Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
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这项工作得到了纽约科技秘书处向相对湿度授予 C030136 的赠款的支持。我们要感谢巴特克·贾布隆斯基对手稿的反馈和修改

HSC 体外扩大协议遵循西奈山医学院研究伦理委员会的指导原则。
1. 缓冲器和介质准备
<ol><li>在从 Ubc 中分离 CD34+细胞前24小时准备分离缓冲液, 加入2毫升 0.5 ml 乙烯胺二胺四乙酸 (edta) 和 3Ml 7.5% 的牛血清白蛋白 (bsa) 至 465 ml 缓冲盐水 (1X pbs)。轻轻混合, 将缓冲液保持在4°C 过夜。</li>
	<li>净化当天在室温下加热介质。</li>
</ol>2. 从 UCB 单元中分离单个核?...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide,+a+SIRT1+inhibitor,+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment.">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), (2012).</li><li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Expansion+of+HSCs:+New+Possibilities+for+HSC+Transplants?.">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li><li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

在此, 我们提出了一项议定书, 以在很大程度上迅速扩大来自 Ucb 的功能性人的 Hsc 数量。使用该协议的试点和动力学研究表明, 体外扩增细胞迅速获得并保留包括 CD90 在内的几种 HSC 表型标记的表达以及原始的 HSC 代谢特征9。
这种体外扩增协议相对简单可靠。使用细胞分离器设备 (见材料表) 纯化 cd34+细胞具有高度的重现性和快速性, 从而?...

脐带血 (UCB) 单位造血干细胞 (Hsc) 的体外扩增, 为造血干细胞在再生医学和移植治疗中的应用带来了巨大的希望。使用 UCB 单元的移植具有多种独特的优势, 如易于收集、高可用性、感染风险最小、疾病复发风险低、移植物与宿主病的发病率低 (GVHD)。然而, 它们在临床环境中使用的主要缺点是每个 UCB 单元1中的 Hsc 数量有限。Hsc 数量不足会导致移植和造血恢复延迟、移植排斥的风险和异常的免疫重建。
目前, 已经制定了各种方法和战略, 以在体内扩大来自 Ucb 的有限的 Hsc 数量。不同细胞因子鸡尾酒与体内培养物中的小分子或化合物的结合会导致 hsc数2、3、4、5、6、 7,8。重要的是, 体外培养条件会诱发压力, 导致细胞快速增殖, 增加代谢活性, 并失去定义原发性 Hsc 的原始特征。因此, 需要开发协议, 从而扩展大量具有与初级原始 Hsc 非常相似的功能 Hsc 的功能 Hsc。
从 ucb 中分离出并经丙戊酸 (vpa) 处理的 cd34+细胞的无血清培养导致大量原始 hsc4、9、10的扩展。HSC 的扩展不仅仅是由于来自 Ucb 的现有 Hsc 的扩散。相反, 这种扩张是由于获得了一个原始的表型, 加上有限数量的细胞分裂和增殖9.在最初的24-48小时内, CD34 + 细胞结合细胞因子和 VPA, 获得了具有长期 Hsc特征的转录和表型特征。在 Hsc 比例大幅上升的同时, Hsc 的数量也在迅速增加 (在 VPA 治疗的24小时内增加 63倍)9。值得注意的是, Vpa-ex-ex-femal 扩增策略可扩展代谢活性低的 Hsc, 这进一步突出了其原始特征。
这里描述的方法提供了条件和治疗方法, 导致原始 Hsc 在体内的显著扩展, 用于临床或实验室应用。这种体外扩张策略使用细胞因子鸡尾酒与 VPA 治疗相结合。VPA 是 FDA 批准的治疗双相情感障碍和其他神经疾病的药物。使用 VPA 的 HSC 扩展是及时的, 并且在7天内发生, 最大限度地减少了操作时间和污染风险。重要的是, 该协议允许在 VPA 9 治疗后24-48 内获取长期的 HSC 表型标记, 如 CD90 和 CD49f.使用该方案创建的扩展 HSC 移植具有再生造血系统的能力, 因为它们可以分化为所有造血细胞谱系, 并在移植到清髓性 NSG 小鼠后建立长期的移植型号4。此外, 该协议具有很高的重现性, 可以从 Ucb 中高效、快速地分离出可行的 CD34+细胞, 这对该程序的产业化至关重要。
VPA 体外扩增协议也有可能克服在基因编辑期间发生的 Hsc 的重大损失11。基因编辑需要接触细胞因子, 而细胞因子是循环细胞和激活 dna 修复机制所必需的。由于 VPA 治疗的迅速效果, 这种方法可能有利于在一段时间内产生更多的转基因细胞, 这与目前使用的基因修饰协议有关。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

脐带血 (UCB) 单元为需要异基因骨髓移植的患者提供了人类造血干细胞 (Hsc) 的替代来源。虽然 UCB 有几个独特的优势, 但每个 UCB 单元内的 Hsc 数量有限, 限制了它们在成人再生医学和 HSC 移植中的使用。通过对从 Ucb 分离并使用去乙酰化酶抑制剂丙戊酸 (VPA) 处理的 CD34+细胞进行体外培养, 可以实现功能人类 Hsc 的有效扩增。这里详细介绍的协议描述了快速分离 CD34 + 细胞并在很大程度上扩展原始 Hsc池的培养条件和方法。扩展的 Hsc 能够建立短期和长期的雕刻, 并能够产生所有类型的分化造血细胞。该方法在自体 HSC 基因治疗中具有临床应用潜力, 为克服基因编辑相关功能性 Hsc 的丧失提供了一种有吸引力的方法。

这里描述的体外协议增加了从 Ucb分离出的 CD34 + 细胞产生的原始 Hsc 的数量 (图 1)。用细胞因子鸡尾酒启动 CD34+细胞 16小时, 然后用 vpa 进行7天的治疗, 可导致 hsc 的大程度扩张。值得注意的是, 扩展细胞池对于 Hsc 具有高度富集, hsc 是由 CD34+cd90+标记的表型定义的。仅用细胞因子鸡尾酒处理的培养物中的有核细胞总数明?...

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Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

在这里, 我们描述了从脐带血中提取的 CD34+细胞的造血干细胞的体外扩增, 该细胞因子鸡尾酒和 vpa 结合治疗。这种方法可显著扩大原始 Hsc 的体内扩张, 用于临床或实验室应用。

丙戊酸在人脐带血源性 CD34 + 细胞造血干细胞体外扩增中的作用

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

脐带血组造血干细胞的外活扩张为HSC在再生医学和移植治疗中的应用大有希望。该协议使用细胞因子鸡尾酒与丙酸处理相结合，迅速扩大大量功能性HSC，其特性与原基HSC相似。 由于丙酸治疗的迅速效果，这种方法还具有克服与基因编辑相关的HSC损失的潜力。这种方法可能有助于在一段时间内产生与当前使用的基因修饰协议相关的更高数量的转基因细胞。丙酸外体膨胀协议相对简单可靠。使用细胞分离器设备纯化CD34阳性细胞具有高度可重复性和快速性，允许快速恢复高度纯化的CD34阳性细胞。在从脐带血分离CD-34阳性细胞前24小时，通过添加两毫升0.5摩尔EDTA和33毫升7.5%BSA至465毫升1X PBS来准备分离缓冲液。轻轻混合缓冲液，并在四摄氏度下保持过夜。在净化当天，将介质加热到室温。将整个脐带血单元分配到75平方厘米的烧瓶中。在室温下用等量的PBS稀释血液，轻轻混合。接下来，确定处理整个脐带血单元所需的管数。向每个管中加入 15 毫升密度梯度介质。在密度梯度上缓慢地分配稀释的血液，同时以 45 度角将管进行分配，以创建两层。以 400 g 离心管 30 分钟，以较低的加速和减速速率。离心后，单核细胞将位于等离子体和密度梯度介质层之间的白层中。小心地将抛光涂层层转移到新的 50 毫升管中。将同一脐带血单元中所有单核细胞收集到50毫升管中，直至达到25毫升。在含有25毫升单核细胞的管子中加入25毫升的冷PBS，并混合良好。在400克和4摄氏度下离心10分钟。小心吸制上清液，将细胞颗粒重新在 50 毫升的冷 PBS 中。在此之后，取出20微升的细胞悬浮液进行计数。使用自动细胞计数器计算沾有丙氨酸或碘化丙二丁的细胞数，并计算单核细胞的总数。然后，在400克和4摄氏度下将细胞离心15分钟。首先，将300微升分离缓冲液与100微升人类FCR人类IgG和100微升CD34磁珠混合，从1000万个单核细胞中分离CD34阳性细胞。接下来，小心地从一根先前离心的单核细胞中去除上半代。每1000万个细胞使用500微升将颗粒重新悬浮在磁珠溶液中。轻轻混合，在4摄氏度下孵育30分钟。在孵化过程中，准备细胞分离器设备，将存储溶液替换为工作缓冲器，然后运行洗涤程序，然后进行冲洗程序。然后，将运行缓冲液的冷细胞分离器添加到包含细胞混合物的管中，直到管完全充满。在400克和4摄氏度下将管子离心15分钟。利用每1000万个细胞的两毫升，在冷分离器运行缓冲液中吸升和重新暂停细胞颗粒。将两毫升细胞悬浮液混合物转移到15毫升管中。将三组管子装入电池分离器机架，该机架已预冷却至 4 摄氏度。一组管子包含MMC，第二组管子将用于收集负分，第三组管子将用于收集纯化CD34阳性细胞。将机架加载到单元分离器设备中并运行预设程序。在此之后，在400g和4摄氏度时将含有正分数的管离心15分钟。吸制上清液，将纯化的CD34阳性细胞重新在一毫升无血清介质中。然后，使用自动细胞计数器来计算沾有丙氨酸或碘化丙二的细胞。首先，准备足够的介质，以每毫升33，000个细胞的密度对纯化的CD34阳性细胞进行板板。将纯化的CD34阳性细胞在12井板中，在5万个细胞密度下，每井1.5毫升培养。在37摄氏度的20%二氧化碳加湿孵化器中孵育16小时。在培养物中加入丙酸，使最终浓度为一毫摩尔。在相同条件下继续培养细胞，再培养七天。在该外体协议中，从脐带血分离出的CD34阳性细胞产生的原生造血干细胞数量增加。仅使用细胞因子鸡尾酒治疗的培养物中，核细胞总数显著增加。尽管总核细胞数量较高，但与使用细胞因子鸡尾酒和丙酸治疗的培养物相比，仅接受细胞因子鸡尾酒的培养物中造血干细胞的数量仍然很低。在用细胞因子鸡尾酒和丙酸组合处理的培养物中，造血干细胞数量最大。特别是，最大的膨胀是在五到七天后，用丙酸治疗后达到。造血干细胞数量的增加与造血干细胞百分比的迅速增加有关，在用丙丙酸治疗的24小时内，这一比例是显著的。虽然在外体培养的前四天保持百分比的增加，但经过五至七天的治疗后，该百分比逐渐下降。然而，这种减少与造血干细胞绝对数量的增加成反比。造血干细胞在经过丙酸处理培养物中所占的百分比迅速上升，是由于获得CD90表型。CD34阳性细胞表达CD90表型标记达到近40-50%的细胞扩大在外体培养物治疗细胞因子鸡尾酒和丙酸四天。然后，缺乏CD90标记表达的高纯化CD34阳性细胞的外体扩张证实了CD90表型的获取。在24小时内的丙酸治疗，近75%的外体扩张细胞表达CD90。这种表型在这些文化中的头四天被高度保留。稀释的脐带血应在密度梯度上非常缓慢地分配，同时以 45 度角将管保持，以创建两个不同的层。遵循这个外体扩张程序，扩大的细胞可以注射到骨髓扩张的免疫缺陷NSG小鼠，以测试其功能和感染潜力。扩展的细胞可用于测试有关人类和小鼠HSC生物学以及不同基因或关键玩家在HSC功能完整性中的作用的多种问题。使用这种技术，人体脐带血单元的外体扩大HSC的功能将很快在需要全源骨髓移植的血液恶性肿瘤患者的临床试验中得到测试。这项技术还使我们能够研究VPA治疗的外体扩张背后的机制，并深入了解原始HSC的生物学。

Research

JoVE Journal

Medicine

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