Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Эта работа была поддержана NYSTEM предоставить C030136 о.в. Мы хотели бы поблагодарить за его обратной связи и Редакция рукописи Bartek Яблонски

HSC ex vivo расширения протокола соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований на Маунт Синай школы медицины.
1. буфер и подготовка СМИ
<ol><li>Подготовить разделения буфера за 24 часа до изоляции CD34+ клеток от UBCs, добавив 2 мл 0,5 М этилена диамин тетра у?...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide,+a+SIRT1+inhibitor,+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment.">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), (2012).</li><li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Expansion+of+HSCs:+New+Possibilities+for+HSC+Transplants?.">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li><li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

Здесь мы представляем протокол к быстро расширяться в значительной степени количество функциональных человека СКК от UCBs. Пилот и кинетические исследования, используя этот протокол показывают, что ex vivo расширенной клетки быстро приобретать и сохранять выражение несколько HSC фенотипич...

Ex vivo расширение гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови (СКК) единиц (УКБ) открывает большие перспективы для HSC приложений в регенеративной медицины и терапии трансплантация. Пересадка с UCB единиц имеет некоторые уникальные преимущества, такие как простой коллекции, высокой доступности, минимальный риск инфекции, низкий риск рецидива заболевания и низкой частоты трансплантат против болезни хост (GVHD). Однако основные недостатки их использования в клинических условиях являются ограниченное количество СКК в рамках каждой UCB блока1. Недостаточное количество результатов СКК в задержки приживления и кроветворная восстановления, риск трансплантата и аномальные иммунного восстановления.
В настоящее время различные методы и стратегии были разработаны для ex vivo развернуть ограниченное количество СКК от UCBs. Комбинации различных цитокинов коктейлей с малых молекул или соединений в ex vivo культур результат в различной степени расширения в HSC чисел2,3,4,5,6, 7,8. Главное ex vivo культуры условия вызывают стресс, приводит к быстрому пролиферации, повышенной метаболической активности и потери примитивных характеристик, определяющих первичный СКК. Таким образом необходимы развивающиеся протоколы, которые приводят к расширению большое количество функциональных СКК с характеристиками, которые напоминают первичной примитивных СКК.
Сыворотка свободной культуры CD34+ клетки изолированы от UCBs и относились с вальпроевая кислота (VPA) результат в расширении большого числа примитивных СКК4,9,10. HSC расширение обусловлено не только распространение существующих СКК, производный от UCBs. Вместо этого это расширение связано приобретение примитивных фенотип, в сочетании с ограниченным количество клеточных делений и распространения9. В течение первоначального 24-48 ч инкубации с сочетанием цитокинов и VPA, CD34+ клетки приобретают транскриптомики и фенотипические профиля, которые характеризуют долгосрочное СКК. Значительное увеличение доли СКК сопровождается быстрое увеличение числа СКК (63 раз увеличение в течение 24 ч лечения VPA)9. В частности стратегия расширения VPA-ex vivo расширяет СКК с низкой метаболической активности, который далее подчеркивается их примитивным характеристики.
Метод, описанный здесь обеспечивает условия и процедуры, которые приводят к в значительной степени ex vivo расширения примитивных СКК либо клинических или лабораторных приложений. Это ex vivo стратегия расширения использует цитокина коктейль, в сочетании с лечением VPA. VPA-FDA утвержденных препарат для лечения биполярных расстройств и других неврологических заболеваний. HSC расширение с VPA оперативного и происходит в течение 7 дней, свести к минимуму риск загрязнения и время манипуляции. Важно отметить, что этот протокол позволяет для приобретения долгосрочных HSC фенотипические маркеры например CD90 и CD49f в течение 24-48 ч после лечения с VPA9. Расширенный HSC графтов, созданные с настоящим Протоколом обладают способностью регенерировать кроветворной системы, поскольку они могут дифференцироваться в всех линий гемопоэтических клеток и создать долгосрочные приживления после трансплантации в myeloablated ГЯП мышей модели4. Кроме того, этот протокол является весьма воспроизводимость и позволяет для эффективной и быстрой изоляции жизнеспособных CD34+ клеток от UCBs, который имеет решающее значение для индустриализации этой процедуры.
VPA ex vivo расширения протокола также имеет потенциал, чтобы преодолеть значительные потери СКК, которая происходит во время редактирования11ген. Джин редактирования требует воздействия цитокины, которые необходимы для велосипедного клеток и активации ДНК ремонт механизмов. Вследствие быстрого воздействия VPA лечения этот метод может быть полезным для поколения большее количество генетически модифицированных клеток в течение определенного периода времени, которое имеет отношение к в настоящее время используются протоколы изменения гена.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

Пуповинной крови (УКБ) единиц предоставляют альтернативный источник гемопоэтических стволовых клеток человека (СКК) для пациентов, которым требуется трансплантация аллогенных костного мозга. В то время как UCB имеет ряд уникальных преимуществ, ограниченное количество СКК в рамках каждого подразделения UCB ограничивает их использование в регенеративной медицине и трансплантации ГСК в взрослых. Эффективное расширение функциональных человека СКК может быть достигнуто путем ex vivo культивирование CD34+ клетки изолированы от UCBs и обработанных с ингибиторов деацетилаз, вальпроевая кислота (VPA). Протокол, здесь подробно описывает условия культуре и методологии быстро изолировать CD34+ клеток и расширить в высокой степени пул примитивных СКК. Расширенный СКК способны установления краткосрочных и долгосрочных приживления и способны вызвать все виды дифференцированных гемопоэтических клеток. Этот метод также имеет потенциал для клинического применения аутологичных HSC генной терапии и обеспечивает привлекательный подход к преодолеть потерю функциональных СКК, связанный с геном редактирования.

Ex vivo протокол описанный здесь увеличивает количество примитивных СКК, образующиеся CD34+ клетки изолированы от UCBs (рис. 1). Грунтование CD34+ клетки для 16 h с цитокина коктейль, следуют обращения с VPA еще 7 дней, ведет в большой степени HSC экспансии. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Здесь мы описываем ex vivo расширение гемопоэтических стволовых клеток из CD34+ клетки, полученные из пуповинной крови, рассматривают с комбинацией цитокина коктейль и VPA. Этот метод приводит к в значительной степени ex vivo расширения примитивных СКК либо клинических или лабораторных приложений.

Ex Vivo расширение гемопоэтических стволовых клеток из человеческой пуповинной крови производные CD34+ клеток с помощью вальпроевая кислота

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Ex vivo расширение гематопоэтической стволовой клетки из пуповинной крови имеют большие перспективы для применения HSC в регенеративной медицине и трансплантационной терапии. Этот протокол использовать цитокин коктейль в сочетании с вальпроевой кислоты лечения быстро расширить большое количество функциональных HSCs с характеристиками, которые очень напоминают первичные примитивные HSCs. Из-за быстрого воздействия вальпроевой кислоты лечения, этот метод также имеет потенциал для преодоления потери HSCs, связанных с редактированием генов.Этот метод может быть полезен для генерации большего числа генетически модифицированных клеток в течение периода времени, который имеет отношение к используемым в настоящее время протоколам модификации генов. Протокол расширения вальпроевой кислоты ex vivo относительно прост и надежен. Очистка CD34-положительных клеток с устройством сепаратора клеток очень воспроизводима и быстра, что позволяет быстро восстановления высокоочищенные CD34-положительные клетки.За 24 часа до изоляции положительных клеток CD-34 от пуповинной крови подготовья подготовьй буфер разделения, добавив два миллилитров 0,5 моларной ЭДТА и 33 миллилитров 7,5%BSA до 465 миллилитров 1X PBS. Смешайте буфер осторожно и поддерживать его на ночь при четырех градусах по Цельсию. В день очищения прогреть средства массовой информации до комнатной температуры.Разбей всю пуповинной крови в колбу площадью 75 квадратных сантиметров. Разбавить кровь с равным объемом PBS при комнатной температуре и аккуратно перемешать. Затем определите количество трубок, необходимых для обработки всего пуповинной крови.Добавьте 15 миллилитров градиентных средств плотности к каждой трубке. Распределяйте разбавленную кровь очень медленно поверх градиента плотности, удерживая трубку под углом 45 градусов, чтобы создать два слоя. Центрифуга трубки на 400 г в течение 30 минут с низким ускорением и замедлением скорости.После центрифугации моноядерные клетки будут расположены в белом слое между слоями плазмы и градиента плотности. Тщательно перенесите слой баффи пальто в новую, 50-миллилитровую трубку. Соберите все моноядерные клетки из одного и того же пуповинной крови в 50-миллилитровую трубку до достижения 25 миллилитров.Добавьте 25 миллилитров холодного PBS в трубку, содержащую 25 миллилитров моноядерных клеток, и хорошо перемешайте. Центрифуга при 400 г и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Тщательно аспирировать супернатант и повторно помыть клеточные гранулы в 50 миллилитров холодного PBS.После этого удалите 20 микролитров клеточной подвески для подсчета. Используйте автоматизированный счетчик клеток, чтобы подсчитать количество клеток, окрашенных либо акридин оранжевый или иодид пропидия и рассчитать общее количество моноядерных клеток. Затем центрифуга клетки на 400 г и при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.Во-первых, смешайте 300 микролитров буфера разделения с 100 микролитров человека FCR человека IgG и 100 микролитров магнитных бусин CD34, чтобы изолировать CD34-положительные клетки от 10 миллионов моноядерных клеток. Затем осторожно удалите супернатант из трубки ранее центрифугированных моноядерных клеток. Повторное использование гранул в растворе магнитного шарика с использованием 500 микролитров на 10 миллионов клеток.Смешайте осторожно и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут. Во время инкубации подготовьте устройство сепаратора ячейки, заменив решение для хранения рабочим буфером и запуская программу стирки с последующим программой полоскания. Затем добавьте сепаратор холодных клеток, работающий буфер, в трубку, которая содержит клеточную смесь, пока трубка не будет полностью заполнена.Центрифуга трубки при 400 г и при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут. Аспирировать супернатант и повторно использовать клеточные гранулы в холодном сепараторе работает буфер с использованием двух миллилитров на 10 миллионов клеток. Перенесите смесь двухми миллилитровой клеточной суспензии в 15-миллилитровые трубки.Загрузите три комплекта трубок в стойку сепаратора клеток, которая была предварительно охлажденной до четырех градусов по Цельсию. Один набор трубок содержит MMCs, второй набор труб будет использоваться для сбора отрицательной фракции, а третий набор труб будет использоваться для сбора очищенных CD34-положительных клеток. Загрузите стойку в устройство сепаратора ячейки и запустите заданную программу.После этого центрифуга трубок, содержащих положительную фракцию при 400 г при и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Аспирировать супернатант и повторно очистить очищенные CD34-положительные клетки в одном миллилитр сыворотки свободных средств массовой информации. Затем используйте автоматизированный счетчик клеток, чтобы подсчитать клетки, окрашенные акридин оранжевым или йодидом пропидия.Во-первых, подготовить достаточный объем средств массовой информации для пластины очищенных CD34-положительных клеток при плотности 33 000 клеток на миллилитр. Плита очищенных CD34-положительных клеток в 12-хорошо пластины при плотности клеток 50000 клеток в 1,5 миллилитров средств массовой информации на колодец. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в 5%углеродного диоксида увлажненной инкубатор в течение 16 часов.Добавьте вальпроевую кислоту в культуры таким образом, чтобы окончательная концентрация была одной миллимоляной. Продолжить культивирование клеток в тех же условиях в течение еще семи дней. В этом протоколе ex vivo увеличивается количество примитивных гематопоэтических стволовых клеток, генерируемых из CD34-положительных клеток, изолированных от пуповинной крови.Общее количество нуклеированных клеток значительно выше в культурах, обработанных только цитокиновым коктейлем. Несмотря на большее количество ядерных клеток, количество гематопоэтических стволовых клеток в культурах, получающих только цитокиновый коктейль, остается низким в течение всего периода расширения, по сравнению с культурами, обработанными цитокиновым коктейлем и вальпроевой кислотой. Наибольшее количество гематопоэтических стволовых клеток генерируется в культурах, обработанных сочетанием цитокинового коктейля и вальпроевой кислоты.В частности, наибольшее расширение достигнуто через пять-семь дней после лечения вальпроевой кислотой. Это увеличение числа гематопоэтических стволовых клеток коррелирует с быстрым увеличением доли гематопоэтических стволовых клеток, что примечательно в течение 24 часов после лечения вальпроевой кислотой. Хотя увеличение процента сохраняется в течение первых четырех дней культуры ex vivo, оно постепенно снижается после пяти-семи дней лечения.Однако это снижение обратно коррелирует с увеличением абсолютного количества гематопоэтических стволовых клеток. Быстрое увеличение доли гематопоэтических стволовых клеток в вальпроико-кислотно-обработанных культурах связано с приобретением фенотипа CD90. CD34-положительные клетки, выражаюющие фенотипический маркер CD90, достигают почти 40-50% клеток, расширенных в культурах ex vivo, обработанных цитокиновым коктейлем и вальпроевой кислотой в течение четырех дней.Приобретение фенотипа CD90 подтверждается расширением ex vivo высокоочищенные CD34-позитивные клетки, которые не имеют выражения маркера CD90. В течение 24 часов после лечения вальпроевой кислотой, почти 75% ex vivo расширенные клетки выражают CD90. Этот фенотип высоко сохраняется в течение первых четырех дней в этих культурах.Разбавленная пуповинной крови следует распределять очень медленно на верхней части градиента плотности, удерживая трубку под углом 45 градусов, чтобы создать два различных слоя. После этой процедуры расширения ex vivo, расширенные клетки могут быть введены в миелоаблированных иммунодефицитных мышей NSG, чтобы проверить их функциональность и потенциал engraftment. Расширенные клетки могут быть использованы для проверки различных вопросов, касающихся биологии как человека, так и мыши HSC и роль различных генов или критического игрока на функциональную целостность HSCs.Функциональность ex vivo расширена HSC из пуповинной крови человека, используя эту технику, в скором времени будет протестирована в клинических испытаниях у пациента с гематологическими злокачественными новообразованиями, которые требуют алогенной трансплантации костного мозга. Этот метод также позволил нам исследовать механизм, лежащий в основе расширения ex vivo с лечением VPA и получить представление о биологии примитивных HSCs.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Формирование человеческого эпителия простаты с использованием тканевых Рекомбинация грызунов мочеполовой Мезенхима Синус и стволовых клеток человека

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Последовательный<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация остеогенные стволовых / клеток-предшественников во время разрушения Ремонт

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Выделение стволовых клеток рака из образцов предстательной железы человека

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Обогащение химиорезистентных рака яичников стволовых клеток из человеческих клеточных линиях

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Изучение рака поджелудочной железы стволовых клеток Характеристики для разработки новых стратегий лечения

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Генерация Microtumors Использование 3D человека биогель системы культуры и терпеливый происхождения клеток глиобластомы для Kinomic профилирование и тестирования реагирования на наркотики

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Генерация гуманизированное печени мышей с помощью печени человека стволовые клетки

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Истощение мышиных клеток из ксенотрансплантатов опухолей человека значительно улучшает Downstream Анализ клеток-мишеней

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Форсколин-индуцированной Отек в кишечном органоидов:<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ для оценки ответа на наркотики в больных муковисцидозом

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...