Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door NYSTEM C030136 toekennen R.H. Wij wil Bartek Jablonski bedanken voor zijn feedback en herziening van het manuscript

Het HSC ex vivo uitbreiding protocol volgt de richtsnoeren van de ethische commissie van onderzoek aan Mount Sinai School of Medicine.
1. de buffer en de voorbereiding van de Media
<ol><li>Bereiden van scheiding buffer 24 h vóór Isolatievan CD34+ cellen van UBCs door toevoeging van 2 mL 0,5 M ethyleendiamine Tetra-azijnzuur (EDTA) en 33 mL 7,5% bovien serumalbumine (BSA) 465 mL gebufferde zoutoplossing (1 x PBS). Meng voorzichtig en handhaven van de buffer's nachts bij 4 ° C.</...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide,+a+SIRT1+inhibitor,+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment.">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), (2012).</li><li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Expansion+of+HSCs:+New+Possibilities+for+HSC+Transplants?.">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li><li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

Hierin presenteren wij een protocol om snel uit te breiden tot een aanzienlijke mate het aantal functionele menselijke HSCs van UCBs. De pilot en kinetische studies met behulp van dit protocol aangeven dat de ex vivo uitgebreide cellen snel verwerven en behouden van de expressie van verschillende HSC fenotypische markers waaronder CD90 evenals primitieve HSC metabole kenmerken9.
Dit ex vivo uitbreiding protocol is relatief eenvoudig en betrouwbaar. Zuivering van CD34<su...

Ex vivo expansie van hematopoietische stamcellen (HSCs) uit het navelstrengbloed (UCB) eenheden houdt grote belofte voor HSC toepassingen in de regeneratieve geneeskunde en transplantatie therapie. Transplantatie met UCB eenheden heeft een aantal unieke voordelen zoals easy collectie, hoge beschikbaarheid, minimale risico van infectie, laag risico van ziekte herval, en lage frequentie van graft-versus-host ziekte (GVGH). De belangrijkste nadelen van hun gebruik in klinische instellingen zijn echter een beperkt aantal HSCs aanwezig binnen elke UCB reactor1. Het ontoereikende aantal HSCs leidt tot vertraagde engraftment en hematopoietische herstel, risico van graft afwijzing en afwijkende immuunsysteem reconstitutie.
Op dit moment zijn diverse methoden en strategieën ontwikkeld om uit te breiden het beperkte aantal HSCs van de UCBs ex vivo. Combinaties van verschillende cytokine cocktails met kleine moleculen of verbindingen in ex vivo culturen resulteren in verschillende graden van de expansie in HSC getallen2,3,4,5,,6, 7,8. Bovenal ex vivo cultuur veroorzaken voorwaarden stress, wat leidt tot snelle celproliferatie, grotere metabole activiteit en verlies van de primitieve kenmerken waaraan een primaire HSCs. Daarom zijn ontwikkelen protocollen die leiden tot uitbreiding van een groot aantal functioneel HSCs met kenmerken die sterk gelijken op primaire primitieve HSCs nodig.
Serumvrij culturen van CD34+ cellen geïsoleerd van UCBs en behandeld met valproic zuur (VPA) resultaat in de uitbreiding van de grote aantallen van primitieve HSCs4,-9,10. De HSC-uitbreiding is niet uitsluitend te wijten aan de verspreiding van de bestaande HSCs, afgeleid van UCBs. In plaats daarvan, deze uitbreiding is te wijten aan de verwerving van een primitieve fenotype gecombineerd met een beperkt aantal celdelingen en proliferatie9. Binnen de eerste 24-48 uur incubatie met een combinatie van cytokines en VPA, CD34+ cellen verwerven een transcriptomic en fenotypische profiel die kenmerkend zijn voor langdurige HSCs. De aanzienlijke toename van het percentage van de HSCs wordt begeleid door een snelle toename van het aantal HSCs (63-voudige toename binnen de 24u van VPA behandeling)9. Met name breidt de uitbreidingsstrategie van de VPA-ex vivo HSCs met lage metabolische activiteit, die verdere hun primitieve kenmerken hoogtepunten.
De hier beschreven methode biedt voorwaarden en behandelingen die tot een aanzienlijke mate van ex vivo uitbreiding van de primitieve HSCs voor hetzij leiden klinische of laboratorium toepassingen. Deze ex vivo expansiestrategie maakt gebruik van een cocktail van de cytokine, gecombineerd met VPA behandeling. VPA is een FDA goedgekeurd geneesmiddel voor de behandeling van bipolaire wanorde en andere neurologische ziekten. De uitbreiding van de HSC met VPA zit prompt en treedt op binnen de 7 dagen, minimaliseren van de tijd van manipulatie en het risico van besmetting. Nog belangrijker is, kan dit protocol voor de verwerving van langdurige HSC fenotypische markeringen zoals CD90 en CD49f binnen 24-48 h na behandeling met VPA9. Uitgebreide HSC transplantaten gemaakt met dit protocol hebben de capaciteit om te regenereren van het hematopoietische systeem aangezien zij kunnen in alle geslachten van hematopoietische cel onderscheiden en op de lange termijn engraftment na transplantatie in myeloablated NSG muizen modellen4. Dit protocol is bovendien zeer reproduceerbaar en zorgt voor de efficiënte en snelle isolatie van levensvatbare CD34+ cellen van UCBs, die is van cruciaal belang voor de industrialisering van deze procedure.
De VPA ex vivo uitbreiding protocol heeft ook het potentieel om te overwinnen van het verlies aan HSCs die optreedt tijdens de gene11bewerken. Gene bewerken vereist blootstelling aan cytokines, die nodig voor fietsen cellen en activering van DNA-reparatie mechanismen zijn. Als gevolg van de snelle effecten van VPA behandeling, kan deze methode voordelig zijn voor de generatie van een hoger aantal genetisch gemodificeerde cellen binnen een termijn die relevant is voor momenteel gene wijziging protocollen gebruikt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

Navelstreng bloed (UCB) eenheden bieden een alternatieve bron van menselijke hematopoietische stamcellen (HSCs) voor patiënten die behoefte hebben aan allogene beenmergtransplantatie. Terwijl UCB heeft een aantal unieke voordelen, beperkt de beperkte oplage van HSCs binnen elke UCB-eenheid hun gebruik in de regeneratieve geneeskunde en HSC-transplantatie bij volwassenen. Efficiënte uitbreiding van functionele menselijke HSCs kan worden bereikt door ex vivo kweken van CD34+ cellen geïsoleerd van UCBs en behandeld met een deacetylase-remmer, valproic zuur (VPA). Het protocol hier gedetailleerde beschrijving van de kweekomstandigheden en methodologie te snel isoleren CD34+ cellen en uit te breiden tot een hoge mate een pool van primitieve HSCs. De uitgebreide HSCs kunnen zowel op korte als op lange termijn engraftment tot stand te brengen en kunnen aanleiding geven tot alle soorten gedifferentieerde hematopoietische cellen. Deze methode ook potentiële voor klinische toepassing houdt in autologe HSC gentherapie en biedt een aantrekkelijke aanpak om te overwinnen van het verlies van functionele HSCs gene bewerken is gekoppeld.

De ex vivo protocol beschreven hier verhoogt het aantal primitieve HSCs gegenereerd op basis van CD34+ cellen geïsoleerd van UCBs (Figuur 1). Priming van CD34+ cellen voor 16 h met een cytokine cocktail, gevolgd door behandeling met VPA voor een extra 7 dagen, leidt op voor een grote mate van HSC expansie. Opmerkelijk is de pool van uitgebreide cellen is hoogverrijkt voor HSCs, die zijn fenotypische gedefinieerd door CD34+CD9...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Hier beschrijven we de ex vivo expansie van hematopoietische stamcellen uit CD34+ cellen afgeleid van navelstrengbloed behandeld met een combinatie van een cytokine cocktail en de VPA. Deze methode leidt tot een aanzienlijke mate van ex vivo uitbreiding van de primitieve HSCs voor hetzij klinische of laboratorium toepassingen.

Ex Vivo expansie van hematopoietische stamcellen uit menselijke navelstreng bloed afkomstige CD34+ cellen met behulp van Valproic zuur

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Ex vivo uitbreiding van hematopoietische stamcel van navelstrengbloed eenheid houden grote belofte voor HSC toepassing in regeneratieve geneeskunde en transplantatie therapie. Dit protocol maakt gebruik van een cytokine cocktail in combinatie met valproïnezuur behandeling om snel uit te breiden een groot aantal functionele HSCs met kenmerken die sterk lijken op primaire primitieve HSCs. Als gevolg van de snelle effecten van valproïnezuur behandeling, deze methode heeft ook het potentieel om het verlies van HSCs geassocieerd met genbewerking te overwinnen.Deze methode kan gunstig zijn voor het genereren van een hoger aantal genetisch gemodificeerde cellen binnen een periode die relevant is voor de momenteel gebruikte genmodificatieprotocollen. Het valproic acid ex vivo expansion protocol is relatief eenvoudig en betrouwbaar. Zuivering van CD34-positieve cellen met het celafscheiderapparaat is zeer reproduceerbaar en snel, waardoor zeer gezuiverde CD34-positieve cellen snel kunnen worden hersteld.24 uur voor de isolatie van CD-34 positieve cellen uit navelstrengbloed, bereid de scheidingsbuffer voor door twee milliliter edta van 0,5 mol en 33 milliliter van 7,5%BSA tot 465 milliliter 1X PBS toe te voegen. Meng de buffer voorzichtig en houd deze 's nachts op vier graden Celsius. Verwarm de media op de dag van zuivering tot kamertemperatuur.Doe de hele navelstrengbloedeenheid in een kolf van 75 vierkante centimeter. Verdun het bloed met een gelijk volume PBS bij kamertemperatuur en meng zachtjes. Bepaal vervolgens het aantal buizen dat nodig is voor de verwerking van de hele navelstrengbloedeenheid.Voeg 15 milliliter dichtheidsgradiëntmedia toe aan elke buis. Doseer het verdunde bloed heel langzaam op de top van de dichtheidgradiënt terwijl u de buis in een hoek van 45 graden houdt om twee lagen te maken. Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten op 400 g met een lage acceleratie- en vertragingssnelheid.Na de centrifugatie bevinden de mononucleaire cellen zich in de witte laag tussen de plasma- en dichtheidsgradiëntmedialagen. Breng de buffy laag voorzichtig over in een nieuwe buis van 50 milliliter. Verzamel alle mononucleaire cellen van dezelfde navelstrengbloed eenheid in een 50-milliliter buis tot het bereiken van 25 milliliter.Voeg 25 milliliter koude PBS toe aan de buis met 25 milliliter mononucleaire cellen en meng goed. Centrifuge op 400 g en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Zorgvuldig aspirate de supernatant en resuspend de cel pellet in 50 milliliter koude PBS.Verwijder hierna 20 microliter van de celsuspensie om te tellen. Gebruik een geautomatiseerde celteller om het aantal cellen te tellen dat gekleurd is met acridine sinaasappel- of propidiumjodide en bereken het totale aantal mononucleaire cellen. Vervolgens centrifugeren de cellen op 400 g en op vier graden Celsius gedurende 15 minuten.Meng eerst 300 microliter scheidingsbuffer met 100 microliter menselijke FCR-menselijke IgG en 100 microliters cd34 magnetische kralen om de CD34-positieve cellen te isoleren van 10 miljoen mononucleaire cellen. Verwijder vervolgens voorzichtig de supernatant uit een buis van eerder gecentrifugeerde mononucleaire cellen. Resuspend de pellet in de magnetische kraal oplossing met behulp van 500 microliters per 10 miljoen cellen.Meng zachtjes en incubeer op vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Bereid tijdens de incubatie het celafscheiderapparaat voor door de opslagoplossing te vervangen door de werkbuffer en een wasprogramma uit te voeren, gevolgd door een spoelprogramma. Voeg vervolgens koude celafscheider lopende buffer aan de buis die het celmengsel bevat totdat de buis volledig is gevuld.Centrifugeren de buis op 400 g en op vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Aspirate de supernatant en resuspend de cel pellet in koude separator lopende buffer met behulp van twee milliliters per 10 miljoen cellen. Breng de twee-milliliter cel suspensie mengsel in 15-milliliter buizen.Laad drie sets van de buizen in de cel separator rack, die is voorgekoeld tot vier graden Celsius. Een set buizen bevat MMC's, de tweede set buizen zal worden gebruikt om de negatieve fractie te verzamelen, en een derde set buizen zal worden gebruikt om gezuiverde CD34-positieve cellen te verzamelen. Laad het rack in het celscheiderapparaat en voer het vooraf ingestelde programma uit.Daarna centrifugeren de buizen met de positieve fractie op 400 g bij en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Aspirate de supernatant en resuspend de gezuiverde CD34-positieve cellen in een milliliter van serum-vrije media. Gebruik vervolgens een geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen die zijn gekleurd met acridine sinaasappel of propidiumjodide.Bereid eerst een voldoende volume media voor om de gezuiverde CD34-positieve cellen te plaaten met een dichtheid van 33.000 cellen per milliliter. Plaat de gezuiverde CD34-positieve cellen in een 12-well plaat bij een celdichtheid van 50.000 cellen in 1,5 milliliter media per put. Incubeer bij 37 graden Celsius in een 5%koolstofdioxide bevochtigde couveuse gedurende 16 uur.Voeg valprofic zuur aan de culturen zodanig dat de uiteindelijke concentratie is een millimolar. Blijf de cellen onder dezelfde voorwaarden nog zeven dagen kweken. In dit ex vivo-protocol wordt het aantal primitieve hematopoietische stamcellen gegenereerd uit CD34-positieve cellen geïsoleerd uit navelstrengbloed verhoogd.Het totale aantal nucleated cellen is aanzienlijk hoger in culturen behandeld met de cytokine cocktail alleen. Ondanks het hogere aantal totale nucleated cellen, blijft het aantal hematopoietische stamcellen in de culturen die de cytokinecocktail alleen ontvangen laag tijdens de gehele expansieperiode, vergeleken met culturen die met cytokinecocktail en valproïnezuur worden behandeld. Het grootste aantal hematopoietische stamcellen wordt gegenereerd in culturen behandeld met een combinatie van de cytokine cocktail en valproïnezuur.In het bijzonder wordt de grootste expansie bereikt na vijf tot zeven dagen na de behandeling met valproïnezuur. Dit toegenomen aantal hematopoietische stamcellen correleert met een snelle toename van het percentage hematopoietische stamcellen, wat opmerkelijk is binnen 24 uur na behandeling met valproïnezuur. Terwijl de stijging van het percentage wordt gehandhaafd tijdens de eerste vier dagen van ex vivo cultuur, daalt het geleidelijk na vijf tot zeven dagen van behandeling.Deze daling wordt echter omgekeerd gecorreleerd met een toename van het absolute aantal hematopoietische stamcellen. De snelle toename van het percentage hematopoietische stamcellen in met valproïne behandelde culturen is te wijten aan de verwerving van het CD90-fenotype. CD34-positieve cellen die de CD90 fenotypische marker uitdrukken bereiken bijna 40 tot 50% van de cellen die worden uitgebreid in ex vivo culturen die vier dagen lang worden behandeld met de cytokinecocktail en valproïnezuur.De overname van het CD90-fenotype wordt vervolgens bevestigd door ex vivo-uitbreiding van de sterk gezuiverde CD34-positieve cellen die geen expressie van de CD90-marker hebben. Binnen 24 uur na behandeling met valproïnezuur, bijna 75% van de ex vivo uitgebreide cellen express CD90. Dit fenotype is zeer behouden tijdens de eerste vier dagen in deze culturen.Het verdunde navelstrengbloed moet zeer langzaam worden afgegeven bovenop de dichtheidsgradiënt terwijl de buis in een hoek van 45 graden wordt gehouden om twee afzonderlijke lagen te creëren. Na deze ex vivo expansieprocedure kunnen de uitgebreide cellen worden geïnjecteerd in de myeloablated immuuntekorte NSG-muizen om hun functionaliteit en engraftmentpotentieel te testen. De uitgebreide cellen kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid aan vragen te testen met betrekking tot de biologie van zowel menselijke als muis HSC en de rol van verschillende genen of kritische speler op de functionele integriteit van HSCs.De functionaliteit van ex vivo uitgebreid HSC van menselijke navelstrengbloed eenheid, met behulp van deze techniek, zal binnenkort worden getest in een klinische studie bij patiënten met hematologische maligniteiten die allogene beenmergtransplantatie vereisen. Deze techniek heeft ons ook in staat gesteld om het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de ex vivo-uitbreiding te onderzoeken met VPA-behandeling en inzicht te krijgen in de biologie van primitieve HSCs.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Vorming van menselijke prostaat epitheel behulp Tissue recombinatie van knaagdieren Urogenital Sinus Mesenchym en menselijke stamcellen

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequentiële<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van Osteogeen Stam / progenitorcellen Tijdens Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolatie van kanker stamcellen uit menselijke stalen van prostaatkanker

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Verrijking voor chemoresistent eierstokkanker stamcellen uit menselijke cellijnen

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Genereren van Microtumors Met behulp van 3D Human Biogel Cultuur System en Patient afgeleide glioblastoma Cellen voor Kinomic Profiling and Drug Response Testen

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Genereren van een gehumaniseerd muis lever met behulp van menselijke lever stamcellen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Uitputting van de Muis Cellen van geënte, humane tumoren verbetert Downstream Analyse van Target Cellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay voor het beoordelen van de Drug Response in patiënten met cystische fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...