Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
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이 작품은 NYSTEM에 의해 지원 되었다 상대습도를 C030136 부여 우리는 그의 의견 및 원고 수정에 대 한 Bartek 피부색을 감사 하 고 싶습니다.

Ex vivo 확장 프로토콜 HSC 마운트 시 나이의 대학에 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 버퍼 및 미디어 준비
<ol><li>분리 버퍼 절연 CD34의 이전 24 시간 준비+ 세포 Ubc에서 0.5 M 에틸렌 Diamine Tetra-아세트산 (EDTA)의 그리고 7.5%의 33 mL 2 mL를 추가 하 여 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 버퍼링 465 mL 식 염 수 (1 x PBS)를. 부드럽게 혼합 하 고 하룻밤 4 ° c.에 버퍼를 유지</li>
	<li>정화의...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide,+a+SIRT1+inhibitor,+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment.">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), (2012).</li><li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Expansion+of+HSCs:+New+Possibilities+for+HSC+Transplants?.">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li><li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

여기, 우리는 빠르게 확장 하는 상당한 정도로 기능 인간의 HSCs의 수 UCBs에서 프로토콜을 제시. 이 프로토콜을 사용 하 여 파일럿 및 키네틱 연구 나타냅니다는 비보 전 확장된 셀 즉시 획득 및 여러 HSC phenotypic 마커 CD90 원시 HSC 대사 특성9등의 식을 유지.
Ex vivo 확장 프로토콜 이것은 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는입니다. CD34의 정화+ 셀 셀 구분 장...

탯 줄 혈액에서 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 비보 확장 전 (UCB) 단위 재생 의학 및 이식 치료에 HSC 응용 프로그램에 대 한 위대한 약속을 보유 하고있다. UCB 단위 이식 쉽게 컬렉션, 높은 가용성, 감염의 최소한의 위험, 저위험 질병 재발, 그리고 접목 대 주인 질병 (GVHD)의 낮은 주파수 몇 가지 독특한 장점이 있습니다. 그러나, 임상 설정에 그들의 사용의 주요 단점은 HSCs 각 UCB 단위1내 존재의 제한 된 수 있습니다. HSCs의 부족 수 지연된 engraftment 및 조 혈 복구, 이식 거부, 정도 벗어난 면역 재구성의 위험이 발생합니다.
현재, 다양 한 방법과 전략 비보 전 UCBs에서 HSCs의 제한 된 수 확장 개발 되었습니다. 작은 분자 또는 화합물에서 ex vivo 문화 결과 HSC 숫자2,3,,45,6, 확장의 다양 한 각도 다른 cytokine 칵테일의 조합 7,8. 중요 한 것은, ex vivo 문화 조건 유도 스트레스, 급속 한 세포 증식, 대사 활동 증가 주 HSCs를 정의 하는 기본 특성의 손실에 지도. 따라서, 개발 프로토콜을 기본 기본 HSCs 유사한 특성을 가진 기능 HSCs의 큰 숫자의 확장으로 이어질 필요 합니다.
혈 청 무료 문화 CD34의+ 셀 UCBs에서 고립 되 고 원시적인 HSCs4,,910의 다 수의 확장에 valproic 산 (VPA) 결과와 치료. HSC 확장 UCBs에서 파생 된 기존 HSCs의 확산 때문만 아니다. 대신,이 확장은 제한 된 수의 세포 분열과 증식9. 와 함께 기본 표현 형의 인수 때문 Cytokines 및 VPA, CD34의 조합 가진 외피의 초기 24-48 h 내+ 세포 transcriptomic 및 phenotypic 프로필 장기 HSCs 특성을 취득. HSCs의 비율이 크게 증가 HSCs (VPA 치료의 24 시간 이내 63 배 증가)9의 수에 있는 신속한 증가 동반 된다. 특히, VPA ex vivo 확장 전략 낮은 신진 대사 활동을 더 그들의 기본 특성을 강조 HSCs를 확장 합니다.
여기 설명 하는 방법을 제공 조건 및 트리 트 먼 트 중 하나에 대 한 기본 HSCs의 비보 확장 전 상당한 정도의 이어질 임상 또는 실험실 응용 프로그램. Ex vivo 확장 전략 cytokine 칵테일 VPA 치료와 함께 사용 합니다. VPA는 양극성 장애 및 다른 신경 질환의 치료에 대 한 FDA의 승인을 마약입니다. VPA HSC 확대 프롬프트 이며 조작의 시간와 오염 위험을 최소화 하는 7 일 이내 발생. 중요 한 것은,이 프로토콜은 마커의 장기 HSC phenotypic CD90 등 CD49f VPA9와 치료 다음과 24-48 시간 이내 수집에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 만든 확장된 HSC 이식 이후 그들은 모든 조 혈 세포 계보에 분화 하 고 장기 engraftment myeloablated NSG 쥐로 이식 다음을 설정할 수 조 혈 시스템을 재생성 하기 위해 용량을가지고 모델4. 또한,이 프로토콜 매우 재현할 수 이며 수 가능한 CD34의 효율적이 고 신속한 격리에 대 한+ UCBs에서 세포는이 절차의 산업화에 대 한 중요 한.
Ex vivo 확장 프로토콜 VPA는 또한 유전자11편집 하는 동안 발생 HSCs의 중요 한 손실을 극복 하기 위해 잠재력이 있다. 편집 진 순환 세포와 DNA 수리 메커니즘의 활성화에 필요한 cytokines에 노출을 해야 합니다. 현재 관련 된 시간의 기간 내 유전자 변형된 세포의 더 높은 번호의 세대 활용 유전자 수정 프로토콜에 대 한 VPA 치료의 신속한 효과 인해이 메서드는 도움이 될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

탯 줄 혈액 (UCB) 단위 수용자 골 수 이식 필요한 환자에 대 한 인간의 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 대체 소스를 제공 합니다. UCB는 몇 가지 고유한 장점, 재생 의학에 그들의 사용 및 성인 HSC 이식 각 UCB 단위 내의 HSCs의 제한 된 숫자 제한 합니다. 기능 인간의 HSCs의 효율적인 확장 ex vivo CD34의 경작에 의해 달성 될 수 있다+ 세포 UCBs에서 고립과 deacetylase 억제 물, valproic 산 (VPA)와 치료. 여기서 설명 하는 프로토콜에 설명 합니다 문화 조건 및 방법론을 빠르게 CD34+ 세포 높은 정도로 원시적인 HSCs의 수영장을 확장 하 고. 확장된 HSCs 모두 단기 및 장기 engraftment를 설정 할 수 있으며 모든 종류의 차별화 된 조 혈 모 세포를 야기할 수 있습니다. 이 메서드는 또한 헌 HSC 유전자 치료에서 임상 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 보유 하 고 편집 하는 유전자와 관련 된 기능 HSCs의 손실을 극복 하는 매력적인 접근을 제공 합니다.

비보 전 여기에 설명 된 프로토콜 기본 HSCs CD34에서 생성의 수를 증가+ UCBs (그림 1)에서 분리 하는 세포. CD34의 못쓰게+ 칵테일, cytokine로 16 h에 대 한 셀 뒤 VPA 치료 HSC 확장의 훌륭한 정도를 추가 7 일 리드에 대 한. 확장된 셀의 수영장 HSCs phenotypically CD34에 의해 정의 되는 대 한 높은 농축 놀랍게도,+CD90+ 마커. Cytokine 칵?...

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Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

여기, 우리는 전 설명 CD34에서 조 혈 줄기 세포의 생체 내 확장+ 세포 탯 줄 혈액에서 파생 된 칵테일 cytokine VPA의 조합으로 치료. 이 메서드 중 하나에 대 한 기본 HSCs의 비보 확장 전의 상당한 정도로 리드 임상 또는 실험실 응용 프로그램.

인간 탯 줄 혈액 파생 CD34에서 조 혈 줄기 세포의 생체 내 확장 전+ 세포 Valproic 산 사용 하 여

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

탯줄 혈액 단위에서 조혈 줄기 세포의 전 생체 확장은 재생 의학 및 이식 요법에서 HSC 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 개최. 이 프로토콜은 발프로산 치료와 결합된 사이토카인 칵테일을 사용하여 1차 원시 HSC와 유사한 특성을 가진 많은 기능성 HSC를 빠르게 확장합니다.이 방법은 현재 사용되는 유전자 수정 프로토콜에 관련있는 기간 내에 더 많은 수의 유전자 변형 세포의 생성에 도움이 될 수 있습니다. valproic acid ex vivo 확장 프로토콜은 상대적으로 간단 하 고 신뢰할 수 있습니다. 세포 분리기 장치와 CD34 양성 세포의 정제는 매우 재현 가능하고 빠른, 고도로 정제 된 CD34 양성 세포의 빠른 복구를 허용.탯줄 혈액으로부터 CD-34 양성 세포의 격리 24시간 전에, 0.5 개의 어금니 EDTA의 2밀리리터와 7.5%BSA의 33 밀리리터를 1X PBS의 465 밀리리터에 추가하여 분리 완충액을 준비한다. 버퍼를 부드럽게 섞고 섭씨 4도에서 하룻밤을 유지합니다. 정화 당일에는 미디어를 실온으로 데워보실 수 있습니다.전체 탯줄 혈액 을 75 평방 센티미터 플라스크로 분배합니다. 실온에서 PBS의 동일한 부피로 혈액을 희석하고 부드럽게 섞습니다. 다음으로, 전체 탯줄 혈액 단위를 처리하는 데 필요한 튜브의 수를 결정합니다.각 튜브에 밀도 그라데이션 미디어 15밀리리터를 추가합니다. 45도 각도로 튜브를 유지하면서 밀도 그라데이션 위에 희석 된 혈액을 매우 느리게 분배하여 두 층을 만듭니다. 낮은 가속 및 감속 속도로 30 분 동안 400g에서 튜브를 원심 분리합니다.원심분리 후, 단일핵 세포는 플라즈마와 밀도 그라데이션 미디어 층 사이의 백색 층에 위치하게 된다. 버피 코트 레이어를 새로운 50밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮킨다. 동일한 탯줄 혈액 단위에서 모든 단일 핵 세포를 50 밀리리터 튜브로 수집하여 25 밀리리터에 도달하십시오.단핵 세포의 25 밀리리터를 포함하는 관에 차가운 PBS의 25 밀리리터를 추가하고 잘 섞는다. 원심분리기는 400g, 섭씨 4도에서 10분 간. 조심스럽게 슈퍼 나티를 흡인하고 차가운 PBS의 50 밀리리터에서 세포 펠릿을 재중단.그 후 셀 서스펜션의 마이크로리터 20을 제거하여 계수합니다. 자동 세포 카운터를 사용하여 아크리딘 오렌지 또는 프로피듐 요오드로 염색된 세포의 수를 계산하고 단일 핵 세포의 총 수를 계산합니다. 그런 다음 세포를 400g에서 15 분 동안 섭씨 4도에서 원심 분리합니다.첫째, 분리 버퍼 300마이크로리터를 인간 FCR 인간 IgG 100 마이크로리터와 CD34 자성 구슬 100마이크로리터와 혼합하여 CD34 양성 세포를 1,000만 개의 단일핵 세포로부터 분리한다. 다음으로, 이전에 원심분리된 단일핵 세포의 튜브에서 상체를 조심스럽게 제거한다. 1,000만 개의 세포당 500마이크로리터를 사용하여 자기 비드 용액의 펠릿을 재중단합니다.부드럽게 섞어서 섭씨 4도에서 30분간 배양하세요. 인큐베이션 중에 저장 액액을 작업 버퍼로 대체하고 세척 프로그램을 실행한 다음 헹구는 프로그램을 실행하여 셀 분리기 장치를 준비합니다. 그런 다음, 튜브가 완전히 채워지도록 세포 혼합물을 포함하는 튜브에 버퍼를 실행하는 콜드 셀 분리기를 추가합니다.원심 분리는 400g에서 4°C에서 15분 동안 튜브를 원심분리합니다. 1,000만 개의 세포당 2밀리리터를 사용하여 완충을 실행하는 차가운 분리기에서 셀 펠릿을 흡인하고 재주용한다. 2밀리리터 세포 현탁액 혼합물을 15밀리리터 튜브로 옮기습니다.3세트의 튜브를 셀 분리기 랙에 적재하여 섭씨 4도까지 미리 냉각됩니다. 튜브의 한 세트는 MmC를 포함, 튜브의 두 번째 세트는 음극을 수집하는 데 사용됩니다, 튜브의 세 번째 세트는 정제 CD34 양성 세포를 수집하는 데 사용됩니다. 랙을 셀 분리기 장치에 로드하고 미리 설정된 프로그램을 실행합니다.그 후, 15분 동안 400g에서 400g, 섭씨 4도에서 양수를 포함하는 튜브를 원심분리합니다. 수퍼네티드를 흡습하고 정제된 CD34 양성 세포를 혈청이 없는 매체의 1밀리리터로 재보선다. 그런 다음 자동화된 세포 카운터를 사용하여 아크리딘 오렌지 또는 요오드로 염색된 세포를 계산합니다.먼저, 밀리리터당 33, 000 세포의 밀도로 정제된 CD34 양성 세포를 플레이트에 충분한 양의 매체를 준비한다. 50, 000 세포의 세포 밀도에서 12웰 플레이트에서 정제된 CD34 양성 세포를 잘 당 1.5 밀리리터에서 플레이트. 16시간 동안 5%의 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다.최종 농도가 1 밀리머인 배양에 valproic 산을 추가합니다. 추가 7 일 동안 동일한 조건에서 세포를 배양 계속합니다. 이 전 생체 프로토콜에서, 탯줄 혈액으로부터 분리된 CD34 양성 세포로부터 생성된 원시 조혈 줄기 세포의 수가 증가한다.핵 세포의 총 수는 사이토카인 칵테일로만 처리된 배양에서 상당히 높습니다. 총 핵세포의 수가 증가함에도 불구하고 사이토카인 칵테일을 단독으로 받는 배양에서 조혈 줄기세포의 수는 사이토카인 칵테일과 발프로산으로 치료된 배양에 비해 전체 확장 기간 동안 낮게 유지되고 있다. 가장 많은 수의 조혈 줄기 세포는 사이토카인 칵테일과 발프로산의 조합으로 처리된 배양에서 생성됩니다.특히, 발프로산으로 치료한 후 5~7일 후에 가장 큰 팽창이 이루어졌습니다. 이 증가된 조혈 줄기 세포수는 발프로산으로 치료한 지 24시간 이내에 주목할 만한 조혈 줄기 세포의 비율의 급격한 증가와 상관관계가 있습니다. 백분율의 증가는 전 생체 문화의 첫번째 4 일 도중 유지되는 동안, 처리의 5 7 일 후에 점진적으로 감소합니다.그러나, 이 감소는 조혈 줄기 세포의 절대 수의 증가와 반비례한다. valproic-acid-처리 된 배양에서 조혈 줄기 세포의 비율의 급속한 증가는 CD90 표현형의 취득에 기인한다. CD34 양성 세포는 CD90 표현마커를 표현하여 4일 동안 사이토카인 칵테일 및 발프로산으로 처리된 전 생체 배양에서 확장된 세포의 거의 40~50%에 도달한다.CD90 표현형의 획득은 CD90 마커의 발현이 결여된 고도로 정제된 CD34 양성 세포의 전 생체 확장에 의해 확인된다. 발프로산으로 치료한 지 24시간 이내에, 전 생체내 확장 세포의 거의 75%가 CD90을 발현한다. 이 표현형은 이러한 배양에서 처음 4일 동안 매우 유지됩니다.희석 된 코드 피는 튜브를 45도 각도로 유지하면서 밀도 그라데이션 위에 매우 천천히 분배되어야하며 두 개의 뚜렷한 층을 만들어야합니다. 이 전 생체 확장 절차에 따라 확장 된 세포는 그들의 기능성 및 이식 잠재력을 테스트하기 위해 myeloablated 면역 결핍 NSG 마우스로 주입 될 수 있습니다. 확장된 세포는 인간과 마우스 HSC의 생물학 과 HSC의 기능적 무결성에 대한 다른 유전자 또는 중요한 플레이어의 역할에 관한 다양한 질문을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.이 기술을 사용하여 인간 탯줄 혈액 단위에서 HSC를 확장 한 ex vivo의 기능은 곧 동종 골수 이식을 필요로하는 혈액 학적 악성 종양 환자의 임상 시험에서 테스트 될 것입니다. 이 기술은 또한 VPA 처리를 가진 전 생체 확장의 기초가 되는 기계장치를 조사하고 원시 HSCs의 생물학에 대한 통찰력을 얻는 것을 허용했습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

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연구

의학

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

인간 세포주에서 Chemoresistant 난소 암 줄기 세포에 대한 심화 학습

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

포스 콜린 유발 장내 Organoids에 붓기 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 분석 낭포 성 섬유증 환자의 약물 반응을 평가하기위한

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...