Deacetilas de histona classe 1 como RpdA são discutidas como potenciais alvos novos para o tratamento de infecções fúngicas. No entanto, atividades enzimópicas purificadas são necessárias para a caracterização posterior. A principal vantagem deste protocolo é a separação rápida e suficiente de complexos nativos marcados pela TAP para determinação da atividade em uma única etapa.
Os complexos HDAC derivados deste protocolo podem ser usados para a triagem de eficácia de novos inibidores de desácolas específicos de fungos. Este método fornece a base para a extração e purificação de proteínas fúngicas marcadas pela TAP, que podem ser usadas como ponto de partida para o estabelecimento de protocolos para outras enzimas e cepas. Para iniciar este procedimento, adicione 10 mililitros de CSS a cada frasco de conidia preparada.
Feche firmemente cada frasco com a tampa do parafuso fornecida e agite vigorosamente. Depois disso, use um laço de inoculação estéril para raspar completamente qualquer conidia restante. Passe a conidia através de filtros de células de 40 micrômetros colocados em um tubo de centrífuga e colete a suspensão de cinco frascos em um tubo.
Em seguida, centrifufique as amostras para combinar e diluir as amostras conforme descrito no protocolo de texto. Primeiro lugar pano de queijo em um funil em cima de um frasco. Filtre a micélia preparada através do pano e lave brevemente com água deionizada.
Retire o máximo de umidade possível da micélia apertando o pano de queijo entre apenas as mãos e, em seguida, entre toalhas de papel. Depois disso, transfira a micélia seca como lençóis planos em um béquer de plástico com uma tampa de parafuso. Usando nitrogênio líquido, congele a micélia e armazene-a a menos 80 graus Celsius antes da liofilização.
Então lioofilize a micélia da noite para o dia. No dia seguinte, pare o processo de secagem quando a temperatura da micélia permanecer constante. Retire os béquers e sele-os imediatamente com as tampas do parafuso fornecidas.
Primeiro adicione 1,5 gramas de micélio e uma bola de moagem no pote de moagem de um moinho de bolas. Triture o pó de micélio a 25 hertz por 30 segundos e transfira o pó de micélio para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Incline o tubo para permitir a posterior mistura da micélia com o tampão, em seguida, adicione seis mililitros de tampão de extração gelada B250, incluindo coquetel inibidor de protease 1X, por grama de pó mycelial e misture com uma pequena espátula até que a homogeneização completa do extrato bruto seja alcançada;mantenha o tubo no gelo por cinco minutos.
Em seguida, coloque o tubo e um tubo de equilíbrio em uma centrífuga e gire a 40.000 vezes g e a quatro graus Celsius por pelo menos 20 minutos. Durante a centrifugação, estabeleceu uma coluna de cromatografia descartável de 10 mililitros para começar a equilibrar a resina IgG. Pipeta 300 microliters de resina IgG bem ressuspended na coluna.
Encha a coluna para 10 mililitros com B250 e deixe o buffer fluir pela gravidade. Adicione um mililitro de B250 incluindo coquetel inibidor de protease 1X e deixe fluir, em seguida, conecte a parte inferior da coluna. Após a centrifugação, remova 10 microlitres do supernatante para análise SDS-PAGE.
Coloque a amostra em um tubo de 1,5 mililitro contendo 40 microliters de água e 12,5 microliters de 5X LSB. Usando uma pipeta sorológica, remova cuidadosamente o supernasce e transfira-o para a coluna contendo as contas de IgG equilibradas. Feche a coluna fixando firmemente a tampa final fornecida.
Para começar, incubar a coluna de cromatografia em uma batedeira rotativa a 10 rpm e a quatro graus Celsius por duas a quatro horas. Depois disso, remova a tampa e abra a coluna na parte inferior para coletar o fluxo. Para lavar a coluna, use uma pipeta para adicionar um mililitro de tampão de lavagem 250 à tampa da coluna para remover quaisquer contas presas e transfira esta suspensão em uma descarga para a resina assentada para resuspensar as contas.
Em seguida, encha a coluna até a parte superior com o tampão de lavagem 250 e feche-a usando uma tampa de pilha conectada a uma bomba peristáltica. Inicie a bomba peristáltica e ajuste a bomba para uma taxa de fluxo de aproximadamente um a cinco mililitros por minuto, repita este processo de lavagem para um total de quatro lavagens e repita este processo de lavagem três vezes usando o tampão de equilíbrio TEV. Feche a coluna de cromatografia na parte inferior.
Resuspend as contas IgG em um mililitro de tampão de decote TEV e adicione 20 microliters de coquetel inibidor de protease 50X, bem como 10 microliters de TEV. Em seguida, tampe a coluna e incuba em uma batedeira rotativa a 10 rpm e a quatro graus Celsius durante a noite para elutar os complexos proteicos ligados através do HDAC marcado. No dia seguinte, abra a coluna e colete o eluato em um tubo de centrífuga de dois mililitros.
Use 0,7 mililitros de tampão de decote TEV para remover as contas da tampa e enxaguar a parede da coluna. Coloque o tubo de centrífuga de dois mililitros em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e, em seguida, coloque a coluna no tubo aberto de dois mililitros. Transfira todo este conjunto para uma centrífuga de mesa e gire a 300 vezes g por dois minutos para obter o eluato TEV.
Neste estudo, é realizado um enriquecimento de etapa única de um HDAC classe 1 com etiqueta tap do fungo aspergillus nidulans para avaliação da atividade deactilase in vitro. Um resultado típico disso ilustra claramente a eficácia do primeiro passo de afinidade, que é ainda mais aumentado ao realizar a purificação em tandem. A maioria das proteínas proeminentes presentes no extrato de proteínas e no fluxo, no entanto, já estão esgotadas no eluato TEV.
Um imunoblot mostra sinais fortes migrando a aproximadamente 120 kilodaltons correspondentes ao RpdA de comprimento total marcado pelo CBP no eluato TEV, o fluxo calmodulin e frações de elunato. Um ensaio de atividade de desáctilista representativo com o inibidor específico de HDAC Trichostatin A é mostrado aqui. A sensibilidade da atividade confirma que os valores medidos são devidos ao RpdA e não causados por atividade protease inespecífica.
Isso é importante, pois indica que o TEV protease, que está presente em uma concentração bastante alta, não interfere no ensaio de atividade HDAC. Curiosamente, a atividade hdac é significativamente reduzida após a segunda etapa de purificação de afinidade, CE, quando comparada com o eluato TEV. Para permitir a extração eficiente de proteínas, certifique-se de que a micélio seja moída para o pó fino.
Isso é particularmente crítico quando nenhuma máquina está disponível e argamassa e pilão são usados para moagem. A adição do segundo passo de afinidade ao protocolo resulta em frações puras o suficiente para identificação de proteínas, mas feitas em espectrometria de massa. Ao trabalhar com nitrogênio líquido, certifique-se de usar óculos de segurança e luvas de proteção para evitar ferimentos pessoais.
