Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
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この作品は、NYSTEM によって支えられた相対湿度に C030136 を付与彼のフィードバックと原稿の改正バーテック ジャブロン スキーに感謝したいと思います

Ex vivo 拡張プロトコル HSC マウントサイナイ医科大学の研究倫理委員会のガイドラインに従います。
1. バッファーとメディアの準備
<ol><li>分離バッファー CD34 の分離前に 24 h の準備+細胞 UBCs から 2 mL 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、7.5% の 33 mL を追加してウシ血清アルブミン (BSA) バッファー 465 mL 生理食塩水 (1 x PBS)。穏やかに混合し、4 ° C で一晩バッファ?...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. 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ここで、急速にかなりの程度まで Ucb から機能人間 HSCs の数を拡大するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用してパイロットと速度論的研究が示す、前のヴィヴォ拡張セルは速やかに獲得・ CD90 プリミティブ HSC 代謝特性9などいくつかの HSC 形質マーカーの発現を維持します。
この ex vivo 拡張プロトコルは比較的単純で信頼性の高いです。...

臍帯血から造血幹細胞 (造血) の体外増幅 (UCB) 単位は再生医療や移植療法の HSC のアプリケーションのための大きい約束を保持します。UCB ユニットで移植が簡単なコレクション、高可用性、感染リスクを最小限、病気再発のリスクが低い、移植片対宿主病 (GVHD) の低周波などいくつかのユニークな利点。しかし、臨床現場での使用の主要な欠点は HSCs 各 UCB ユニット1内の限られた数です。移植片拒絶反応や異常免疫再構築のリスク、造血回復遅延生着 HSCs 結果の不十分な数。
現在、様々 な方法と戦略は、前のヴィヴォ Ucb の HSCs の限られた数を拡大する開発されています。低分子や化合物の生体内培養 ex と異なるサイトカイン カクテルの組み合わせが様々 な角度で HSC 番号2,3,4,5,6、拡張の結果します。 7,8。重要なは、ex vivo 文化条件は急速な細胞増殖、代謝活動の増加、プライマリ HSCs を定義するプリミティブの特性の損失につながるストレスを誘発します。したがって、プライマリ原始造血に近い特性を持つ機能の HSCs の偉大な数の拡大につながる発展途上のプロトコルが必要です。
CD34 の無血清培養+細胞および Ucb から分離されたプリミティブ HSCs4,9,10の多数の拡張のバルプロ酸 (VPA) 結果で治療します。Ucb から派生した既存の HSCs の増殖のためにもっぱらは HSC 拡大しません。代わりに、この拡張は、細胞の分裂と増殖9.の限られた数と組み合わせて原始的な表現型の取得により、します。サイトカインとバルプロ酸、CD34 の組み合わせと孵化の初期の 24-48 時間以内+細胞トランスクリプトームと長期的な造血を特徴づける形質のプロファイルを取得します。HSCs のパーセントの大幅な増加は HSCs (バルプロ酸治療の 24 時間以内の 63 倍)9数のプロンプトの増加を伴います。特に、バルプロ酸 ex vivo 拡大戦略は、低代謝活動で、原始的な特徴をさらに強調する HSCs を展開します。
ここで説明したメソッドを提供条件といずれかのプリミティブの HSCs の体外増幅のかなりの程度まで導く治療臨床または実験室。バルプロ酸治療と組み合わせたサイトカイン カクテル ex vivo 拡大戦略を使用します。バルプロ酸は、双極性障害と他の神経疾患の治療のための FDA の承認薬です。バルプロ酸と HSC 拡大はプロンプトと操作の時間および汚染のリスクを最小限に抑え、7 日以内に発生します。重要なは、このプロトコルは、長期的な HSC 表現型マーカー CD90 など CD49f バルプロ酸9による治療の後 24-48 時間以内の取得できます。このプロトコルで作成された拡張の HSC 移植すべて造血細胞系統に分化し、次 myeloablated NSG マウスへの移植長期生着を確立できるので、造血系を再生成する能力があります。モデル4。また、このプロトコルは再現性の高い、現実的な CD34 を効率的で迅速な分離できます+細胞 Ucb、この手順の工業化のために重大であります。
Ex vivo 拡張プロトコル バルプロ酸も遺伝子11を編集中に発生する HSCs の大幅な損失を克服するために可能性があります。遺伝子編集サイクリング細胞および DNA 修復機構の活性化に必要なサイトカインへの露出が必要です。バルプロ酸治療のプロンプトの効果により、このメソッドはに関連して現在期間内遺伝子組み換え細胞数が高い世代は、遺伝子の修正のプロトコルを利用するため有益にかもしれない。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

臍帯血 (UCB) 単位は、同種骨髄移植が必要な患者のひと造血幹細胞 (造血) の代替ソースを提供します。UCB では、いくつかのユニークな利点がありますが、UCB の各ユニット内の HSCs の限られた数は、再生医療での使用と大人で HSC 移植を制限します。Ex vivo CD34 の培養により機能人間 HSCs の効率的な拡張を可能+細胞 Ucb から分離と脱アセチル化酵素阻害剤、バルプロ酸 (VPA) と扱われる。ここで詳細なプロトコルを記述する培養条件および CD34 を急速に分離の方法論+細胞し、プリミティブの HSCs のプールの高度に拡張します。拡張の HSCs は短期および長期生着を確立することができる、すべての種類の分化した造血細胞に上昇を与えることができます。このメソッドは、自家 HSC 遺伝子治療の臨床応用の可能性を保持しても、遺伝子の編集に関連付けられた機能の HSCs の損失を克服するために魅力的なアプローチを提供します。

ここで説明されているプロトコル前のヴィヴォ プリミティブ HSCs CD34 から生成された数の増加+ Ucb (図 1) から分離した細胞。CD34 のプライミング+サイトカイン カクテル、16 h のための細胞バルプロ酸による治療によって後に追加 7 日間は、HSC の拡張のすばらしい程度の 。HSCs CD34 によって定義される表現型の拡大された細胞のプ?...

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Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

ここで、ex は説明 cd34 陽性から造血幹細胞の体外増幅+臍帯血由来の細胞は、サイトカイン カクテルとバルプロ酸の併用治療します。このメソッドは、いずれかのプリミティブの HSCs の体外増幅のかなりの程度につながる臨床または実験室。

ひと臍帯血由来 cd34 陽性造血幹細胞の体外増幅+細胞を用いたバルプロ酸

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

臍帯血ユニットからの造血幹細胞のエクスビボ拡張は、再生医療および移植療法におけるHSCの適用に大きな約束を果たす。このプロトコルは、バルプロ酸処理と組み合わせたサイトカインカクテルを使用して、原始原始HSCに近い特性を持つ多数の機能性HSCを急速に拡大します。この方法は、現在使用されている遺伝子改変プロトコルに関連する期間内に、より多くの遺伝子組み換え細胞を生成するのに有益である可能性があります。バルプロ酸ex vivo拡張プロトコルは比較的簡単で信頼性の高いプロトコルです。細胞分離器装置を用いたCD34陽性細胞の精製は、非常に再現性が高く、迅速であり、高度に精製されたCD34陽性細胞の迅速な回収を可能にする。臍帯血からCD-34陽性細胞を単離する24時間前に、0.5モルEDTAの2ミリリットルと7.5%BSAの33ミリリットルを1X PBSの465ミリリットルに加えて分離バッファーを調製する。緩やかに緩やかに混ぜ、摂氏4度で一晩維持します。精製の日には、メディアを室温まで温めます。臍帯血ユニット全体を75平方センチメートルのフラスコに分配する。室温でPBSの等しい量で血液を希釈し、穏やかに混ぜます。次に、臍帯血ユニット全体の処理に必要な管数を決定する。各チューブに15ミリリットルの濃度勾配培地を加えます。希釈した血液を密度勾配の上に非常にゆっくりと分配し、チューブを45度の角度で保持して2つの層を作成します。400gでチューブを30分間遠心し、加速と減速速度が低い。遠心分離後、単核細胞は、プラズマと密度勾配培地層の間の白層に位置する。慎重に新しい、50ミリリットルのチューブにバフィーコート層を転送します。同じ臍帯血単位から25ミリリットルに達するまで、すべての単核細胞を50ミリリットルのチューブに集めます。25ミリリットルの単核細胞を含むチューブに25ミリリットルの冷たいPBSを加え、よく混ぜます。400gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を慎重に吸引し、50ミリリットルの冷たいPBSで細胞ペレットを再懸濁する。この後、カウント用の細胞懸濁液の20マイクロリットルを取り除く。自動化された細胞カウンターを使用して、アクリジンオレンジまたはヨウ化プロピジウムのいずれかで染色された細胞の数をカウントし、単核細胞の総数を計算します。その後、細胞を400gで遠心し、摂氏4度で15分間遠心する。まず、300マイクロリットルの分離バッファーをヒトFCRヒトIgGの100マイクロリットルと100マイクロリットルのCD34磁気ビーズと混合し、1000万個の単核細胞からCD34陽性細胞を単離する。次に、以前遠心分離された単核細胞のチューブから上清を慎重に除去する。1000万個の細胞あたり500マイクロリットルを使用して、磁気ビーズ溶液中のペレットを再懸濁します。穏やかに混ぜ、摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーション中に、貯蔵溶液を作業バッファーに置き換え、洗浄プログラムを実行し、続いてリンスプログラムを実行して、セル分離装置を準備します。次に、冷たいセル分離器の実行バッファーを、その細胞混合物を含むチューブに、チューブが完全に充填されるまで追加します。チューブを400g、摂氏4度で15分間遠心します。上清を吸引し、1000万個の細胞あたり2ミリリットルを使用して、冷たい分離器のランニングバッファー内の細胞ペレットを再懸濁する。2ミリリットルの細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。3セットのチューブをセルセパレータラックに積み込み、4°Cに予め冷却します。チューブの1セットにはMMCsが含まれ、2番目のチューブセットは負の分数を収集するために使用され、3番目のセットのチューブは精製されたCD34陽性細胞を収集するために使用されます。ラックをセル分離装置にロードし、事前設定プログラムを実行します。この後、正の分率を含むチューブを400gで400g、摂氏4度で15分間遠心する。上清を吸引し、精製したCD34陽性細胞を1ミリリットルの無血清培地で再懸濁する。次に、自動化された細胞カウンターを用いて、アクリジンオレンジまたはヨウ化プロピジウムで染色された細胞を数える。まず、精製したCD34陽性細胞を1ミリリットル当たり33,000細胞の密度でプレートするのに十分な量の培地を調製する。精製したCD34陽性細胞を12ウェルプレートに12ウェルプレートに入れ、1.5ミリリットルの培地で50,000細胞の細胞密度をプレートします。5%の炭酸ガス加湿インキュベーターで摂氏37度で16時間インキュベートします。最終濃度が1ミリモルになるように培養物にバルプロ酸を加える。さらに7日間同じ条件で細胞を培養し続ける。このex vivoプロトコルでは、臍帯血から分離したCD34陽性細胞から生成される原始造形幹細胞の数が増加する。有核細胞の総数は、サイトカインカクテル単独で処理した培養において有意に高い。総有核細胞の数が多いにもかかわらず、サイトカインカクテルを単独で受け取る培養物の造血幹細胞の数は、サイトカインカクテルおよびバルプロ酸で処理された培養物と比較して、全体の拡大期間中に低いままである。造血幹細胞の最大数は、サイトカインカクテルとバルプロ酸の組み合わせで処理された培養で生成されます。特に、バルプロ酸による処理の5~7日後に最大の膨張に達する。この造血幹細胞の増加数は、造血幹細胞の割合の迅速な増加と相関し、バルプロ酸による処理の24時間以内に顕著である。この割合の増加は、エキビボ培養の最初の4日間は維持されるが、5~7日間の治療後に徐々に減少する。しかし、この減少は造血幹細胞の絶対数の増加と逆相関している。バルプロ酸処理培養における造血幹細胞の割合の急激な増加は、CD90表現型の獲得によるものです。CD90表現性マーカーを発現するCD34陽性細胞は、サイトカインカクテルとバルプロ酸で4日間処理したエクスビボ培養で増殖した細胞のほぼ40〜50%に達する。CD90表現型の獲得は、CD90マーカーの発現を欠く高精製CD34陽性細胞のex vivo増殖によって確認される。バルプロ酸による処理の24時間以内に、エクスビボの拡張細胞のほぼ75%がCD90を発現する。この表現型は、これらの培養の最初の4日間に高く保持されています。希釈された臍帯血は、2つの異なる層を作成するために45度の角度でチューブを保持しながら、密度勾配の上に非常にゆっくりと分配する必要があります。このex vivo拡張手順に従って、拡張細胞を骨髄性免疫欠損NSGマウスに注入して、その機能性および生着ポテンシャルを試験することができる。拡張された細胞は、ヒトとマウスの両方のHSCの生物学とHSCの機能的完全性に関する異なる遺伝子または重要なプレーヤーの役割に関する様々な質問をテストするために使用することができます。この技術を用いてヒト臍帯血ユニットからHSCを拡大したex vivoの機能は、同種骨髄移植を必要とする血液学的悪性腫瘍患者の臨床試験ですぐに試験される。この技術はまた、VPA治療を用いてex vivo拡張の基礎となるメカニズムを調査し、原始的なHSCの生物学に関する洞察を得ることを可能にしました。

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

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