Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
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Este trabalho foi financiado pelo NYSTEM conceder a C030136 de R.H. Gostaríamos de agradecer seu feedback e revisão do manuscrito Bartek Jablonski

O HSC ex vivo protocolo de expansão segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa no Mount Sinai School of Medicine.
1. o buffer e preparação de meios de comunicação
<ol><li>Preparar o tampão de separação 24 h antes do isolamento do CD34+ células de UBCs, adicionando 2 mL de 0.5 M etileno diamina Tetra-ácido acético (EDTA) e 33 mL de 7,5% albumina de soro bovino (BSA) para 465 mL tamponada solução salina (1X PBS). Misture suavemente e manter o buffer durante a ...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

Neste documento, apresentamos um protocolo para rapidamente expandir significativamente o número de linfócitos humanos funcionais de UCBs. Os estudos cinéticos e piloto usando este protocolo indicam que o ex vivo expandidas células prontamente adquirir e manter a expressão de vários marcadores fenotípicos HSC incluindo CD90, bem como os primitivos HSC características metabólicas9.
Ex vivo protocolo de expansão é relativamente simples e confiável. Purificaç?...

Ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) do sangue do cordão umbilical unidades (UCB) é uma grande promessa para aplicações de HSC na terapia de transplante e medicina regenerativa. Transplante com unidades UCB tem várias vantagens exclusivas, tais como a coleção fácil, alta disponibilidade, risco mínimo de infecção, baixo risco de recaída da doença e de baixa frequência da doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD). No entanto, as principais desvantagens da sua utilização em ambientes clínicos são o número limitado de linfócitos presentes dentro de cada UCB unidade1. O número insuficiente de linfócitos resulta em atrasada enxertia e recuperação hematopoiética, risco de rejeição do enxerto e reconstituição imune aberrante.
Atualmente, vários métodos e estratégias foram desenvolvidas para ex vivo expandir o número limitado de linfócitos de UCBs. Combinações de diferentes citocinas cocktails com pequenas moléculas ou compostos em ex vivo resultado de culturas em vários graus de expansão em HSC números2,3,4,5,6, 7,8. Importante, ex vivo cultura condições induzem estresse, levando à proliferação celular rápida, aumento da atividade metabólico e perda das características primitivas que definem linfócitos primários. Portanto, protocolos em desenvolvimento que levam à expansão de um grande número de linfócitos funcionais com características que se assemelham a primários linfócitos primitivos são necessários.
Culturas de soro livre de CD34+ células isoladas de UCBs e tratados com resultado de (VPA) ácido valproico na expansão de um grande número de linfócitos primitivos4,9,10. A expansão de HSC não é unicamente devido à proliferação dos linfócitos existentes derivado UCBs. Em vez disso, esta expansão é devido à aquisição de um fenótipo primitivo, combinado com um número limitado de divisões celulares e proliferação9. Dentro o inicial 24 – 48 h de incubação com uma combinação de citocinas e VPA, CD34+ células adquirem um perfil fenotípico que caracterizam a longo prazo linfócitos e transcriptomic. O aumento significativo da percentagem de linfócitos é acompanhado por um aumento rápido do número de linfócitos (aumento de 63 vezes dentro de 24 h de tratamento VPA)9. Nomeadamente, a estratégia de expansão do VPA-ex vivo expande linfócitos com baixa atividade metabólica, que destaca ainda mais suas características primitivas.
O método descrito aqui fornece condições e tratamentos que levam a um grau significativo de ex vivo expansão dos linfócitos primitivos para qualquer clínica ou aplicações de laboratório. Ex vivo de estratégia de expansão usa um cocktail de citocina combinado com tratamento de VPA. VPA é um medicamento aprovado pela FDA para o tratamento de transtorno bipolar e outras doenças neurológicas. A expansão de HSC com VPA é rápida e ocorre dentro de 7 dias, minimizando o tempo de manipulação e o risco de contaminação. Importante, este protocolo permite a aquisição de longo prazo marcadores fenotípicos de HSC como CD90 e CD49f dentro de 24-48 h após o tratamento com VPA9. Enxertos HSC expandidos criados com este protocolo têm a capacidade de regenerar o sistema hematopoiético, uma vez que podem se diferenciar em todas as linhagens de células hematopoiéticas e estabelecer a longo prazo enxertia após transplante em ratos NSG myeloablated modelos4. Além disso, este protocolo é altamente reprodutível e permite a rápida e eficiente de isolamento de CD34 viável+ células de UCBs, que é fundamental para a industrialização deste procedimento.
O VPA ex vivo protocolo de expansão também tem potencial para superar a perda significativa de linfócitos, que ocorre durante o gene edição11. Gene edição exige exposição a citocinas, que são necessárias para ciclismo células e ativação dos mecanismos de reparação do DNA. Devido aos efeitos de alerta do tratamento de VPA, esse método pode ser benéfico para a geração de um número maior de células geneticamente modificadas dentro de um período de tempo que é relevante para atualmente utilizados protocolos de modificação genética.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

Unidades de sangue (UCB) do cordão umbilical fornecem uma fonte alternativa de células-tronco hematopoiéticas humanas (linfócitos) para pacientes que necessitam de transplante de medula óssea alogênico. Enquanto UCB tem várias vantagens exclusivas, o número limitado de linfócitos dentro de cada unidade da UCB limita seu uso na medicina regenerativa e HSC transplante em adultos. Expansão eficiente de linfócitos humanos funcionais pode ser alcançado por ex vivo cultivo de CD34+ células isoladas de UCBs e tratados com um inibidor da deacetilase, ácido valproico (VPA). O protocolo detalhado aqui descreve as condições de cultura e metodologia para isolar rapidamente CD34+ células e expandir para um alto grau, uma piscina de linfócitos primitivos. Os linfócitos expandidos são capazes de estabelecer a enxertia de curto e longo prazo e são capazes de dar origem a todos os tipos de células hematopoiéticas diferenciadas. Esse método também possui potencial para aplicação clínica em terapia de gene autóloga HSC e fornece uma abordagem atraente para superar a perda de linfócitos funcionais associados com a edição de gene.

O ex vivo protocolo descrito aqui aumenta o número de linfócitos primitivos gerados a partir de CD34+ células isoladas de UCBs (Figura 1). Escorva de CD34+ células para 16 h com uma citocina coquetel, seguido de um tratamento com VPA para um adicional 7 dias, leva a um grande grau de expansão do HSC. Notavelmente, o pool de células expandidas é altamente enriquecido para linfócitos, que são fenotipicamente definidos por CD34<sup...

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Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Aqui, descrevemos o ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do CD34+ células derivadas do sangue do cordão umbilical, tratados com uma combinação de um cocktail de citocinas e VPA. Esse método leva a um grau significativo de ex vivo expansão dos linfócitos primitivos para qualquer clínica ou aplicações de laboratório.

Ex Vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do cordão humano hemoderivados CD34+ células usando o ácido valproico

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

A expansão ex vivo de células-tronco hematopoiéticas da unidade sanguínea do cordão umbilical tem grande promessa para a aplicação do HSC em medicina regenerativa e terapia de transplante. Este protocolo usa um coquetel de citocina combinado com o tratamento de ácido valpróico para expandir rapidamente um grande número de HSCs funcionais com características que se assemelham aos HSCs primitivos primários. Devido aos efeitos imediatos do tratamento do ácido valpróico, este método também tem o potencial de superar a perda de HSCs associados à edição de genes.Este método pode ser benéfico para a geração de um maior número de células geneticamente modificadas dentro de um período de tempo que é relevante para protocolos de modificação genética atualmente usados. O protocolo de expansão do ácido valpróico ex vivo é relativamente simples e confiável. A purificação de células CD34 positivas com o dispositivo separador de células é altamente reprodutível e rápida, permitindo a recuperação rápida de células CD34 positivas altamente purificadas.24 horas antes do isolamento das células positivas do CD-34 do sangue do cordão umbilical, prepare o tampão de separação adicionando dois mililitros de 0,5 molar EDTA e 33 mililitros de 7,5% BSA a 465 mililitros de 1X PBS. Misture o tampão suavemente e mantenha-o durante a noite a quatro graus Celsius. No dia da purificação, aqueça a mídia à temperatura ambiente.Distribua toda a unidade de sangue do cordão umbilical em um frasco de 75 centímetros quadrados. Diluir o sangue com um volume igual de PBS à temperatura ambiente e misturar suavemente. Em seguida, determine o número de tubos necessários para o processamento de toda a unidade sanguínea do cordão umbilical.Adicione 15 mililitros de mídia gradiente de densidade a cada tubo. Dispense o sangue diluído muito lentamente em cima do gradiente de densidade enquanto segura o tubo em um ângulo de 45 graus para criar duas camadas. Centrifugar o tubo a 400 g por 30 minutos com baixa aceleração e taxa de desaceleração.Após a centrifugação, as células mononucleares estarão localizadas na camada branca entre as camadas de mídia de plasma e gradiente de densidade. Transfira cuidadosamente a camada do casaco buffy para um novo tubo de 50 mililitros. Colete todas as células mononucleares da mesma unidade sanguínea do cordão umbilical em um tubo de 50 mililitros até atingir 25 mililitros.Adicione 25 mililitros de PBS frio ao tubo contendo 25 mililitros de células mononucleares e misture bem. Centrífuga a 400 g e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Aspire cuidadosamente o supernasce e resuspense a pelota de célula em 50 mililitros de PBS frio.Depois disso, remova 20 microliters da suspensão celular para contagem. Use um contador automático de células para contar o número de células manchadas com laranja acridina ou iodeto de propídio e calcular o número total de células mononucleares. Em seguida, centrifugar as células a 400 g e a quatro graus Celsius por 15 minutos.Primeiro, misture 300 microliters de tampão de separação com 100 microliters de IgG humano FCR humano e 100 microliters de contas magnéticas CD34 para isolar as células CD34 positivas de 10 milhões de células mononucleares. Em seguida, remova cuidadosamente o supernacido de um tubo de células mononucleares previamente centrifadas. Resuspend a pelota na solução de contas magnéticas usando 500 microliters por 10 milhões de células.Misture suavemente e incubar a quatro graus Celsius por 30 minutos. Durante a incubação, prepare o dispositivo separador de células substituindo a solução de armazenamento pelo buffer de trabalho e executando um programa de lavagem seguido de um programa de lavagem. Em seguida, adicione o separador de células frias que corre tampão ao tubo que contém a mistura celular até que o tubo esteja completamente preenchido.Centrifugar o tubo a 400 g e a 4 graus Celsius por 15 minutos. Aspire o supernasciente e resuspenda a pelota celular em tampão separador frio usando dois mililitros por 10 milhões de células. Transfira a mistura de suspensão celular de dois mililitros em tubos de 15 mililitros.Carregue três conjuntos dos tubos no rack separador de células, que foi pré-refrigerado a quatro graus Celsius. Um conjunto de tubos contém MMCs, o segundo conjunto de tubos será usado para coletar a fração negativa, e um terceiro conjunto de tubos será usado para coletar células CD34 positivas purificadas. Carregue o rack no dispositivo separador de células e execute o programa predefinido.Depois disso, centrifufique os tubos contendo a fração positiva a 400 g a e quatro graus Celsius por 15 minutos. Aspire o supernasce e resuspenda as células purificadas CD34-positivos em um mililitro de mídia livre de soro. Em seguida, use um contador de células automatizado para contar as células manchadas com laranja acrídina ou iodeto de propídio.Primeiro, prepare um volume suficiente de mídia para emplacar as células CD34 positivas purificadas a uma densidade de 33.000 células por mililitro. Aplaque as células CD34 positivas purificadas em uma placa de 12 poços a uma densidade celular de 50.000 células em 1,5 mililitros de mídia por poço. Incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono de 5% por 16 horas.Adicione ácido valpróico às culturas de tal forma que a concentração final seja de um mililitro. Continue aculturar as células nas mesmas condições por mais sete dias. Neste protocolo ex vivo, aumenta-se o número de células-tronco hematopoiéticas primitivas geradas a partir de células CD34 positivas isoladas do sangue do cordão umbilical.O número total de células nucleadas é significativamente maior em culturas tratadas apenas com o coquetel de citocinas. Apesar do maior número de células nucleadas totais, o número de células-tronco hematopoiéticas nas culturas que recebem o coquetel de citocinas permanece baixo durante todo o período de expansão, em comparação com culturas tratadas com coquetel de citocina e ácido valpróico. O maior número de células-tronco hematopoiéticas é gerado em culturas tratadas com uma combinação do coquetel de citocinas e ácido valpróico.Em particular, a maior expansão é alcançada após cinco a sete dias após o tratamento com ácido valpróico. Esse aumento do número de células-tronco hematopoiéticas se correlaciona com um aumento imediato no percentual de células-tronco hematopoiéticas, o que é notável dentro de 24 horas após o tratamento com ácido valpróico. Embora o aumento do percentual seja mantido durante os primeiros quatro dias de cultura ex vivo, ele diminui progressivamente após cinco a sete dias de tratamento.No entanto, essa diminuição está inversamente correlacionada com um aumento no número absoluto de células-tronco hematopoiéticas. O rápido aumento no percentual de células-tronco hematopoiéticas em culturas tratadas com ácido valpróico deve-se à aquisição do fenótipo CD90. As células CD34 positivas que expressam o marcador fenotípico CD90 atingem quase 40 a 50% das células expandidas em culturas ex vivo tratadas com o coquetel de citocina e ácido valpróico por quatro dias.A aquisição do fenótipo CD90 é então confirmada pela expansão ex vivo das células CD34-positivas altamente purificadas que carecem de expressão do marcador CD90. Dentro de 24 horas após o tratamento com ácido valpróico, quase 75% das células ex vivo expandidas expressam CD90. Este fenótipo é altamente retido durante os primeiros quatro dias nessas culturas.O sangue do cordão diluído deve ser dispensado muito lentamente em cima do gradiente de densidade enquanto segura o tubo em um ângulo de 45 graus para criar duas camadas distintas. Após este procedimento de expansão ex vivo, as células expandidas podem ser injetadas nos camundongos NSG imunes mieloblados para testar sua funcionalidade e potencial de enenxerção. As células expandidas podem ser usadas para testar uma variedade de perguntas sobre a biologia do HSC humano e do rato e o papel de diferentes genes ou jogador crítico na integridade funcional dos HSCs.A funcionalidade do Ex vivo expandido HSC da unidade sanguínea do cordão umbilical humano, utilizando essa técnica, será testada em breve em um ensaio clínico em paciente com malignidades hematológicas que necessitam de transplante alergênico de medula óssea. Essa técnica também nos permitiu investigar o mecanismo subjacente à expansão ex vivo com o tratamento VPA e obter insights sobre a biologia dos HSCs primitivos.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

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Medicina

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Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para a Avaliação de Medicamentos Response na Fibrose Cística Os pacientes

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...