Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
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Questo lavoro è stato supportato da NYSTEM concedere C030136 a U.R. Vorremmo ringraziare Bartek Jablonski per il suo feedback e revisione del manoscritto

L'HSC ex vivo protocollo di espansione segue le linee guida del comitato etico di ricerca presso la Mount Sinai School of Medicine.
1. buffer e preparazione di terreni
<ol><li>Preparare il tampone di separazione 24 h prima dell'isolamento di CD34+ cellule da lattine aggiungere 2 mL di 0.5 M etilene diammina Tetra-acetico (EDTA) e 33 mL di 7,5% albumina di siero bovino (BSA) a 465 mL tamponata di soluzione salina (1x PBS). Mescolare delicatamente e mantenere il buffer durante la no...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

Qui, presentiamo un protocollo per espandere rapidamente in modo significativo il numero di HSC umane funzionali da UCBs. Gli studi pilota e cinetici usando questo protocollo indicano che l'ex vivo cellule espanse prontamente acquisire e mantenere l'espressione di HSC diversi marcatori fenotipici tra cui CD90 così come primitivo HSC caratteristiche metaboliche9.
Questo ex vivo protocollo di espansione è relativamente semplice e affidabile. Purificazione di CD34+<...

Ex vivo espansione di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) da sangue del cordone ombelicale unità (UCB) tiene la grande promessa per applicazioni di HSC nella medicina rigenerativa e nella terapia di trapianto. Il trapianto con unità di UCB ha diversi vantaggi unici come collezione easy, disponibilità elevata, minimo rischio di infezione, basso rischio di ricaduta di malattia e bassa frequenza dell'innesto-contro la malattia ospite (GVHD). Tuttavia, gli svantaggi principali del loro utilizzo in ambito clinico sono il limitato numero di HSCs presenti all'interno di ogni unità UCB1. Il numero insufficiente di HSCs provoca engraftment in ritardo e recupero ematopoietico, rischio di rigetto e di ricostituzione immunitaria aberrante.
Attualmente, sono state sviluppate vari metodi e strategie per ex vivo espandere il numero limitato di HSCs da UCBs. Combinazioni di diverse citochine cocktail con piccole molecole o composti in ex vivo culture causare vari gradi di espansione in HSC numeri2,3,4,5,6, 7,8. D'importanza, ex vivo cultura condizioni inducono stress, portando a proliferazione rapida delle cellule, l'attività metabolica aumentata e perdita delle caratteristiche primitive che definiscono HSCs primario. Pertanto, sono necessari protocolli in via di sviluppo che portano all'espansione di un gran numero di HSCs funzionale con caratteristiche che assomigliano molto alle primarie HSCs primitivo.
Privo di siero culture di CD34+ cellule isolate da UCBs e trattate con risultato di (VPA) acido valproico nell'espansione di un gran numero di primitivo HSCs4,9,10. L'espansione di HSC non è solamente dovuto la proliferazione delle HSCs esistente derivata da UCBs. Invece, questa espansione è dovuta all'acquisizione di un fenotipo primitivo combinato con un numero limitato di divisioni cellulari e proliferazione9. All'interno l'iniziale 24 – 48 h di incubazione con una combinazione di citochine e VPA, CD34+ le cellule acquisiscono un trascrittomica e profilo fenotipico che caratterizzano HSCs a lungo termine. L'aumento significativo della percentuale di HSCs è accompagnato da un rapido aumento del numero di HSCs (aumento di 63 volte entro 24 h del trattamento di VPA)9. In particolare, la strategia di espansione di VPA-ex vivo si espande HSCs con bassa attività metabolica, che evidenzia ulteriormente la loro caratteristiche primitive.
Il metodo qui descritto fornisce condizioni e trattamenti che conducono ad un grado significativo di ex vivo espansione di HSCs primitivo per uno clinica o applicazioni di laboratorio. Questo ex vivo la strategia di espansione utilizza un cocktail di citochina combinato con il trattamento di VPA. VPA è un farmaco approvato dalla FDA per il trattamento di disturbi bipolari e altre malattie neurologiche. L'espansione di HSC con VPA è veloce e si verifica entro 7 giorni, riducendo al minimo il tempo di manipolazione e il rischio di contaminazione. D'importanza, questo protocollo consente l'acquisizione di lungo termine marcatori fenotipici HSC come CD90 e CD49f entro 24-48 h dopo il trattamento con VPA9. Innesti HSC espansi creati con questo protocollo hanno la capacità di rigenerare il sistema ematopoietico poiché possono differenziarsi in tutti i lignaggi di cellule ematopoietiche e stabilire attecchimento a lungo termine dopo trapianto in topi NSG myeloablated modelli4. Inoltre, questo protocollo è altamente riproducibile e permette per l'isolamento efficiente e rapido di CD34 vitali+ cellule da UCBs, che è fondamentale per l'industrializzazione di questa procedura.
Il VPA ex vivo protocollo di espansione ha anche il potenziale per superare la perdita significativa di HSCs che si verifica durante il gene editing11. Gene modifica richiede l'esposizione a citochine, che sono necessari per cellule ciclanti e attivazione dei meccanismi di riparazione del DNA. A causa degli effetti di richiesta del trattamento di VPA, questo metodo potrebbe essere utile per la generazione di un numero maggiore di cellule geneticamente modificate entro un periodo di tempo che è rilevante per attualmente utilizzati protocolli di modifica del gene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

Cordone ombelicale unità di sangue (UCB) forniscono una fonte alternativa di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) per pazienti che richiedono il trapianto allogenico di midollo osseo. Mentre UCB ha diversi vantaggi unici, il numero limitato di HSCs all'interno di ogni unità UCB limiti loro uso nella medicina rigenerativa e trapianto di HSC negli adulti. Espansione efficiente di HSCs umano funzionale può essere ottenuta ex vivo coltura delle CD34+ cellule isolate da UCBs e trattati con un inibitore delle deacetilasi, acido valproico (VPA). Il protocollo dettagliato qui descrive le condizioni di coltura e la metodologia per isolare rapidamente CD34+ cellule ed espandere ad un alto grado un pool di HSCs primitivo. Le HSCs espanso sono in grado di stabilire l'attecchimento sia a breve che a lungo termine e sono in grado di dar luogo a tutti i tipi di cellule ematopoietiche differenziate. Questo metodo inoltre tiene il potenziale per l'applicazione clinica di terapia genica con HSC autologa e fornisce un approccio attraente per superare la perdita di HSCs funzionale associata con il gene editing.

L'ex vivo protocollo descritto qui aumenta il numero di HSCs primitivo generato da CD34+ cellule isolate da UCBs (Figura 1). Priming di CD34+ cellule per 16 h con una citochina cocktail, seguita dal trattamento con VPA per un ulteriore 7 giorni, conduce ad un grande grado di espansione di HSC. Notevolmente, il pool di cellule espanse è altamente arricchito per HSCs, che sono definiti fenotipico di CD34+CD90+ marcat...

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Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Qui, descriviamo l'ex espansione vivo di cellule staminali ematopoietiche da CD34+ le cellule derivate dal sangue del cordone ombelicale trattati con una combinazione di una citochina cocktail e VPA. Questo metodo conduce ad un grado significativo di ex espansione vivo di HSCs primitivo per una clinica o applicazioni di laboratorio.

Ex Vivo espansione di cellule staminali da cordone ombelicale umano derivate dal sangue CD34+ cellule utilizzando acido valproico

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

L'espansione ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche dall'unità sanguigna del cordone ombelicale promette molto per l'applicazione dell'HSC nella medicina rigenerativa e nella terapia dei trapianti. Questo protocollo utilizza un cocktail di citochine combinato con il trattamento con acido valproico per espandere rapidamente un gran numero di HSC funzionali con caratteristiche che assomigliano molto agli HSC primitivi primari. A causa dei rapidi effetti del trattamento con acido valproico, questo metodo ha anche il potenziale per superare la perdita di HSC associati all'editing genico.Questo metodo potrebbe essere utile per la generazione di un maggior numero di cellule geneticamente modificate entro un periodo di tempo rilevante per i protocolli di modifica genica attualmente utilizzati. Il protocollo di espansione ex vivo dell'acido valproico è relativamente semplice e affidabile. La purificazione delle cellule cd34-positive con il dispositivo separatore cellulare è altamente riproducibile e rapida, consentendo un rapido recupero di cellule CD34 positive altamente purificate.24 ore prima dell'isolamento delle cellule positive CD-34 dal sangue del cordone ombelicale, preparare il tampone di separazione aggiungendo due millilitri di EDTA molare 0,5 e 33 millilitri del 7,5%BSA a 465 millilitri di 1X PBS. Mescolare delicatamente il tampone e mantenerlo durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno della purificazione, riscaldare il supporto a temperatura ambiente.Erogare l'intera unità di sangue del cordone ombelicale in un pallone di 75 centimetri quadrati. Diluire il sangue con un volume uguale di PBS a temperatura ambiente e mescolare delicatamente. Successivamente, determinare il numero di tubi necessari per l'elaborazione dell'intera unità sanguigna del cordone ombelicale.Aggiungere 15 millilitri di mezzi gradienti di densità a ciascun tubo. Erogare il sangue diluito molto lentamente sopra il gradiente di densità mantenendo il tubo con un angolo di 45 gradi per creare due strati. Centrifugare il tubo a 400 g per 30 minuti con una bassa accelerazione e velocità di decelerazione.Dopo la centrifugazione, le cellule mononucleari si trovano nello strato bianco tra gli strati del plasma e del gradiente di densità. Trasferire con cura lo strato di mantello buffy in un nuovo tubo da 50 millilitri. Raccogliere tutte le cellule mononucleari dalla stessa unità sanguigna del cordone ombelicale in un tubo da 50 millilitri fino a raggiungere i 25 millilitri.Aggiungere 25 millilitri di PBS freddo al tubo contenente 25 millilitri di cellule mononucleari e mescolare bene. Centrifuga a 400 g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Aspirare con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 50 millilitri di PBS freddo.Successivamente, rimuovere 20 microlitri della sospensione cellulare per il conteggio. Utilizzare un contatore di celle automatizzato per contare il numero di celle macchiate con acridina arancione o ioduro di propidio e calcolare il numero totale di cellule mononucleari. Quindi, centrifugare le cellule a 400 g e a quattro gradi Celsius per 15 minuti.In primo luogo, mescolare 300 microlitri di tampone di separazione con 100 microlitri di IgG umano FCR umano e 100 microlitri di perline magnetiche CD34 per isolare le cellule cd34-positive da 10 milioni di cellule mononucleari. Successivamente, rimuovere con cura il supernatante da un tubo di cellule mononucleari precedentemente centrifugate. Resuspend il pellet nella soluzione di perline magnetiche utilizzando 500 microlitri per 10 milioni di cellule.Mescolare delicatamente e incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Durante l'incubazione, preparare il dispositivo separatore cellulare sostituendo la soluzione di stoccaggio con il tampone di lavoro ed eseguendo un programma di lavaggio seguito da un programma di risciacquo. Quindi, aggiungere il buffer di funzionamento del separatore di celle fredde al tubo che contiene la miscela cellulare fino a quando il tubo non è completamente riempito.Centrifugare il tubo a 400 g e a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in tampone di funzionamento separatore freddo utilizzando due millilitri per 10 milioni di cellule. Trasferire la miscela di sospensione cellulare a due millilitri in tubi da 15 millilitri.Caricare tre set di tubi nel rack separatore di celle, che è stato pre-refrigerato a quattro gradi Celsius. Un insieme di tubi contiene MMC, il secondo set di tubi verrà utilizzato per raccogliere la frazione negativa e un terzo set di tubi verrà utilizzato per raccogliere celle cd34-positive purificate. Caricare il rack nel dispositivo separatore di cella ed eseguire il programma preimpostato.Successivamente, centrifugare i tubi contenenti la frazione positiva a 400 g e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule cd34-positive purificate in un millilitro di supporti senza siero. Quindi, utilizzare un contatore di celle automatizzato per contare le celle macchiate con arancio acridina o ioduro di propidio.In primo luogo, preparare un volume sufficiente di supporti per placcare le cellule cd34 positive purificate ad una densità di 33.000 cellule per millilitro. Placcare le cellule cd34 positive purificate in una piastra da 12 porri a una densità cellulare di 50.000 cellule in 1,5 millilitri di supporto per pozzo. Incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per 16 ore.Aggiungere acido valproico alle colture in modo che la concentrazione finale sia di un millimolare. Continuare a coltivare le cellule alle stesse condizioni per altri sette giorni. In questo protocollo ex vivo, il numero di cellule staminali ematopoietiche primitive generate da cellule positive cd34 isolate dal sangue del cordone ombelicale è aumentato.Il numero totale di cellule nucleate è significativamente più elevato nelle colture trattate con il solo cocktail di citochine. Nonostante il maggior numero di cellule nucleate totali, il numero di cellule staminali ematopoietiche nelle colture che ricevono il cocktail di citochine da solo rimane basso durante l'intero periodo di espansione, rispetto alle colture trattate con cocktail di citochina e acido valproico. Il maggior numero di cellule staminali ematopoietiche viene generato in colture trattate con una combinazione del cocktail di citochine e dell'acido valproico.In particolare, la maggiore espansione viene raggiunta dopo cinque o sette giorni dopo il trattamento con acido valproico. Questo aumento del numero di cellule staminali ematopoietiche è correlato con un rapido aumento della percentuale di cellule staminali ematopoietiche, che è notevole entro 24 ore dal trattamento con acido valproico. Mentre l'aumento della percentuale viene mantenuto durante i primi quattro giorni di coltura ex vivo, diminuisce progressivamente dopo cinque o sette giorni di trattamento.Tuttavia, questa diminuzione è inversamente correlata con un aumento del numero assoluto di cellule staminali ematopoietiche. Il rapido aumento della percentuale di cellule staminali ematopoietiche nelle colture trattate con acido valproico è dovuto all'acquisizione del fenotipo CD90. Le cellule cd34 positive che esprimono il marcatore fenotipico CD90 raggiungono quasi il 40-50% delle cellule espanse in colture ex vivo trattate con il cocktail di citochine e l'acido valproico per quattro giorni.L'acquisizione del fenotipo CD90 è poi confermata dall'espansione ex vivo delle cellule cd34-positive altamente purificate che mancano di espressione del marcatore CD90. Entro 24 ore dal trattamento con acido valproico, quasi il 75% delle cellule espanse ex vivo esprime CD90. Questo fenotipo è altamente mantenuto durante i primi quattro giorni in queste culture.Il sangue del cordone ombelicale diluito deve essere erogato molto lentamente sopra il gradiente di densità mantenendo il tubo con un angolo di 45 gradi per creare due strati distinti. Seguendo questa procedura di espansione ex vivo, le cellule espanse possono essere iniettate nei topi NSG immuno-carenti mieloablati per testarne la funzionalità e il potenziale di innesto. Le cellule espanse possono essere utilizzate per testare una varietà di domande riguardanti la biologia dell'HSC umano e del topo e il ruolo di diversi geni o giocatore critico sull'integrità funzionale degli HSC.La funzionalità dell'HSC espanso ex vivo dall'unità ematica del cordone ombelicale umano, utilizzando questa tecnica, sarà presto testata in uno studio clinico in paziente con neoplasie maligne ematologiche che richiedono il trapianto di midollo osseo allogenico. Questa tecnica ci ha anche permesso di indagare il meccanismo alla base dell'espansione ex vivo con il trattamento VPA e ottenere approfondimenti sulla biologia degli HSC primitivi.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Medicina

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Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generazione di un umanizzato mouse Fegato Utilizzando epatici umani cellule staminali

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

L&#39;esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani migliora in modo significativo Analisi A valle delle cellule bersaglio

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per la valutazione della risposta farmacologica nella fibrosi cistica pazienti

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...