Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NYSTEM gi C030136 til R.H. Vi vil gjerne takke Bartek Jablonski for hans tilbakemeldinger og revisjon av manuskriptet

HSC ex vivo ekspansjon protokollen følger retningslinjene for etikk for forskning på Mount Sinai School of Medicine.
1. buffer og Media
<ol><li>Forberede separasjon buffer 24 timer før isolering av CD34+ celler fra UBCs ved å legge til 2 mL av 0,5 M etylen Diamine Tetra-eddiksyre (EDTA) og 33 mL 7,5% Bovine Serum Albumin (BSA) til 465 mL bufret saltvann (1 x PBS). Bland forsiktig og vedlikeholde bufferen overnatting på 4 ° C.</li>
	<li>Varm media ved romtemperatur ved rensin...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide,+a+SIRT1+inhibitor,+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment.">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), (2012).</li><li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Expansion+of+HSCs:+New+Possibilities+for+HSC+Transplants?.">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li><li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

Her presenterer vi en protokoll for å raskt utvide betydelig antall funksjonell menneskelige HSCs fra UCBs. Pilot og kinetisk studier bruker denne protokollen indikerer at den ex vivo utvidet cellene raskt skaffe og beholde uttrykk for flere HSC fenotypiske indikatorer inkludert CD90 samt primitive HSC metabolske egenskaper9.
Dette ex vivo ekspansjon protokollen er relativt enkel og pålitelig. Rensing av CD34+ celler med cellen skilletegn enheten (se <stron...

Ex vivo utvidelse av blodkreft stamceller (HSCs) fra navlestrengsblod (UCB) enheter har store løftet for HSC programmer i regenerativ medisin og transplantasjon behandling. Transplantasjon med UCB enheter har flere unike fordeler som lett samling, høy tilgjengelighet, minimal risiko for infeksjon, lav risiko for sykdom tilbakefall, og lav frekvens av graft versus host sykdom (GVHD). Større ulempene av deres bruk i klinisk er imidlertid begrenset antall HSCs stede i hver UCB enhet1. Utilstrekkelig antall HSCs resulterer i forsinket engraftment og blodkreft utvinning, risiko for pode avvisning og avvikende immune rekonstituering.
Foreløpig har ulike metoder og strategier blitt utviklet for å ex vivo utvide begrenset antall HSCs fra UCBs. Kombinasjoner av ulike cytokin cocktailer med små molekyler eller forbindelser i ex vivo kulturer føre til ulike grader av ekspansjon i HSC tall2,3,4,5,6, 7,8. Viktigere, ex vivo kultur indusere vilkår stress, fører til rask celle spredning, økt metabolsk aktivitet og tap av arter som definerer primære HSCs. Derfor er utvikle protokoller som fører til utvidelse av et stort antall funksjonelle HSCs med egenskaper som ligner primære primitive HSCs nødvendig.
Serum-free kulturer av CD34+ celler isolert fra UCBs og behandlet med valproic acid (VPA) resultere i utvidelsen av store antall primitive HSCs4,9,10. HSC utvidelsen er ikke utelukkende på grunn av spredning av de eksisterende HSCs avledet fra UCBs. I stedet skyldes denne utvidelsen kjøpet av en primitiv fenotypen kombinert med et begrenset antall celledelinger og spredning9. Innen de første 24-48 timer med inkubering med en kombinasjon av cytokiner og VPA, CD34+ cellene erverver en transcriptomic og fenotypiske profil som karakteriserer langsiktige HSCs. Den betydelige økningen i andelen HSCs er ledsaget av en rask økning i antall HSCs (63 fold økning innen 24 timer av VPA behandling)9. Spesielt utvider VPA-ex vivo ekspansjonsstrategi HSCs med lav metabolsk aktivitet, som ytterligere understreker deres arter.
Metoden beskrevet her gir forhold og behandlinger som fører til en betydelig grad av ex vivo utvidelse av primitive HSCs for klinisk eller laboratorium programmer. Denne ex vivo ekspansjonsstrategi bruker en cytokin cocktail kombinert med VPA behandling. VPA er en FDA godkjent narkotika for behandling av bipolar lidelser og andre nevrologiske sykdommer. HSC utvidelse med VPA er rask og oppstår innen 7 dager, minimere både av manipulasjon og fare for angrep. Viktigere, lar denne protokollen for kjøp av langsiktige HSC fenotypiske markører som CD90 og CD49f innen 24-48 timer etter behandling med VPA9. Utvidet HSC grafts opprettet med denne protokollen har kapasitet til å regenerere blodkreft systemet siden de kan skille ut alle blodkreft celle overleveringslinjer og etablere langsiktig engraftment etter transplantasjon i myeloablated NSG mus modeller4. Dessuten, denne protokollen er svært reproduserbar og gir effektiv og rask isolering av levedyktig CD34+ celler fra UCBs, som er avgjørende for industrialisering av denne prosedyren.
VPA ex vivo ekspansjon protokollen har potensial til å overvinne betydelige tap av HSCs som oppstår under genet redigering11. Gene redigering krever eksponering for cytokiner, som er nødvendig for sykling celler og aktivering av DNA-reparasjon mekanismer. På grunn av rask effekten av VPA behandling, kan denne metoden være gunstig for generering av et større antall genmodifiserte celler innenfor en periode som er relevante for utnyttet genet modifikasjon protokoller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

Navlestreng blod (UCB) enheter gir en alternativ kilde for menneskelig blodkreft stamceller (HSCs) for pasienter som trenger allogene benmarg transplantasjon. Mens UCB har flere unike fordeler, begrenser begrenset antall HSCs innenfor hver UCB enhet deres bruk i regenerativ medisin og HSC transplantasjon hos voksne. Effektiv utvidelse av funksjonell menneskelige HSCs oppnås ved ex vivo dyrking av CD34+ celler isolert fra UCBs og behandles med en deacetylase hemmer, valproic acid (VPA). Protokollen detaljert her beskriver oppdrettsforholdene og metodikk raskt isolere CD34+ celler og utvide til en høy grad en pool av primitive HSCs. De utvidede HSCs er i stand til å etablere både kortsiktige og langsiktige engraftment og kan gi opphav til alle typer differensiert blodkreft cellene. Denne metoden også har potensial for klinisk anvendelse i autologous HSC genterapi og gir en attraktiv tilnærming for å overvinne tap av funksjonelle HSCs forbundet med gene redigering.

Den ex vivo protokoll beskrevet her øker antallet primitive HSCs generert fra CD34+ celler isolert fra UCBs (figur 1). Grunning av CD34+ celler for 16 h med et cytokin cocktail, etterfulgt av behandling med VPA for ytterligere 7 dager, fører til en stor grad av HSC ekspansjon. Bemerkelsesverdig, pool av utvidet celler er høyanriket for HSCs, som er svært definert av CD34+CD90+ markører. Totalt antall kjerne cel...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Her beskriver vi ex vivo utvidelse av blodkreft stamceller fra CD34+ cellene stammer fra navlestrengsblod behandlet med en kombinasjon av cytokin cocktail og VPA. Denne metoden fører til en betydelig grad av ex vivo utvidelse av primitive HSCs for klinisk eller laboratorium programmer.

Ex Vivo utvidelse av blodkreft stamceller fra menneskelige navlestreng blod-avledet CD34+ celler ved hjelp av Valproic Acid

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Ex vivo utvidelse av hematopoietic stamcelle fra navlestreng blod enhet holder stort løfte for HSC søknad i regenerativ medisin og transplantasjon terapi. Denne protokollen bruker en cytokincocktail kombinert med valproinsyrebehandling for raskt å utvide et stort antall funksjonelle HSCer med egenskaper som ligner primære primitive HSCer. På grunn av de raske effektene av valproinsyrebehandling, har denne metoden også potensial til å overvinne tapet av HSCer forbundet med genredigering.Denne metoden kan være gunstig for generering av et høyere antall genmodifiserte celler innen en tidsperiode som er relevant for brukte genmodifiseringsprotokoller. Valproic acid ex vivo ekspansjonsprotokollen er relativt enkel og pålitelig. Rensing av CD34-positive celler med celleskilleenheten er svært reproduserbar og rask, noe som gir rask gjenoppretting av svært rensede CD34-positive celler.24 timer før isolering av CD-34 positive celler fra navlestrengblod, forberede separasjonsbufferen ved å legge til to milliliter på 0,5 molar EDTA og 33 milliliter på 7,5% BSA til 465 milliliter 1X PBS. Bland bufferen forsiktig og vedlikehold den over natten ved fire grader Celsius. På rensedagen varmer du mediene til romtemperatur.Dispenser hele navlestrengblodenheten i en 75 kvadratcentimeter kolbe. Fortynn blodet med et likt volum PBS ved romtemperatur og bland forsiktig. Deretter bestemmer du antall rør som kreves for behandling av hele navlestrengblodenheten.Tilsett 15 milliliter med tetthetsgradientmedier i hvert rør. Dispenser det fortynnede blodet veldig sakte på toppen av tetthetsgradienten mens du holder røret i en 45-graders vinkel for å lage to lag. Sentrifuger røret ved 400 g i 30 minutter med lav akselerasjon og retardasjonshastighet.Etter sentrifugeringen vil de mononukleære cellene bli plassert i det hvite laget mellom plasma- og tetthetsgradientmedielagene. Overfør forsiktig det buffy pelslaget til et nytt, 50-milliliter rør. Samle alle mononukleære celler fra samme navlestreng blodenhet i en 50-milliliter tube til nå 25 milliliter.Tilsett 25 milliliter kald PBS til røret som inneholder 25 milliliter mononukleære celler og bland godt. Sentrifuge på 400 g og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Aspirer forsiktig den overnaturante og resuspend cellepellet i 50 milliliter kald PBS.Etter dette fjerner du 20 mikroliter av cellesuspensjonen for telling. Bruk en automatisert celleteller for å telle antall celler farget med enten acridine oransje eller propidiumjodid og beregne det totale antallet mononukleære celler. Deretter sentrifuger cellene ved 400 g og ved fire grader Celsius i 15 minutter.Bland først 300 mikroliter separasjonsbuffer med 100 mikroliter av humant FCR humant IgG og 100 mikroliter cd34 magnetiske perler for å isolere CD34-positive celler fra 10 millioner mononukleære celler. Deretter fjerner du forsiktig det overnaturlige fra et rør av tidligere sentrifugerte mononukleære celler. Resuspend pellet i den magnetiske perleløsningen ved hjelp av 500 mikroliter per 10 millioner celler.Bland forsiktig og inkuber ved fire grader Celsius i 30 minutter. Under inkubasjonen klargjør du celleskilleenheten ved å erstatte lagringsløsningen med arbeidsbufferen og kjøre et vaskeprogram etterfulgt av et skylleprogram. Deretter legger du til kald celleskillemaskin som kjører buffer til røret som inneholder celleblandingen til røret er helt fylt.Sentrifuger røret på 400 g og ved fire grader Celsius i 15 minutter. Aspirer den overnaturante og gjenoppusser cellepelleten i kald separator som kjører buffer ved hjelp av to milliliter per 10 millioner celler. Overfør den to milliliter cellefjæringsblandingen til 15-milliliter rør.Last tre sett med rørene inn i celleseparatorstativet, som har blitt kjølt ned til fire grader Celsius. Ett sett med rør inneholder MMCer, det andre settet med rør vil bli brukt til å samle den negative fraksjonen, og et tredje sett med rør vil bli brukt til å samle rensede CD34-positive celler. Legg stativet inn i celleskilleenheten og kjør det forhåndsinnstilte programmet.Etter dette sentrifuger rørene som inneholder den positive fraksjonen på 400 g ved og fire grader Celsius i 15 minutter. Aspirer de overnaturante og gjenoppusstrengjorte CD34-positive cellene i ett milliliter serumfritt medium. Deretter bruker du en automatisert celleteller for å telle cellene farget med akridin oransje eller propidiumjodid.Først forberede et tilstrekkelig volum av media for å plate rensede CD34-positive celler med en tetthet på 33,000 celler per milliliter. Plate de rensede CD34-positive cellene i en 12-brønns plate med en celletetthet på 50 000 celler i 1,5 milliliter media per brønn. Inkuber ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksid fuktet inkubator i 16 timer.Tilsett valproinsyre til kulturene slik at den endelige konsentrasjonen er en millimolar. Fortsett å kultere cellene på de samme forholdene i ytterligere syv dager. I denne ex vivo protokollen økes antall primitive hematopoetiske stamceller generert fra CD34-positive celler isolert fra navlestrengblod.Det totale antallet kjerneceller er betydelig høyere i kulturer behandlet med cytokincocktailen alene. Til tross for det høyere antallet totale nukleerte celler, forblir antall hematopoetiske stamceller i kulturene som mottar cytokincocktailen alene lavt i hele ekspansjonsperioden, sammenlignet med kulturer behandlet med cytokincocktail og valproinsyre. Det største antallet hematopoetiske stamceller genereres i kulturer behandlet med en kombinasjon av cytokincocktailen og valproinsyre.Spesielt er den største utvidelsen nådd etter fem til syv dager etter behandling med valproinsyre. Dette økte antallet hematopoetiske stamceller korrelerer med en rask økning i prosentandelen av hematopoetiske stamceller, noe som er bemerkelsesverdig innen 24 timer etter behandling med valproinsyre. Mens økningen i prosentandelen opprettholdes i løpet av de første fire dagene av ex vivo kultur, det avtar gradvis etter fem til syv dager med behandling.Denne nedgangen er imidlertid omvendt korrelert med en økning i det absolutte antallet hematopoetiske stamceller. Den raske økningen i prosentandelen av hematopoetiske stamceller i valproinsyrebehandlede kulturer skyldes oppkjøpet av CD90 fenotypen. CD34-positive celler som uttrykker CD90 fenotypisk markør nå nesten 40 til 50% av cellene utvidet i ex vivo kulturer behandlet med cytokin cocktail og valproinsyre i fire dager.Oppkjøpet av CD90 fenotypen bekreftes deretter av ex vivo-utvidelsen av de svært rensede CD34-positive cellene som mangler uttrykk for CD90-markøren. Innen 24 timer etter behandling med valproinsyre, uttrykker nesten 75% av ex vivo utvidede celler CD90. Denne fenotypen er sterkt beholdt i løpet av de første fire dagene i disse kulturene.Det fortynnede ledningsblodet skal dispenseres veldig sakte på toppen av tetthetens gradient mens du holder røret i en 45-graders vinkel for å skape to forskjellige lag. Etter denne ex vivo-utvidelsesprosedyren kan de utvidede cellene injiseres i de myeloablaterte immunmangelfulle NSG-musene for å teste funksjonaliteten og engraftmentpotensialet. De utvidede cellene kan brukes til å teste en rekke spørsmål om biologien til både menneskelig og mus HSC og rollen til forskjellige gener eller kritisk spiller på den funksjonelle integriteten til HSCer.Funksjonaliteten til ex vivo utvidet HSC fra human navlestreng blodenhet, ved hjelp av denne teknikken, vil snart bli testet i en klinisk studie hos pasienter med hematologiske maligniteter som krever allogen benmargstransplantasjon. Denne teknikken har også gjort det mulig for oss å undersøke mekanismen som ligger til grunn for ex vivo-utvidelsen med VPA-behandling og få innsikt i biologien til primitive HSCer.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Dannelse av human prostata Epitel hjelp Tissue rekombinasjon av gnager Urogenitale Sinus mesenchyme og menneskelige stamceller

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sekvensiell<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av osteogent Stem / stamceller under brudd Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av kreft stamceller fra menneskelige prostata kreft Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Berikelse for kjemoresistent eggstokkreft stamceller fra humane cellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studerer Bukspyttkjertelkreft Stem Cell Kjennetegn for å utvikle nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generering av Microtumors Bruke 3D Menneskelig Biogel Kultur System og pasient-avledet glioblastom celler for Kinomic Profilering and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering av en humanisert muselever med humane lever stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-indusert Hevelse i tarmen Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyse for å vurdere Drug Response i pasienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...