Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NYSTEM להעניק C030136 ר. ה ברצוננו להודות עדינה מלול ג'ובלנסקי שלו משוב ובחינה של כתב היד

מועדון הכדורגל מונפלייה ex-vivo הרחבה פרוטוקול עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה במחקר על הר סיני בית הספר לרפואה.
1. מאגר והכנות מדיה
<ol><li>הכנת מאגר ההפרדה 24 שעןת לפני ניתוקה של CD34+ תאים של UBCs על-ידי הוספת 2 מ ל חומצה אצטית-M אתילן diamine ב טטרה 0.5 (EDTA) ו- 33 מ של 7.5% אלבומין שור...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide,+a+SIRT1+inhibitor,+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment.">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), (2012).</li><li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Expansion+of+HSCs:+New+Possibilities+for+HSC+Transplants?.">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li><li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול במהירות להרחיב במידה משמעותית את מספר HSCs האנושי פונקציונלי של UCBs. לימודי טייס קינטי באמצעות פרוטוקול זה מצביעים על כך ex-vivo תאים מורחבת מיד להשיג ולשמר את הביטוי של מספר HSC פנוטיפי סמני כולל CD90, כמו גם HSC פרימיטיביים מאפיינים מטבולית9.
<p class="jove_content...

Ex-vivo הרחבה של תאי גזע hematopoietic (HSCs) של דם טבורי (UCB) יחידות מחזיקה הבטחה גדולה עבור יישומים HSC רפואה רגנרטיבית וטיפול השתלת. השתלת עם יחידות UCB יש מספר יתרונות ייחודיים כמו אוסף קל, זמינות גבוהה, סיכון מינימלי של זיהום, סיכון נמוך של התדרדרות המחלה, תדירות נמוכה של שתל-לעומת מארח מחלות (GVHD). עם זאת, החסרונות העיקריים של השימוש בהגדרות קליני הם מספר מוגבל של HSCs מתנה בתוך כל UCB יחידה1. מספר לא מספיק של תוצאות HSCs engraftment מושהה, שחזור hematopoietic, הסיכון של דחיית השתל, שיחזור המערכת החיסונית סוטה.
כיום, שיטות ואסטרטגיות שונות פותחו כדי שמחוץ להרחיב את מספר מוגבל של HSCs מ- UCBs. שילובים של ציטוקינים שונים קוקטיילים עם מולקולות קטנות או תרכובות ex-vivo תרבויות לגרום דרגות שונות של הרחבה במועדון הכדורגל מונפלייה מספרי2,3,4,5,6, 7,8. חשוב, ex-vivo תרבות תנאים לגרום מתח, שמוביל התפשטות תאים מהירה, פעילות מטבולית מוגברת ואובדן פרימיטיביים המאפיינים המגדירים את ראשי HSCs. לכן, נדרשים לפתח פרוטוקולים להוביל הרחבה של מספר רב של HSCs פונקציונלי עם מאפיינים דומים HSCs פרימיטיבית העיקרי.
ללא סרום תרבויות CD34+ תאים מבודד UCBs ומטופל מהתוצאה (VPA) חומצה ולפרואית, בהרחבת מספר גדול של פרימיטיביים HSCs4,9,10. הרחבת HSC אינה אך ורק עקב ההתפשטות של HSCs קיימים נגזר UCBs. במקום זאת, התרחבות זו היא בשל רכישת הפנוטיפ פרימיטיביים בשילוב עם מספר מוגבל של חלוקות תאים והתפשטות9. בתוך ה 24-48 הראשונית של דגירה עם שילוב של ציטוקינים, VPA CD34+ תאים לרכוש transcriptomic ופרופיל פנוטיפי המאפיינות HSCs לטווח ארוך. העלייה המשמעותית באחוזים של HSCs מלווה גידול מהיר במספר HSCs (קיפול 63 עלייה בתוך 24 שעות של טיפול VPA)9. ראוי לציין, אסטרטגיית הרחבה vivo VPA-לשעבר מרחיבה HSCs עם פעילות מטבולית נמוכה, המדגישה את המאפיינים פרימיטיביים שלהם עוד יותר.
השיטה המתוארת כאן מספק תנאים ומטיפולי להוביל מידה רבה של ex-vivo הרחבת HSCs פרימיטיבית גם קליני או יישומים מעבדה. משתמש זה ex-vivo הרחבה אסטרטגיה קוקטייל ציטוקין בשילוב עם טיפול VPA. VPA הוא סם ה-FDA אישר טיפול הפרעות דו קוטבית ומחלות נוירולוגיות אחרות. הרחבת HSC עם VPA בקש, מתרחשת בתוך 7 ימים, צמצום הזמן של מניפולציה והן את הסיכון של זיהום. חשוב לציין, פרוטוקול זה מאפשר רכישת לטווח ארוך HSC פנוטיפי סמני כגון CD90 ו- CD49f בתוך 24-48 שעות לאחר הטיפול עם VPA9. שתלי HSC מורחב שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה יש את היכולת להתחדש מערכת hematopoietic מאז הם יכולים להבדיל לתוך כל תא hematopoietic שושלות ולייסד engraftment לטווח ארוך בעקבות השתלת לתוך myeloablated NSG עכברים מודלים4. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא מאוד לשחזור ומאפשר בידוד יעיל ומהיר של קיימא CD34+ תאים של UCBs, אשר הוא קריטי עבור ה תיעוש של הליך זה.
VPA ex-vivo הרחבה פרוטוקול יש גם את היכולת להתגבר על אובדן משמעותי של HSCs אשר מתרחש במהלך עריכת11גנים. ג'ין עריכה דורש חשיפה ציטוקינים, אשר נחוצים עבור תאים אופניים והפעלה של מנגנוני ה-DNA לתקן. בשל השפעת VPA טיפול מהיר, שיטה זו תועיל עבור הדור של מספר גדול יותר של תאים מהונדסים בתוך פרק זמן זה רלוונטי כיום מנוצל פרוטוקולים שינוי גנטי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

יחידות דם (UCB) חבל הטבור לספק מקור חלופי של האדם תאי גזע hematopoietic (HSCs) עבור חולים הזקוקים השתלת מח עצם allogeneic. בעוד UCB יש מספר יתרונות ייחודיים, המספרים מוגבלת של HSCs בתוך כל יחידה UCB מגביל את השימוש בהם ברפואה רגנרטיבית ומועדון הכדורגל מונפלייה השתלת אצל מבוגרים. הרחבת יעיל פונקציונלי HSCs האנושית יכולה להיות מושגת על ידי ex-vivo culturing של CD34+ תאים מבודדים מן UCBs וינהגו מעכב deacetylase, חומצה ולפרואית (VPA). פרוטוקול מפורט כאן מתאר את התנאים תרבות של מתודולוגיה לבודד במהירות CD34+ תאים, להרחיב במידה גבוהה בריכת HSCs פרימיטיבית. HSCs המורחב מסוגלים להקים engraftment הן לטווח קצר והן לטווח ארוך והם מסוגלים להצמיח כל סוגי תאים hematopoietic. שיטה זו גם מחזיקה פוטנציאל יישום קליני טיפול גנטי HSC עצמיים, מספקת גישה אטרקטיבי כדי להתגבר על האובדן של HSCs תפקודית המשויך ג'ין עריכה.

Ex-vivo פרוטוקול המתוארים כאן מגדילה את מספר HSCs פרימיטיבית המופקים CD34+ תאים מבודדים מן UCBs (איור 1). הטרמה של CD34+ תאים עבור h 16 עם ציטוקין קוקטייל, ואחריו טיפול עם VPA במשך 7 ימים, נוסף שמוביל מידה רבה של מועדון הכדורגל מונפלייה הרחבה. למרבה הפלא, הבריכה ?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

כאן, אנו מתארים את האקס vivo הרחבה של תאי גזע hematopoietic מ CD34+ תאים שמקורם דם טבורי מטופלים עם שילוב של ציטוקין קוקטיילים ו VPA. שיטה זו מובילה מידה רבה של ex-vivo הרחבת HSCs פרימיטיבית גם קליני או יישומים מעבדה.

Ex-Vivo הרחבה של תאי גזע Hematopoietic מן הטבור האדם הנגזרות דם CD34+ תאים באמצעות חומצה ולפרואית

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

הרחבת Vivo של תא גזע hematopoietic מיחידה דם טבור להחזיק הבטחה גדולה עבור יישום HSC ברפואה רגנרטיבית וטיפול השתלה. פרוטוקול זה להשתמש קוקטייל ציטוקינים בשילוב עם טיפול חומצה valproic להרחיב במהירות מספר רב של HSCs פונקציונלי עם מאפיינים הדומים מאוד HSCs פרימיטיבי ראשי. בשל ההשפעות המהירות של טיפול חומצה valproic, שיטה זו יש גם פוטנציאל להתגבר על אובדן HSCs הקשורים לעריכת גנים.שיטה זו עשויה להועיל לדור של מספר גבוה יותר של תאים מהונדסים גנטית בתוך פרק זמן הרלוונטי לפרוטוקולים של שינוי גנים הנמצאים בשימוש כיום. פרוטוקול הרחבת חומצה valproic ex vivo הוא פשוט יחסית ואמין. טיהור תאים חיוביים CD34 עם התקן מפריד התא הוא מאוד לשכפל ומהיר, המאפשר התאוששות מהירה של תאים חיוביים CD34 מטוהרים מאוד.24 שעות לפני הבידוד של תאים חיוביים CD-34 מדם חבל הטבור, להכין את חיץ ההפרדה על ידי הוספת שני מיליליטר של EDTA טוחן 0.5 ו 33 מיליליטר של 7.5%BSA ל 465 מיליליטר של 1X PBS. מערבבים את המאגר בעדינות ושומרים עליו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. ביום הטיהור, לחמם את התקשורת לטמפרטורת החדר.מחלקים את כל יחידת הדם של חבל הטבור לבקבוק של 75 ס"מ. מדללים את הדם בנפח שווה של PBS בטמפרטורת החדר ומערבבים בעדינות. לאחר מכן, לקבוע את מספר הצינורות הנדרשים לעיבוד כל יחידת הדם חבל הטבור.הוסף 15 מיליליטר של מדיה הדרגתית צפיפות לכל צינור. מחלקים את הדם המדולל לאט מאוד על גבי שיפוע הצפיפות תוך החזקת הצינור בזווית של 45 מעלות כדי ליצור שתי שכבות. צנטריפוגה הצינור ב 400 גרם במשך 30 דקות עם האצה נמוכה וקצב האטה.לאחר הצנטריפוגה, התאים המונונוקלאריים ימוקם בשכבה הלבנה בין שכבות המדיה הפלזמה והצפיפות. מעבירים בזהירות את שכבת המעיל באפי לצינור חדש של 50 מיליליטר. לאסוף את כל התאים mononuclear מאותה יחידת דם חבל הטבור לתוך צינור 50 מיליליטר עד שהגיע 25 מיליליטר.מוסיפים 25 מיליליטר של PBS קר לצינור המכיל 25 מיליליטר של תאים mononuclear ומערבבים היטב. צנטריפוגה ב 400 גרם וב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בזהירות שאף את supernatant ולתלות את גלולת התא ב 50 מיליליטר של PBS קר.לאחר מכן, להסיר 20 microliters של ההשעיה התא לספירה. השתמש מונה תאים אוטומטי כדי לספור את מספר התאים מוכתמים עם או תפוז אקרידין או יודיד פרופיד ולחשב את המספר הכולל של תאים mononuclear. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 400 גרם וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.ראשית, לערבב 300 microliters של חיץ הפרדה עם 100 microliters של האדם FCR IgG ו 100 microliters של חרוזים מגנטיים CD34 כדי לבודד את התאים החיוביים CD34 מ 10 מיליון תאים mononuclear. לאחר מכן, הסר בזהירות את העל-טבעי מצינור של תאים מונונוקלאריים שהיו צנטריפוגניים בעבר. השתמש מחדש את גלולה בתת פתרון חרוז מגנטי באמצעות 500 microliters לכל 10 מיליון תאים.מערבבים בעדינות ו דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה, הכן את התקן מפריד התאים על-ידי החלפת פתרון האחסון במאגר העבודה והפעלת תוכנית כביסה ואחריה תוכנית שטיפה. לאחר מכן, להוסיף מפריד תאים קרים פועל חוצץ לצינור המכיל את תערובת התא עד הצינור מתמלא לחלוטין.צנטריפוגה הצינור ב 400 גרם וב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. שאף את העל-טבעי והפעל מחדש את גלולת התא במאגר ריצה של מפריד קר באמצעות שני מיליליטר לכל 10 מיליון תאים. מעבירים את תערובת המתלים של שני מיליליטר לצינורות של 15 מיליליטר.טען שלושה סטים של הצינורות לתוך מתלה מפריד התאים, אשר כבר מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס. קבוצה אחת של צינורות מכיל MMCs, הקבוצה השנייה של צינורות ישמש כדי לאסוף את השבר השלילי, וקבוצה שלישית של צינורות ישמשו לאיסוף תאים מטוהרים CD34 חיובי. טען את ארון התקשורת להתקן מפריד התאים והפעל את התוכנית המוגדרת מראש.לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות המכילים את השבר החיובי ב 400 גרם ב וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים החיוביים המטוהרים CD34 במיליליטר אחד של מדיה נטולת סרום. לאחר מכן, השתמש מונה תאים אוטומטי לספור את התאים מוכתמים עם תפוז אקרידין או יודיד פרופידיום.ראשית, הכן נפח מספיק של מדיה כדי ל הלוח CD34 חיובי תאים מטוהרים בצפיפות של 33, 000 תאים למיליליטר. צלחת תאים חיוביים CD34 מטוהרים בצלחת 12 באר בצפיפות תאים של 50, 000 תאים ב 1.5 מיליליטר של מדיה ל הבאר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח פחמן דו חמצני 5% במשך 16 שעות.מוסיפים חומצה ולפרואית לתרבויות כך שהריכוז הסופי הוא מילימולר אחד. המשך culturing התאים באותם תנאים במשך שבעה ימים נוספים. בפרוטוקול זה ex vivo, מספר תאי גזע hematopoietic פרימיטיבי שנוצר תאים חיוביים CD34 מבודדים מדם חבל הטבור מוגברת.המספר הכולל של תאים גרעיניים גבוה משמעותית בתרבויות שטופלו בקוקטייל הציטוקין בלבד. למרות המספר הגבוה יותר של תאים גרעיניים הכולל, מספר תאי גזע hematopoietic בתרבויות קבלת קוקטייל ציטוקין לבד נשאר נמוך במהלך כל תקופת ההתפשטות, לעומת תרבויות שטופלו קוקטייל ציטוקיני וחומצה valproic. המספר הגדול ביותר של תאי גזע hematopoietic נוצר בתרבויות שטופלו בשילוב של קוקטייל ציטוקין וחומצה ולפרואית.בפרט, ההתרחבות הגדולה ביותר היא להגיע לאחר חמישה עד שבעה ימים לאחר הטיפול עם חומצה valproic. מספר גדל זה של תאי גזע hematopoietic בקורלציה עם עלייה מהירה באחוז תאי גזע hematopoietic, אשר בולט בתוך 24 שעות של טיפול עם חומצה valproic. בעוד העלייה באחוז נשמרת בארבעת הימים הראשונים של תרבות האקס ויוו, היא יורדת בהדרגה לאחר חמישה עד שבעה ימי טיפול.עם זאת, ירידה זו מתואמת הפוך עם עלייה במספר המוחלט של תאי גזע hematopoietic. העלייה המהירה באחוז תאי הגזע המטופויטיים בתרבויות שטופלו בחומצה ולפרואית נובעת מרכישת הפנוטיפ CD90. תאים חיוביים CD34 המבטאים את הסמן הפנוטיפי CD90 מגיעים כמעט 40 עד 50% מהתאים המורחבים בתרבות אקס ויוו שטופלו בקוקטייל ציטוקין וחומצה ולפרואית במשך ארבעה ימים.הרכישה של פנוטיפ CD90 הוא אישר לאחר מכן על ידי הרחבת ex vivo של תאים חיוביים CD34 מטוהרים מאוד, כי חסר ביטוי של סמן CD90. בתוך 24 שעות של טיפול בחומצה ולפרואית, כמעט 75% מהתאים המורחבים של אקס ויוו מבטאים CD90. פנוטיפ זה נשמר מאוד במהלך ארבעת הימים הראשונים בתרבויות אלה.דם טבור מדולל צריך להיות מחלק לאט מאוד על גבי שיפוע הצפיפות תוך החזקת הצינור בזווית של 45 מעלות כדי ליצור שתי שכבות נפרדות. בעקבות הליך הרחבת ex vivo זה, ניתן להזריק את התאים המורחבים לעכברי NSG לקויי מערכת החיסון כדי לבדוק את הפונקציונליות שלהם ואת פוטנציאל חריטה. התאים המורחבים יכולים לשמש כדי לבדוק מגוון רחב של שאלות לגבי הביולוגיה של HSC האדם והעכבר ואת התפקיד של גנים שונים או שחקן קריטי על השלמות התפקודית של HSCs.הפונקציונליות של אקס ויוו הרחיבה את HSC מיחידה אנושית של דם חבל הטבור, באמצעות טכניקה זו, תיבדק בקרוב בניסוי קליני בחולה עם ממאירות המטולוגית הזקוקה להשתלת מח עצם אלוגניים. טכניקה זו גם אפשרה לנו לחקור את המנגנון שבבסיס הרחבת ex vivo עם טיפול VPA ולקבל תובנות על הביולוגיה של HSCs פרימיטיבי.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

היווצרות של האפיתל ערמונית אנושי באמצעות רקומבינציה של רקמות ואברי מין מכרסם mesenchyme סינוס ותאי גזע אנושיים

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...