Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt von NYSTEM C030136 gewähren, R.H. Wir würden gerne Bartek Jablonski für sein Feedback und Überarbeitung des Manuskripts danken

Der HSC ex Vivo Expansion Protokoll folgt den Richtlinien der Ethik-Kommission Forschung am Mount Sinai School of Medicine.
1. Puffer und Medien-Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie Trennung Puffer 24 h vor der Isolierung von CD34+ Zellen von Aluminiumschrott durch Zugabe von 2 mL 0,5 M-Ethylen-Diamin-Tetra-acetic Acid (EDTA) und 33 mL 7,5 % Rinderserumalbumin (BSA), 465 mL gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS). Mischen Sie vorsichtig und pflegen Sie den Puffer über Nacht bei 4 ° C....

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um schnell zu einem bedeutenden Grad die Zahl der funktionalen menschlichen HSCs erweitern von UCBs. Der pilot und kinetischen Studien unter Verwendung dieses Protokolls zeigen, dass die ex Vivo erweiterte Zellen sofort erwerben und behalten die Expression von mehreren HSC phänotypische Markierungen einschließlich CD90 sowie primitive HSC metabolischen Eigenschaften9.
Diese ex-Vivo Expansion Protokoll ist relativ einfach und zuver...

Ex-Vivo Expansion der hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut (HSCs) (UCB) Einheiten verspricht große für HSC-Anwendungen in der regenerativen Medizin und Transplantation Therapie. Transplantation mit UCB Einheiten hat mehrere einzigartige Vorteile wie einfache Sammlung, hohe Verfügbarkeit, minimales Risiko einer Infektion, geringes Risiko der Krankheit Rückfall und geringe Häufigkeit von Graft-versus-Host Erkrankung (GVHD). Die große Nachteile für ihre Verwendung in klinischen Umgebungen sind jedoch die begrenzte Anzahl von HSZ innerhalb jedes UCB Einheit1vorhanden. Die unzureichende Anzahl von HSZ führt zu verzögerter Engraftment und hämatopoetischen Erholung, Risiko von Transplantat Ablehnung und aberrante Immunrekonstitution.
Derzeit wurden verschiedene Methoden und Strategien entwickelt um die begrenzte Zahl von HSZ aus UCBs ex Vivo zu erweitern. Kombinationen von verschiedenen Zytokin Cocktails mit kleinen Molekülen oder Verbindungen in ex Vivo Kulturen führen in verschiedenen Graden der Expansion im HSC Zahlen2,3,4,5,6, 7,8. Ex-Vivo-Kultur induzieren Bedingungen vor allem Stress, führt zu schnellen Zellproliferation, erhöhte Stoffwechselaktivität und Verlust der primitive Merkmale, die primäre HSCs definieren. Daher brauchen wir entwickeln Protokolle, die zum Ausbau der zahlreichen funktionalen HSCs mit Eigenschaften führen, die primäre primitive HSCs ähneln.
Serum-freie Kulturen der CD34+ Zellen aus UCBs isoliert und mit Valproinsäure Säure (VPA) Ergebnis in den Ausbau einer großen Zahl von primitiven HSCs4,9,10behandelt. Die HSC-Erweiterung ist nicht allein durch die Verbreitung von den vorhandenen HSCs UCBs abgeleitet. Stattdessen ist diese Erweiterung durch den Erwerb eines primitiven Phänotyps, kombiniert mit einer begrenzten Anzahl von Zellteilungen und Verbreitung9. Innerhalb der ersten 24 – 48 h Inkubation mit einer Kombination von Zytokinen und VPA, CD34+ Zellen zu erwerben, ein transkriptomischen und phänotypischen Profil, die langfristige HSCs charakterisieren. Die deutliche Erhöhung des Anteils von HSZ begleitet eine schnelle Zunahme der Zahl von HSZ (63 fachen Anstieg innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung der VPA)9. Insbesondere wird die VPA-Ex Vivo Expansionsstrategie HSCs mit niedrigen Stoffwechselaktivität, die weitere ihrer primitiven Merkmale Höhepunkte erweitert.
Die hier beschriebene Methode bietet, Beschwerden und Behandlungen, die ein hohes Maß an ex-Vivo Expansion der primitiven HSCs entweder führen, klinische oder Laboranwendungen. Diese ex-Vivo-Expansions-Strategie nutzt einen Zytokin-Cocktail mit VPA-Behandlung kombiniert. VPA ist eine FDA zugelassene Medikament zur Behandlung von bipolaren Störungen und anderen neurologischen Erkrankungen. Die HSC-Erweiterung mit VPA ist Prompt und tritt innerhalb von 7 Tagen, die Zeit der Manipulation und das Risiko einer Kontamination zu minimieren. Wichtiger ist, können dieses Protokoll für den Erwerb von langfristigen HSC phänotypische Markierungen wie CD90 und CD49f innerhalb von 24-48 h nach der Behandlung mit VPA-9. Erweiterte HSC-Transplantate mit diesem Protokoll erstellt haben die Fähigkeit, das blutbildende System zu regenerieren, da sie alle Linien der hämatopoetischen Zellen differenzieren und etablieren langfristige Engraftment nach Transplantation in Myeloablated NSG Mäuse Modelle-4. Darüber hinaus dieses Protokoll ist sehr reproduzierbar und ermöglicht eine effiziente und schnelle Isolierung von lebensfähigen CD34+ Zellen aus UCBs, die kritisch für die Industrialisierung dieses Verfahrens ist.
Der VPA ex Vivo Expansion Protokoll hat auch das Potenzial, den erheblichen Verlust von HSZ zu überwinden, die während der Bearbeitung11gen auftritt. Gen, die Bearbeitung erfordert Belastung durch Zytokine, die zum Radfahren Zellen und Aktivierung der DNA-Reparatur-Mechanismen erforderlich sind. Durch die schnelle Wirkung der VPA Behandlung kann diese Methode vorteilhaft sein, für die Generation eine höhere Anzahl von genetisch veränderten Zellen innerhalb kurzer Zeit, die derzeit für relevant ist gen-Änderung-Protokolle verwendet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

Nabelschnur Blut (UCB) Einheiten bieten eine alternative Quelle der humanen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) für Patienten, die eine allogene Knochenmarktransplantation benötigen. UCB hat mehrere einzigartige Vorteile, begrenzt die begrenzte Anzahl von HSZ innerhalb jeder UCB-Einheit ihre Verwendung in der regenerativen Medizin und HSC-Transplantation bei Erwachsenen. Effizienten Ausbau der funktionalen menschlichen HSCs kann erreicht werden durch ex Vivo Kultivierung von CD34+ Zellen von UCBs isoliert und mit einer Deacetylase Inhibitor, Valproinsäure (VPA) behandelt. Das Protokoll hier detailliert beschreibt die Kulturbedingungen und Methodik schnell CD34 isolieren+ Zellen und einen Pool von primitiven HSCs in hohem Maße zu erweitern. Die erweiterte HSCs sind in der Lage sowohl kurzfristige als auch langfristige Engraftment und sind in der Lage, alle Arten von differenzierten hämatopoetischen Zellen hervorzubringen. Auch diese Methode birgt Potenzial für die klinische Anwendung in der autologen HSC-Gentherapie und bietet einen attraktiven Ansatz um den Verlust des funktionellen HSCs gen Bearbeitung zugeordnet.

Der ex-Vivo Protokoll hier beschriebenen erhöht die Anzahl der primitiven HSCs generiert aus CD34+ Zellen isoliert von UCBs (Abbildung 1). Grundierung der CD34+ Zellen für 16 h mit einem Zytokin-cocktail, gefolgt von der Behandlung mit VPA für weitere 7 Tage, zu einem großen Teil der HSC Expansion führt. Bemerkenswert ist, der Pool der erweiterten Zellen hochangereichertes für HSCs, die phänotypisch durch CD34 definiert sind+...

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Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Hier beschreiben wir die Ex Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut behandelt mit einer Kombination aus einem Zytokin-cocktail und VPA. Diese Methode führt zu einem bedeutenden Grad von ex-Vivo Expansion der primitiven HSCs entweder für klinische oder Laboranwendungen.

Ex-Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen aus menschlichen Nabelschnur Blut abgeleitet CD34+ Zellen mit Valproinsäure

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Ex-vivo-Erweiterung der hämatopoetischen Stammzelle aus Nabelschnurbluteinheit halten große Versprechen für HSC-Anwendung in der regenerativen Medizin und Transplantationstherapie. Dieses Protokoll verwendet einen Zytokin-Cocktail in Kombination mit Valproinsäure-Behandlung, um schnell eine große Anzahl von funktionellen HSCs mit Eigenschaften zu erweitern, die primären primitiven HSCs sehr ähnlich sind. Aufgrund der schnellen Wirkung der Valproinsäurebehandlung hat diese Methode auch das Potenzial, den Verlust von HSCs im Zusammenhang mit der Genbearbeitung zu überwinden.Diese Methode könnte für die Erzeugung einer höheren Anzahl genetisch veränderter Zellen innerhalb eines Zeitraums von Vorteil sein, der für derzeit verwendete Genmodifikationsprotokolle relevant ist. Das Valproicsäure ex vivo Expansionsprotokoll ist relativ einfach und zuverlässig. Die Reinigung von CD34-positiven Zellen mit dem Zellabscheidergerät ist sehr reproduzierbar und schnell, was eine schnelle Wiederherstellung hochgereinigter CD34-positiver Zellen ermöglicht.24 Stunden vor der Isolierung von CD-34-positiven Zellen aus Nabelschnurblut, bereiten Sie den Trennpuffer durch Zugabe von zwei Millilitern von 0,5 Molaren EDTA und 33 Milliliter von 7,5%BSA zu 465 Millilitern 1X PBS. Mischen Sie den Puffer sanft und halten Sie ihn über Nacht bei vier Grad Celsius. Am Tag der Reinigung, erwärmen Sie die Medien auf Raumtemperatur.Geben Sie die gesamte Nabelschnurbluteinheit in einen 75-Quadrat-Zentimeter-Kolben. Das Blut mit einem gleichen PBS-Volumen bei Raumtemperatur verdünnen und sanft mischen. Als nächstes bestimmen Sie die Anzahl der Röhren, die für die Verarbeitung der gesamten Nabelschnurbluteinheit erforderlich sind.Fügen Sie 15 Milliliter Dichtegradientenmedien zu jedem Rohr hinzu. Geben Sie das verdünnte Blut sehr langsam auf den Dichtegradienten, während Sie das Rohr in einem 45-Grad-Winkel halten, um zwei Schichten zu erstellen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 400 g für 30 Minuten mit einer niedrigen Beschleunigungs- und Verzögerungsrate.Nach der Zentrifugation befinden sich die mononukleären Zellen in der weißen Schicht zwischen den Plasma- und Dichtegradienten-Medienschichten. Übertragen Sie die buffy Schicht vorsichtig in ein neues 50-Milliliter-Rohr. Sammeln Sie alle mononukleären Zellen aus der gleichen Nabelschnurbluteinheit in eine 50-Milliliter-Röhre, bis sie 25 Milliliter erreichen.25 Milliliter kaltes PBS in die Röhre geben, die 25 Milliliter mononukleäre Zellen enthält, und gut vermischen. Zentrifuge bei 400 g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in 50 Millilitern kalter PBS wieder aufhängen.Danach entfernen Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension zum Zählen. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die Anzahl der Zellen zu zählen, die entweder mit Akridinorange oder Propidiumjodid gefärbt sind, und berechnen Sie die Gesamtzahl der mononukleären Zellen. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 g und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten.Mischen Sie zunächst 300 Mikroliter Trennpuffer mit 100 Mikroliter menschlichen FCR humanem IgG und 100 Mikroliter CD34-Magnetperlen, um die CD34-positiven Zellen von 10 Millionen mononukleären Zellen zu isolieren. Als nächstes entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus einem Röhrchen von zuvor zentrifugierten mononukleären Zellen. Setzen Sie das Pellet in der magnetischen Perlenlösung mit 500 Mikrolitern pro 10 Millionen Zellen wieder auf.Sanft mischen und bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang bebrüten. Bereiten Sie während der Inkubation das Zellabscheidergerät vor, indem Sie die Speicherlösung durch den Arbeitspuffer ersetzen und ein Waschprogramm mit anschließendem Spülprogramm ausführen. Fügen Sie dann dem Rohr, das die Zellmischung enthält, einen Kaltzellentrennungspuffer hinzu, bis das Rohr vollständig gefüllt ist.Zentrifugieren Sie das Rohr bei 400 g und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet im Kaltabscheider-Laufpuffer mit zwei Millilitern pro 10 Millionen Zellen wieder auf. Das Zwei-Milliliter-Zellsuspensionsgemisch in 15-Milliliter-Röhren übertragen.Laden Sie drei Sätze der Rohre in das Zellabscheider-Rack, das auf vier Grad Celsius vorgekühlt ist. Ein Satz von Röhren enthält MMCs, der zweite Satz von Röhren wird verwendet, um den negativen Anteil zu sammeln, und ein dritter Satz von Röhren wird verwendet, um gereinigte CD34-positive Zellen zu sammeln. Laden Sie das Rack in das Zelltrenngerät, und führen Sie das voreingestellte Programm aus.Danach zentrieren Sie die Rohre, die den positiven Anteil bei 400 g bei und vier Grad Celsius für 15 Minuten enthalten. Den Überstand ansaugen und die gereinigten CD34-positiven Zellen in einem Milliliter serumfreien Medium wieder aussetzen. Verwenden Sie dann einen automatisierten Zellzähler, um die mit Acridinorange oder Propidiumjodid gefärbten Zellen zu zählen.Bereiten Sie zunächst ein ausreichendes Medienvolumen vor, um die gereinigten CD34-positiven Zellen mit einer Dichte von 33.000 Zellen pro Milliliter zu verdichten. Die gereinigten CD34-positiven Zellen in einer 12-Well-Platte mit einer Zelldichte von 50.000 Zellen in 1,5 Milliliter Medien pro Brunnen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem 5% kohlendioxidbefeuchteten Inkubator für 16 Stunden.Fügen Sie den Kulturen Valproinsäure so hinzu, dass die Endkonzentration ein Millimolar beträgt. Kultivieren Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen für weitere sieben Tage. In diesem Ex-vivo-Protokoll wird die Anzahl der primitiven hämatopoetischen Stammzellen erhöht, die aus CD34-positiven Zellen erzeugt werden, die aus Nabelschnurblut isoliert sind.Die Gesamtzahl der nukleierten Zellen ist in Kulturen, die allein mit dem Zytokincocktail behandelt werden, signifikant höher. Trotz der höheren Anzahl an gesamtnukleierten Zellen bleibt die Anzahl der hämatopoetischen Stammzellen in den Kulturen, die den Zytokin-Cocktail allein erhalten, während der gesamten Expansionsphase niedrig, verglichen mit Kulturen, die mit Zytokincocktail und Valproinsäure behandelt werden. Die größte Anzahl hämatopoetischer Stammzellen wird in Kulturen erzeugt, die mit einer Kombination aus Zytokincocktail und Valproinsäure behandelt werden.Insbesondere wird die größte Expansion nach fünf bis sieben Tagen nach der Behandlung mit Valproinsäure erreicht. Diese erhöhte Anzahl hämatopoetischer Stammzellen korreliert mit einer raschen Erhöhung des Anteils hämatopoetischer Stammzellen, was innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung mit Valproinsäure bemerkenswert ist. Während der Prozentuale Anstieg während der ersten vier Tage der Ex-vivo-Kultur beibehalten wird, nimmt er nach fünf bis sieben Behandlungstagen schrittweise ab.Diese Abnahme korreliert jedoch umgekehrt mit einem Anstieg der absoluten Anzahl hämatopoetischer Stammzellen. Der rasche Anstieg des Anteils hämatopoetischer Stammzellen in valprosäurebehandelten Kulturen ist auf die Erfassung des CD90-Phänotyps zurückzuführen. CD34-positive Zellen, die den cd90-phänotisch-marker exzessiv ex vivo-Kulturen exvivo ex vivo exreichen, vier Tage lang mit dem Zytokincocktail und Der Valproinsäure behandelt, erreichen fast 40 bis 50%.Die Erfassung des CD90-Phänotyps wird dann durch ex vivo-Erweiterung der hochgereinigten CD34-positiven Zellen bestätigt, denen die Expression des CD90-Markers fehlt. Innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung mit Valproinsäure drücken fast 75% der ex vivo expandierten Zellen CD90 aus. Dieser Phänotyp wird in den ersten vier Tagen in diesen Kulturen stark erhalten.Das verdünnte Nabelschnurblut sollte sehr langsam auf den Dichtegradienten abgegeben werden, während das Rohr in einem 45-Grad-Winkel gehalten wird, um zwei unterschiedliche Schichten zu erzeugen. Nach diesem Ex-vivo-Erweiterungsverfahren können die erweiterten Zellen in die myeloabierten immungeschwächten NSG-Mäuse injiziert werden, um ihre Funktionalität und ihr Einpfropbefreienpotenzial zu testen. Die erweiterten Zellen können verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen in Bezug auf die Biologie von Mensch und Maus HSC und die Rolle der verschiedenen Gene oder kritischen Akteur auf die funktionelle Integrität von HSCs zu testen.Die Funktionalität des ex vivo erweiterten HSC von der menschlichen Nabelschnurbluteinheit mit dieser Technik wird bald in einer klinischen Studie bei Patienten mit hämatologischen Malignitäten getestet, die eine allogene Knochenmarktransplantation erfordern. Diese Technik hat es uns auch ermöglicht, den Mechanismus zu untersuchen, der der Ex-vivo-Erweiterung mit VPA-Behandlung zugrunde liegt, und Einblicke in die Biologie primitiver HSCs zu erhalten.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

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Medizin

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Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...