legger du osteklut i en trakt på toppen av en kolbe. Filtrer den tilberedte myceliaen gjennom kluten og vask kort med avionisert vann.
Fjern så mye fuktighet som mulig fra mycelia ved å klemme ostekluten mellom bare hender og deretter mellom papirhåndklær. Etter dette overfører du den tørkede myceliaen som flate ark til et plastbeger med skrulokk. Ved hjelp av flytende nitrogen, flash-fryse mycelia og lagre den på minus 80 grader Celsius før lyofilisering.
Så lyophilize mycelia over natten. Neste dag, stopp frysetørkeprosessen når temperaturen på mycelia forblir konstant. Fjern begerbegeret og forsegle dem umiddelbart med de medfølgende skrukorkene.
Tilsett først 1,5 gram mycelia og en slipeball i slipekrukken på en kulemølle. Grind mycelial pulveret på 25 hertz i 30 sekunder og overfør mycelial pulver til en 15-milliliter sentrifuge rør. Vipp røret for å tillate etterfølgende blanding av mycelia med bufferen, og tilsett deretter seks milliliter iskald ekstraksjonsbuffer B250, inkludert 1X proteasehemmercocktail, per gram mycelial pulver og bland med en liten slikkepott til fullstendig homogenisering av råoljeekstraktet oppnås;hold røret på is i fem minutter.
Deretter plasserer røret og et balanserør i en sentrifuge og spinner på 40 000 ganger g og ved fire grader Celsius i minst 20 minutter. Under sentrifugeringen, sette ut en 10-milliliter disponibel kromatografi kolonne for å begynne likevekt IgG harpiks. Pipette 300 mikroliter med godt resuspended IgG harpiks inn i kolonnen.
Fyll kolonnen til 10 milliliter med B250 og la bufferen strømme gjennom av tyngdekraften. Tilsett en milliliter B250, inkludert 1X proteasehemmercocktail og la den strømme gjennom, og koble deretter bunnen av kolonnen. Etter sentrifugeringen fjerner du 10 mikroliter av supernatanten for SDS-PAGE-analyse.
Plasser prøven i et 1,5 milliliter rør som inneholder 40 mikroliter vann og 12,5 mikroliter 5X LSB. Bruk en serologisk pipette, fjern forsiktig overnatanten og overfør den til kolonnen som inneholder de likeliberte IgG-perlene. Lukk kolonnen ved å feste den medfølgende endehetten tett.
For å begynne, inkuber kromatografikolonnen på en roterende mikser ved 10 rpm og ved fire grader Celsius i to til fire timer. Deretter fjerner du hetten og åpner kolonnen nederst for å samle inn gjennomstrømningen. For å vaske kolonnen, bruk en pipetter til å legge til en milliliter vaskebuffer 250 til kolonnehetten for å fjerne eventuelle fanget perler og overføre denne suspensjonen i en flush på den avgjorte harpiksen for å gjenopplive perlene.
Fyll deretter kolonnen opp til toppen med vaskebuffer 250 og lukk den ved hjelp av en stabelhette koblet til en peristaltisk pumpe. Start den peristaltiske pumpen og juster pumpen til en strømningshastighet på omtrent en til fem milliliter per minutt, gjenta denne vaskeprosessen for totalt fire vasker, og gjenta deretter denne vaskeprosessen tre ganger ved hjelp av TEV-likevektsbuffer. Lukk kromatografikolonnen nederst.
Resuspend IgG perler i en milliliter TEV cleavage buffer og legge til 20 mikroliter av 50X protease inhibitor cocktail samt 10 mikroliter TEV. Neste cap kolonnen og inkubere på en roterende mikser på 10 rpm og ved fire grader Celsius over natten for å elute proteinkompleksene bundet via den merkede HDAC. Neste dag åpner du kolonnen og samler eluatet i et to milliliter sentrifugerør.
Bruk 0,7 milliliter TEV cleavage buffer for å fjerne perlene fra hetten og for å skylle veggen av kolonnen. Plasser det to milliliter sentrifugerøret i et 50-milliliter sentrifugerør, og plasser deretter kolonnen på det åpne to milliliterrøret. Overfør hele enheten til en bordplate sentrifuge og spinn på 300 ganger g i to minutter for å få TEV eluate.
I denne studien utføres en ett-trinns berikelse av en TAP-merket klasse 1 HDAC fra den filamentøse soppen Aspergillus nidulans for vurdering av in vitro deactylase aktivitet. Et typisk resultat av dette illustrerer tydelig effekten av det første affinitetstrinnet, som økes ytterligere når du utfører tandemrensingen. De fleste av de fremtredende proteinene som finnes i proteinekstraktet og gjennomstrømningen, er imidlertid allerede utarmet i TEV-eluatet.
En immunoblot viser sterke signaler som migrerer på ca. 120 kilodaltonn tilsvarende CBP-merket RpdA i full lengde i TEV-eluatet, calmodulin-gjennomstrømningen og eluate fraksjoner. En representativ deactylase aktivitetsanalyse med den spesifikke HDAC-hemmeren Trichostatin A er vist her. Følsomheten til aktiviteten bekrefter at de målte verdiene skyldes RpdA og ikke skyldes uspesifisert proteaseaktivitet.
Dette er viktig da det indikerer at TEV protease, som er tilstede ved ganske høy konsentrasjon, ikke forstyrrer HDAC-aktivitetsanalysen. Interessant, HDAC aktivitet er betydelig redusert etter den andre affinitet rensing trinn, CE, sammenlignet med TEV eluate. For å tillate effektiv proteinekstraksjon, sørg for at mycelia er malt til fint pulver.
Dette er spesielt viktig når ingen maskin er tilgjengelig og mørtel og pestle brukes til sliping. Tillegg av det andre affinitetstrinnet til protokollen resulterer i fraksjoner rene nok for proteinidentifikasjon, men gjort på massespektrometri. Når du arbeider med flytende nitrogen, sørg for å bruke vernebriller og vernehansker for å unngå personskade.
