Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NYSTEM give C030136 til R.H. Vi vil gerne takke Bartek Jablonski for hans feedback og revision af håndskriftet

HSC ex vivo ekspansion protokol følger retningslinjerne i den videnskabsetisk komité på Mount Sinai School of Medicine.
1. buffer og medier forberedelse
<ol><li>Forberede adskillelsen buffer 24 timer før isolation af CD34+ celler fra UBCs ved at tilføje 2 mL 0,5 M ethylen diamin Tetra-eddikesyre (EDTA) og 33 mL på 7,5% bovint serumalbumin (BSA) til 465 mL bufferet saltvand (1 x PBS). Bland forsigtigt og opretholde buffer natten over ved 4 ° C.</li>
	<li>Varm medier ved stue...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide,+a+SIRT1+inhibitor,+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment.">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), (2012).</li><li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Expansion+of+HSCs:+New+Possibilities+for+HSC+Transplants?.">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li><li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

Heri, præsenterer vi en protokol for at hurtigt udvide i væsentlig grad antallet af funktionelle menneskelige HSCs fra UCBs. Pilot og kinetiske undersøgelser bruger denne protokol angiver at den ex vivo udvidet celler hurtigt erhverve og bevare udtryk for flere HSC fænotypiske markører herunder CD90 samt primitive HSC metaboliske egenskaber9.
Dette ex vivo ekspansion protokol er relativt enkel og pålidelig. Rensning af CD34+ celler med celle separator e...

Ex vivo ekspansion af hæmatopoietisk stamceller (HSCs) fra navlestrengsblod (UCB) enheder besidder store løfte til HSC applikationer i regenerativ medicin og transplantation terapi. Transplantation med UCB enheder har flere unikke fordele som let samling, høj tilgængelighed, minimal risiko for infektion, lav risiko for sygdom tilbagefald, og lav frekvens af graft versus host sygdom (GVHD). Men de større ulemper ved deres anvendelse i kliniske indstillinger er det begrænsede antal HSCs stede i hver UCB enhed1. Det utilstrækkelige antal HSCs resultater i forsinket engraftment og hæmatopoietisk opsving, risikoen for graft afvisning og afvigende immun rekonstituering.
I øjeblikket, er forskellige metoder og strategier blevet udviklet for at ex vivo udvide det begrænsede antal HSCs fra UCBs. Kombinationer af forskellige cytokin cocktails med små molekyler eller forbindelser i ex vivo kulturer resulterer i forskellige grader af ekspansion i HSC numre2,3,4,5,6, 7,8. Vigtigere, ex vivo kultur fremkalde betingelser stress, fører til hurtige celleproliferation, øget metabolisk aktivitet og tab af de primitive kendetegn, der definerer primære HSCs. Derfor, udvikle protokoller, der fører til udvidelse af et stort antal funktionel HSCs med egenskaber, der ligner primære primitive HSCs er nødvendige.
Serumfrit kulturer af CD34+ celler isoleret fra UCBs og behandling med valproat syre (VPA) resultere i udvidelse af et stort antal primitive HSCs4,9,10. HSC ekspansion er ikke udelukkende på grund af spredningen af de eksisterende HSCs, afledt af UCBs. Denne udvidelse er derimod på grund af erhvervelse af en primitiv fænotype kombineret med et begrænset antal celledelinger og spredning9. Inden for de første 24-48 h inkubation med en kombination af cytokiner og VPA, CD34+ celler erhverve en transkriptom og fænotypiske profil, der karakteriserer langsigtede HSCs. Den betydelige stigning i procentdelen af HSCs er ledsaget af en hurtig stigning i antallet af HSCs (63 fold stigning inden for 24 timer af VPA behandling)9. Navnlig udvider VPA-ex vivo ekspansionsstrategi HSCs med lav metaboliske aktivitet, hvilket yderligere understreger deres primitive egenskaber.
Metoden beskrevet her giver betingelser og behandlinger, der fører til en betydelig grad af ex vivo ekspansion af primitive HSCs for enten klinisk eller laboratorium applikationer. Dette ex vivo ekspansionsstrategi bruger en cytokin cocktail kombineret med VPA behandling. VPA er en FDA godkendt lægemiddel til behandling af bipolar lidelser og andre neurologiske sygdomme. HSC ekspansion med VPA er lynhurtig og sker inden for 7 dage, minimere både tidspunktet for manipulation og risikoen for forurening. Vigtigst, denne protokol giver mulighed for erhvervelse af langsigtede HSC fænotypiske markører som CD90 og CD49f inden for 24-48 timer efter behandling med VPA9. Udvidet HSC grafts lavet med denne protokol har kapacitet til at regenerere hæmatopoietisk systemet, da de kan differentiere til alle hæmatopoietisk celle lineages og etablere langsigtede engraftment efter transplantation til myeloablated NSG mus modeller4. Desuden, denne protokol er yderst reproducerbare og giver mulighed for effektiv og hurtig isolation af levedygtige CD34+ celler fra UCBs, som er kritiske for industrialisering af denne procedure.
VPA ex vivo ekspansion protokollen har også potentiale til at overvinde betydelige tab af HSCs, som opstår under gen redigering11. Gen redigering kræver udsættelse for cytokiner, der er nødvendige for cykling celler og aktivering af DNA-reparations-mekanismer. På grund af hurtig virkningerne af VPA behandling, kunne denne metode være gavnlige for generation af et højere antal genetisk modificerede celler inden for en periode af tid, der er relevante for øjeblikket udnyttet gen ændring protokoller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

Navlestrengen blod (UCB) enheder giver en alternativ kilde til menneskelige hæmatopoietisk stamceller (HSCs) for patienter, der kræver allogen knoglemarvstransplantation. Mens UCB har flere unikke fordele, begrænser den begrænsede numre af HSCs inden for hver UCB enhed deres brug i regenerativ medicin og HSC transplantation hos voksne. Effektiv udvidelse af funktionelle menneskelige HSCs kan opnås ved ex vivo dyrkning af CD34+ celler isoleret fra UCBs og behandles med en deacetylase-hæmmer, valproat (VPA). Protokollen detaljeret her beskriver kultur betingelser og metode til hurtigt isolere CD34+ celler og udvide i høj grad en pulje af primitive HSCs. De udvidede HSCs er i stand til at etablere både kortsigtede og langsigtede engraftment og er i stand til at give anledning til alle typer af differentierede hæmatopoietisk celler. Denne metode også holder potentiale for klinisk anvendelse på autologe HSC genterapi og giver en attraktiv tilgang for at overvinde tabet af funktionelle HSCs forbundet med gen redigering.

Den ex vivo protokollen beskrevet her stiger antallet af primitive HSCs genereret fra CD34+ celler isoleret fra UCBs (figur 1). Priming af CD34+ celler til 16 h med en cocktail, cytokin efterfulgt af behandling med VPA for en ekstra 7 dage, fører til en stor grad af HSC ekspansion. Bemærkelsesværdigt, pulje af udvidet celler er stærkt beriget til HSCs, der defineres fænotype af CD34+CD90+ markører. Det samlede...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Her, vi beskrive ex vivo ekspansion af hæmatopoietisk stamceller fra CD34+ celler, der stammer fra navlestrengsblod behandlet med en kombination af en cytokin cocktail og VPA. Denne metode fører til en betydelig grad af ex vivo ekspansion af primitive HSCs for enten klinisk eller laboratorium applikationer.

Ex Vivo ekspansion af hæmatopoietisk stamceller fra menneskelige navlestrengen blod-afledte CD34+ celler ved hjælp af valproinsyre

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Ex vivo udvidelse af hæmatopoietiske stamceller fra navlestrengsblod enhed holde store løfte om HSC anvendelse i regenerativ medicin og transplantation terapi. Denne protokol bruger en cytokincocktail kombineret med valproinsyrebehandling til hurtigt at udvide et stort antal funktionelle HSCs med egenskaber, der ligner primære primitive HSCs. På grund af de hurtige virkninger af valproinsyre behandling, denne metode har også potentiale til at overvinde tabet af HSCs forbundet med genredigering.Denne metode kan være gavnlig for generering af et større antal genetisk modificerede celler inden for en periode, der er relevant for aktuelt anvendte genændringsprotokoller. Valproic acid ex vivo-udvidelsesprotokollen er forholdsvis enkel og pålidelig. Rensning af CD34-positive celler med celleseparatorenheden er meget reproducerbar og hurtig, hvilket giver mulighed for hurtig genopretning af stærkt rensede CD34-positive celler.24 timer før isolering af CD-34 positive celler fra navlestrengsblod forberedes separationsbufferen ved at tilføje to milliliter 0,5 molar EDTA og 33 milliliter 7,5 % BSA til 465 milliliter 1X PBS. Bland bufferen forsigtigt og vedligeholde det natten over ved fire grader Celsius. På renselsesdagen skal mediet varmes til stuetemperatur.Hele navlestrengsblod enheden i en 75-kvadrat-centimeter kolbe. Blodfortyndes med et tilsvarende volumen PBS ved stuetemperatur og bland forsigtigt. Dernæst bestemme antallet af rør, der kræves til behandling af hele navlestrengsblod enhed.Der tilsættes 15 milliliter gradientmedier for tætheden til hvert rør. Dispenser det fortyndede blod meget langsomt oven på tætheden gradient, mens du holder røret i en 45-graders vinkel for at skabe to lag. Centrifuge røret ved 400 g i 30 minutter med lav acceleration og deceleration.Efter centrifugering vil de mononukleare celler blive placeret i det hvide lag mellem plasma- og tæthedens gradientmedielag. Overfør forsigtigt det buffy coat lag i et nyt, 50-milliliter rør. Alle de mononukleare celler fra samme navlestrengsblodsenhed opsamles i et 50 milliliterrør, indtil de når op på 25 milliliter.Der tilsættes 25 milliliter kold PBS til røret, der indeholder 25 milliliter mononukleare celler, og blandes godt. Centrifuge ved 400 g og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Inspirer forsigtigt supernatanten og opsplit cellepellet i 50 milliliter kold PBS.Derefter fjernes 20 mikroliter af cellesuspensionen til optælling. Brug en automatiseret celletæller til at tælle antallet af celler, der er bejdset med enten acridinorange eller propidium iodid, og beregne det samlede antal mononukleare celler. Derefter centrifuge cellerne ved 400 g og ved fire grader Celsius i 15 minutter.Bland først 300 mikroliter af separationsbuffer med 100 mikroliter af human FCR human igG og 100 mikroliter cd34 magnetiske perler for at isolere cd34-positive celler fra 10 millioner mononukleare celler. Dernæst forsigtigt fjerne supernatant fra et rør af tidligere centrifugerede mononukleare celler. Opsplit pellet i den magnetiske perleopløsning ved hjælp af 500 mikroliter pr. 10 millioner celler.Bland forsigtigt og inkuberes ved fire grader Celsius i 30 minutter. Under inkubationen forberedes celleseparatorenheden ved at erstatte lagerløsningen med arbejdsbufferen og køre et vaskeprogram efterfulgt af et skylleprogram. Derefter tilsættes kold celleseparator løbebuffer til det rør, der indeholder celleblandingen, indtil røret er helt fyldt.Centrifuge røret ved 400 g og ved fire grader Celsius i 15 minutter. Inspirer supernatanten og opslæmp cellepellet i koldseparatorens løbebuffer ved hjælp af to milliliter pr. 10 millioner celler. To millilitercelleaffjedringsblandingen overføres til 15 milliliterrør.Læg tre sæt af rørene i celleudskillerstativet, som er blevet forkølet til fire grader Celsius. Et sæt rør indeholder MMC'er, det andet sæt rør vil blive brugt til at indsamle den negative fraktion, og et tredje sæt rør vil blive brugt til at indsamle rensede CD34-positive celler. Læg rack'en i celleseparatorenheden, og kør det forudindstillede program.Herefter centrifugeres rørene med den positive fraktion ved 400 g ved og fire grader Celsius i 15 minutter. Inspirer supernatanten og opslæm de rensede CD34-positive celler i en milliliter serumfrie medier. Brug derefter en automatiseret celletæller til at tælle cellerne, der er plettet med acridin orange eller propidium iodid.Først forberedes en tilstrækkelig mængde medier til at plade de rensede CD34-positive celler med en massetæthed på 33.000 celler pr. milliliter. Plade de rensede CD34-positive celler i en 12-brønd plade ved en celletæthed på 50.000 celler i 1,5 milliliter medier pr. brønd. Inkuberes ved 37 grader Celsius i en 5% kuldioxid befugtet inkubator i 16 timer.Tilsæt valproinsyre til kulturerne, således at den endelige koncentration er en millimolar. Fortsæt med at dyrke cellerne på de samme betingelser i yderligere syv dage. I denne ex vivo-protokol øges antallet af primitive hæmatopoietiske stamceller fra CD34-positive celler, der er isoleret fra navlestrengsblod.Det samlede antal nuklede celler er signifikant højere i kulturer, der behandles med cytokincocktailen alene. På trods af det større antal kerneceller er antallet af hæmatopoietiske stamceller i de kulturer, der modtager cytokincocktailen alene, fortsat lavt i hele ekspansionsperioden sammenlignet med kulturer behandlet med cytokincocktail og valproinsyre. Det største antal hæmatopoietiske stamceller genereres i kulturer behandlet med en kombination af cytokincocktail og valproinsyre.Især den største udvidelse er nået efter fem til syv dage efter behandling med valproinsyre. Dette øgede antal hæmatopoietiske stamceller korrelerer med en hurtig stigning i procentdelen af hæmatopoietiske stamceller, hvilket er bemærkelsesværdigt inden for 24 timer efter behandling med valproinsyre. Mens stigningen i procent opretholdes i løbet af de første fire dage af ex vivo kultur, det falder gradvist efter fem til syv dages behandling.Dette fald hænger imidlertid omvendt sammen med en stigning i det absolutte antal hæmatopoietiske stamceller. Den hurtige stigning i procentdelen af hæmatopoietiske stamceller i valproic-syrebehandlede kulturer skyldes erhvervelsen af CD90 fænotype. CD34-positive celler, der udtrykker CD90 fænocypiske markør nå næsten 40 til 50% af celler udvidet i ex vivo kulturer behandlet med cytokin cocktail og valproinsyre i fire dage.Erhvervelsen af CD90 fænotype bekræftes derefter af ex vivo-udvidelsen af de stærkt rensede CD34-positive celler, der mangler udtryk for CD90-mærket. Inden for 24 timer efter behandling med valproinsyre udtrykker næsten 75 % af ex vivo-cellerne CD90. Denne fænotype er stærkt bevaret i løbet af de første fire dage i disse kulturer.Det fortyndede navlestrengsblod skal dispenseres meget langsomt oven på tætheden, mens røret er i en vinkel på 45 grader for at skabe to forskellige lag. Efter denne ex vivo ekspansion procedure, de udvidede celler kan injiceres i myeloablated immun-mangelfuld NSG mus til at teste deres funktionalitet og engraftment potentiale. De udvidede celler kan bruges til at teste en række spørgsmål vedrørende biologi af både menneskelige og mus HSC og den rolle, som forskellige gener eller kritisk spiller på den funktionelle integritet HSCs.Funktionaliteten af ex vivo udvidet HSC fra human navlestrengsblod enhed, ved hjælp af denne teknik, vil snart blive testet i et klinisk forsøg med patient med hæmatologiske maligne maligniteter, der kræver allogen knoglemarvstransplantation. Denne teknik har også givet os mulighed for at undersøge den mekanisme, der ligger til grund for ex vivo ekspansion med VPA behandling og få indsigt i biologi primitive HSCs.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Dannelse af humane prostata Epitel Brug Tissue rekombination af Rodent Urogenital Sinus mesenkymet og menneskelige stamceller

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sekventiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af Osteogene Stem / stamceller Under frakturreparation

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering af kræft stamceller fra humane Prostata Cancer Prøver

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Berigelse for kemoterapi kræft i æggestokkene stamceller fra humane cellelinier

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generation af Microtumors Brug 3D Menneskelig Biogel Kultur System og Patient-afledte glioblastomaceller for Kinomic Profilering and Drug respons Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering af en humaniseret Mouse Lever Brug humane lever Stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Udtømning af Mouse Celler fra Humane tumorxenoplantater Markant Forbedrer Downstream Analyse af Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininduceret Hævelse i Intestinal Organoids: An<em&gt; In vitro</em&gt; Assay for Vurdering Drug respons i patienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...