Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها نيستيم منح C030136 للصحة الإنجابية أننا نود أن أشكر جابلونسكي Bartek للتغذية المرتدة ومراجعة المخطوطة

HSC السابقين فيفو توسيع البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية "اللجنة أخلاقيات البحوث" في "جبل سيناء كلية الطب".
1-المخزن المؤقت وإعداد وسائل الإعلام
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت للفصل 24 ساعة قبل عزلة CD34+ الخلايا من أوبكس بإضافة 2 مل من حامض Diamine الإثيلين م رباعي الخليك 0.5 (يدتا) و...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide,+a+SIRT1+inhibitor,+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment.">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), (2012).</li><li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Expansion+of+HSCs:+New+Possibilities+for+HSC+Transplants?.">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li><li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

وهنا، نقدم بروتوكولا للتوسع السريع لدرجة كبيرة عدد هسكس البشرية الفنية من أوكبس. تشير الدراسات التجريبية والحركية باستخدام هذا البروتوكول السابقين فيفو الخلايا الموسع على الفور الحصول على والاحتفاظ بالتعبير عن عدة علامات HSC المظهرية بما في ذلك CD90، فضلا عن الخصائص الأيضية HSC البدائية<sup cl...

السابقين فيفو توسيع نطاق من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) من دم الحبل السري وحدات (UCB) يحمل وعدا كبيرا للتطبيقات HSC في الطب التجديدي، والعلاج بزرع. وقد زرع مع وحدات UCB عدة مزايا فريدة مثل مجموعة سهلة، وتوافر عالية، الحد الأدنى من المخاطر للعدوى، وانخفاض خطر الانتكاس المرض، والتردد المنخفض للابتزاز مقابل المرض المضيف (GVHD). ومع ذلك، هي المساوئ الرئيسية لاستخدامها في إعدادات السريرية عدد محدود من هسكس موجودة داخل كل وحدة UCB1. عدم كفاية عدد النتائج هسكس engraftment تأخر والاسترداد المكونة للدم، وخطر رفض الابتزاز، وإعادة تشكيل المناعية الشاذة.
حاليا، قد وضعت مختلف أساليب واستراتيجيات للسابقين فيفو توسيع في عدد محدود من هسكس من أوكبس. تركيبات من الكوكتيل سيتوكين مختلفة مع جزيئات صغيرة أو المركبات في السابقين فيفو الثقافات نتيجة في درجات مختلفة من التوسع في HSC الأرقام2،،من34،،من56، 7،8. الأهم من ذلك، حمل الشروط السابقين فيفو ثقافة الإجهاد، مما يؤدي إلى تكاثر الخلايا السريع وزيادة النشاط الأيضي وفقدان الخصائص البدائية التي تحدد هسكس الأولية. ولذلك، هناك حاجة إلى وضع البروتوكولات التي تؤدي إلى التوسع في عدد كبير من هسكس الفنية ذات الخصائص التي تشبه هسكس البدائية الأولية.
الثقافات المصل خالية من CD34+ الخلايا المعزولة من أوكبس وتعامل مع النتيجة (جيش فيتنام الشعبي) حمض فالبرويك في التوسع في عدد كبير من البدائية هسكس4،،من910. توسيع HSC ليس فقط بسبب انتشار هسكس القائمة المستمدة من أوكبس. بدلاً من ذلك، يرجع هذا التوسع في الحصول النمط الظاهري البدائية جنبا إلى جنب مع عدد محدود من انقسامات الخلية وانتشار9. ضمن ح 24 – 48 الأولى من الحضانة مع مزيج من السيتوكينات وجيش فيتنام الشعبي، CD34+ اكتساب الخلايا من ترانسكريبتوميك والمظهرية الشخصية التي تميز هسكس طويلة الأجل. ويرافق الزيادة الكبيرة في نسبة هسكس حدوث زيادة سريعة في عدد هسكس (زيادة إضعاف 63 خلال 24 ساعة علاج جيش فيتنام الشعبي)9. جدير بالذكر أن يوسع استراتيجية التوسع في جيش فيتنام الشعبي السابقين فيفو هسكس مع انخفاض النشاط الأيضي، الذي يبرز كذلك خصائصها البدائية.
الأسلوب الموصوفة هنا يوفر الظروف والعلاجات التي تؤدي إلى درجة كبيرة من السابقين فيفو توسيع هسكس البدائية أما السريرية أو التطبيقات المختبرية. يستخدم هذا السابقين فيفو استراتيجية التوسع كوكتيل سيتوكين جنبا إلى جنب مع العلاج جيش فيتنام الشعبي. جيش فيتنام الشعبي هو المخدرات إدارة الأغذية والعقاقير المعتمدة للعلاج من اضطرابات القطبين، وغيرها من الأمراض العصبية. توسيع HSC مع جيش فيتنام الشعبي هو موجه، وتحدث في غضون 7 أيام، تقليل وقت المعالجة وخطر التلوث. الأهم من ذلك، يتيح هذا البروتوكول للحصول على المدى الطويل HSC علامات المظهرية مثل CD90 و CD49f داخل ح 24-48 بعد العلاج مع جيش فيتنام الشعبي9. ترقيع HSC موسعة تم إنشاؤها بواسطة هذا البروتوكول لديها القدرة على تجديد النظام المكونة للدم نظراً لأنها تفرق في جميع الخلايا المكونة للدم الأنساب وإنشاء انجرافتمينت طويلة الأجل بعد زرع في الفئران مجموعة موردي المواد النووية ميلوابلاتيد نماذج4. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول هو استنساخه بدرجة عالية ويسمح لعزل CD34 قابلة للتطبيق الفعال والسريع+ الخلايا من أوكبس، الذي هو حاسم بالنسبة للتصنيع في هذا الإجراء.
جيش فيتنام الشعبي السابقين فيفو توسيع البروتوكول أيضا لديه القدرة على التغلب على فقدان كبير هسكس الذي يحدث أثناء تحرير11الجينات. الجينات التحرير يتطلب التعرض السيتوكينات، وضرورية للخلايا الدراجات وتفعيل آليات إصلاح الحمض النووي. بسبب آثار فورية معاملة جيش فيتنام الشعبي، قد يكون هذا الأسلوب مفيداً توليد عدد أكبر من الخلايا المحورة وراثيا ضمن فترة زمنية حاليا ذات الصلة لاستخدام البروتوكولات التعديل الجيني.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

توفير وحدات الدم (UCB) الحبل السري مصدر بديل للخلايا الجذعية المكونة للدم البشري (HSCs) للمرضى الذين يحتاجون إلى زرع نخاع العظام متمكنة. بينما UCB له العديد من المزايا الفريدة، محدودية عدد هسكس داخل كل وحدة UCB يحد من استعمالها في الطب التجديدي، وزرع HSC في البالغين. توسيع الكفاءة الوظيفية هسكس البشرية يمكن أن تحققه السابقين فيفو استزراع من CD34+ خلايا معزولة من أوكبس وتعامل مع مثبط ديسيتيلاسي، حمض فالبرويك (جيش فيتنام الشعبي). البروتوكول بالتفصيل هنا يصف ظروف الثقافة والمنهجية لعزل سرعة CD34+ الخلايا، وتوسيع مجموعة هسكس البدائية إلى درجة عالية. هسكس الموسعة قادرة على إنشاء engraftment قصيرة الأجل وطويلة الأجل على حد سواء وهي قادرة على أن تؤدي إلى جميع أنواع متباينة من الخلايا المكونة للدم. هذا الأسلوب أيضا يحمل إمكانات للتطبيق السريري في العلاج الجيني HSC ذاتي ويوفر نهج جذابة للتغلب على فقدان هسكس الوظيفية المرتبطة بتحرير الجينات.

السابقين فيفو البروتوكول المذكورة هنا على زيادة عدد هسكس البدائية التي تم إنشاؤها من CD34+ الخلايا المعزولة من أوكبس (الشكل 1). فتيلة من CD34+ الخلايا ح 16 مع سيتوكين كوكتيل، تليها المعاملة مع جيش فيتنام الشعبي لاضافي 7 أيام، يؤدي إلى درجة كبيرة من ال...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

هنا، يمكننا وصف السابقين فيفو توسيع نطاق من الخلايا الجذعية المكونة للدم من CD34+ الخلايا المشتقة من دم الحبل السري تعامل مع مزيج سيتوكين كوكتيل وجيش فيتنام الشعبي. ويؤدي هذا الأسلوب إلى درجة كبيرة من السابقين فيفو توسيع هسكس البدائية أما السريرية أو التطبيقات المختبرية.

السابقين فيفو توسيع نطاق من الخلايا الجذعية المكونة للدم من CD34 المشتقة من دم الحبل السري البشري+ الخلايا باستخدام حمض فالبرويك

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

السابقين vivo التوسع في الخلايا الجذعية الدموية من وحدة دم الحبل السري عقد وعد كبير لتطبيق HSC في الطب التجديدي والعلاج زرع. يستخدم هذا البروتوكول كوكتيل السيتوكين إلى جانب علاج حمض فالبرويك لتوسيع عدد كبير من HSCs الوظيفية بسرعة مع الخصائص التي تشبه إلى حد كبير HSCs البدائية الأولية.وقد تكون هذه الطريقة مفيدة لتوليد عدد أكبر من الخلايا المعدلة وراثياً في غضون فترة زمنية تكون ذات صلة لبروتوكولات تعديل الجينات المستخدمة حالياً. حمض فالبرويك السابقين بروتوكول التوسع vivo بسيطة نسبيا وموثوق بها. تنقية الخلايا إيجابية CD34 مع الجهاز فاصل الخلية هو استنساخ للغاية وسريعة، مما يسمح لاسترداد سريع من الخلايا CD34-إيجابية عالية تنقية.قبل 24 ساعة من عزل الخلايا الإيجابية CD-34 من دم الحبل السري، قم بإعداد عازلة الفصل بإضافة ميليلترين من 0.5 EDTA 0.5 مولار و33 ملليلتر من 7.5٪ BSA إلى 465 ملليلتر من PBS 1× . اخلط الحاجز بلطف وحافظ عليه بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في يوم التنقية، تدفئة وسائل الإعلام إلى درجة حرارة الغرفة.الاستغناء عن وحدة دم الحبل السري بأكملها في قارورة 75 سم مربع. تخفيف الدم مع حجم متساو من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة ومزيج بلطف. بعد ذلك، تحديد عدد الأنابيب المطلوبة لمعالجة وحدة دم الحبل السري بأكملها.إضافة 15 ملليلتر من كثافة وسائط التدرج لكل أنبوب. الاستغناء عن الدم المخفف ببطء شديد على أعلى التدرج الكثافة في حين عقد الأنبوب في زاوية 45 درجة لخلق طبقتين. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 400 غرام لمدة 30 دقيقة مع تسارع منخفض ومعدل التباطؤ.بعد الطرد المركزي، سوف تكون موجودة الخلايا أحادية النوى في طبقة بيضاء بين البلازما وكثافة طبقات الوسائط التدرج. نقل بعناية طبقة معطف بافي في أنبوب جديد, 50 ملليلتر. جمع كل من الخلايا أحادية النوى من نفس وحدة دم الحبل السري في أنبوب 50 ملليلتر حتى تصل إلى 25 ملليلتر.إضافة 25 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة إلى أنبوب يحتوي على 25 ملليلتر من الخلايا أحادية النوى ومزيج جيد. جهاز طرد مركزي في 400 غرام و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. التعرق بعناية وssuspend بيليه الخلية في 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة.بعد ذلك، إزالة 20 ميكرولترات من تعليق الخلية للعد. استخدم عداد الخلايا الآلي لحساب عدد الخلايا الملطخة إما ببرتقال أو يوديد بروبديسيوم وحساب العدد الإجمالي للخلايا أحادية النوى. ثم، الطرد المركزي الخلايا في 400 غرام و4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.أولا ، مزيج 300 ميكرولترات من العازلة الفصل مع 100 ميكرولترات من الإنسان IgG الإنسان FCR و 100 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي CD34 لعزل الخلايا CD34 إيجابية من 10 مليون خلية أحادية النوى. بعد ذلك، قم بإزالة المُنطَر من أنبوب الخلايا أحادية النوى المُثبَّتة من قبل. Resuspend بيليه في الحل حبة المغناطيسي باستخدام 500 ميكرولترات لكل 10 مليون خلية.اخلطي بلطف وحضني أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. أثناء الحضانة، قم بإعداد جهاز فاصل الخلايا عن طريق استبدال حل التخزين بمخزن مؤقت يعمل وتشغيل برنامج غسيل متبوعاً ببرنامج الشطف. ثم، إضافة فاصل خلية الباردة تشغيل المخزن المؤقت إلى الأنبوب الذي يحتوي على خليط الخلية حتى يتم تعبئة الأنبوب تماما.جهاز طرد مركزي الأنبوب في 400 غرام و4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. التعرق وssuspend بيليه الخلية في فاصل الباردة تشغيل العازلة باستخدام ميليلتر اثنين لكل 10 مليون خلية. نقل خليط تعليق خلية مليلتر إلى أنابيب 15 ملليلتر.تحميل ثلاث مجموعات من الأنابيب في رف فاصل الخلية، والتي تم تبريدها مسبقا إلى أربع درجات مئوية. مجموعة واحدة من الأنابيب تحتوي على MMCs، وسوف تستخدم المجموعة الثانية من الأنابيب لجمع الكسر السلبي، وسوف تستخدم مجموعة ثالثة من الأنابيب لجمع الخلايا CD34-إيجابية النقية. قم بتحميل الحامل في جهاز فاصل الخلايا ثم قم بتشغيل البرنامج المحدد مسبقاً.بعد ذلك، الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي على جزء إيجابي في 400 غرام في و4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. استلهم من فوق و resuspend الخلايا CD34 إيجابية المنقاة في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام خالية من المصل. ثم، استخدم عداد خلية الآلي لحساب الخلايا الملطخة مع البرتقال أو يوديد بروبيد بروبيد.أولاً، إعداد حجم كاف من الوسائط لصفيح الخلايا الموجبة CD34 المنقية بكثافة 33000 خلية لكل ملليلتر. لوحة الخلايا CD34-إيجابية المنقية في لوحة 12-جيدا في كثافة خلية من 50, 000 الخلايا في 1.5 ملليلتر من وسائل الإعلام في بئر. احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون مرطب لمدة 16 ساعة.إضافة حمض فالبرويك إلى الثقافات بحيث يكون التركيز النهائي هو ملليمتر واحد. مواصلة زراعة الخلايا في نفس الظروف لمدة سبعة أيام إضافية. في هذا البروتوكول السابق vivo، يتم زيادة عدد الخلايا الجذعية الدموية البدائية التي تم إنشاؤها من الخلايا إيجابية CD34 معزولة عن دم الحبل السري.العدد الإجمالي للخلايا النووية أعلى بكثير في الثقافات المعالجة مع كوكتيل السيتوكين وحده. على الرغم من ارتفاع عدد الخلايا النووية الإجمالية، فإن عدد الخلايا الجذعية الدموية في الثقافات التي تتلقى كوكتيل السيتوكين وحده لا يزال منخفضًا خلال فترة التوسع بأكملها، مقارنة بالثقافات المعالجة بكوكتيل السيتوكين وحمض فالبرويك. يتم إنشاء أكبر عدد من الخلايا الجذعية للدم في الثقافات المعالجة بمزيج من كوكتيل السيتوكين وحمض فالبرويك.على وجه الخصوص ، يتم التوصل إلى أكبر توسع بعد خمسة إلى سبعة أيام بعد العلاج بحمض فالبرويك. ويرتبط هذا العدد المتزايد من الخلايا الجذعية للدم مع زيادة سريعة في النسبة المئوية للخلايا الجذعية للدم، والتي هي ملحوظة في غضون 24 ساعة من العلاج مع حمض فالبرويك. بينما يحافظ الزيادة في النسبة مئويّة أثناء الأولى أربعة أيام من سابقة تربية, ينخفض هو تدريجيّا بعد خمسة إلى سبعة أيام المعالجة.ومع ذلك، يرتبط هذا الانخفاض عكسياً بزيادة العدد المطلق للخلايا الجذعية للدم. والزيادة السريعة في النسبة المئوية للخلايا الجذعية التي تحتوي على ترسبات الدم في الثقافات المعالجة بالفالبرويك- حمضية ترجع إلى اكتساب النمط الظاهري CD90. الخلايا إيجابية CD34 التي تعبر عن علامة فينونتيبيك CD90 تصل إلى ما يقرب من 40 إلى 50٪ من الخلايا الموسعة في الثقافات فيفو السابق تعامل مع كوكتيل السيتوكين وحمض فالبرويك لمدة أربعة أيام.ثم يتم تأكيد اقتناء النمط الظاهري CD90 من خلال التوسع السابق في الجسم الحي للخلايا CD34-الإيجابية عالية النقية التي تفتقر إلى التعبير عن علامة CD90. في غضون 24 ساعة من العلاج مع حمض فالبرويك, ما يقرب من 75٪ من الخلايا الموسعة السابقين فيفو التعبير عن CD90. هذا النمط الظاهري هو الاحتفاظ بها بشدة خلال الأيام الأربعة الأولى في هذه الثقافات.يجب أن يتم صرف دم الحبل السري المخفف ببطء شديد فوق تدرج الكثافة أثناء حمل الأنبوب بزاوية 45 درجة لإنشاء طبقتين متميزتين. بعد هذا الإجراء التوسع في الجسم الحي السابق، يمكن حقن الخلايا الموسعة في الفئران NSG المناعية ناقصة في النيفة لاختبار وظائفها وإمكانات engraftment. يمكن استخدام الخلايا الموسعة لاختبار مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة ببيولوجيا HSC البشرية والفأر ودور الجينات المختلفة أو لاعب حاسم في السلامة الوظيفية للHSCs.وظيفة السابقين vivo الموسعة HSC من وحدة دم الحبل السري البشري، وذلك باستخدام هذه التقنية، وسيتم اختبار قريبا في تجربة سريرية في المريض مع الأورام الخبيثة الدم الذين يحتاجون زرع نخاع العظام المسببة للحساسية. وقد سمحت لنا هذه التقنية أيضًا بالتحقيق في الآلية التي تقوم عليها توسعة الجسم الحي السابق مع علاج VPA والحصول على رؤى في بيولوجيا HSCs البدائية.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

تشكيل الظهارة البروستاتا الذي يصيب الانسان عن طريق إعادة التركيب الأنسجة من القوارض البولي التناسلي اللحمة المتوسطة الجيوب الأنفية والخلايا الجذعية البشرية

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

تسلسلي<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من الخلايا الجذعية المكونة للعظم / السلف خلال اصلاح الكسر

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

لتخصيب Chemoresistant سرطان المبيض الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا البشرية

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

جيل من Microtumors عن طريق نظام الثقافة 3D Biogel الإنسان وخلايا ورم أرومي دبقي المستمدة من المريض لKinomic التنميط والدواء استجابة اختبار

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

جيل من كبد الفأر أنسنة طريق كبد الإنسان خلايا الجذعية

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-الناجم عن تورم في الأمعاء Organoids: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم الاستجابة للدواء في التليف الكيسي المرضى

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...