Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
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Este trabajo fue apoyado por NYSTEM conceder C030136 a der. Nos gustaría dar las gracias Bartek Jablonski para su retroalimentación y revisión del manuscrito

El HSC ex vivo protocolo de expansión sigue las pautas del Comité de ética de investigación en el Mount Sinai School of Medicine.
1. tampón y preparación de los medios de comunicación
<ol><li>Preparar el tampón de separación 24 h antes de la aislamiento de CD34+ células de UBCs añadir 2 mL de ácido 0,5 M etileno diamina Tetra-acético (EDTA) y 33 mL de 7,5% albúmina de suero bovino (BSA) con solución salina 465 mL tamponada (1 x PBS). Mezclar suavemente y mantener el...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide,+a+SIRT1+inhibitor,+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment.">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), (2012).</li><li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Expansion+of+HSCs:+New+Possibilities+for+HSC+Transplants?.">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li><li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

Adjunto, presentamos un protocolo para ampliar rápidamente a un grado significativo el número de HSCs humanos funcionales de UCBs. Los estudios piloto y cinéticos utilizando este protocolo indican que el ex vivo ampliado las células rápidamente adquirir y conservar la expresión de varios marcadores fenotípicos de HSC como CD90 primitivo HSC características metabólicas9.
Ex vivo protocolo de expansión es relativamente simple y confiable. Purificación de CD34 c...

Ex vivo expansión de células madre hematopoyéticas (HSCs) de sangre de cordón umbilical unidades (UCB) es muy prometedor para aplicaciones de HSC en medicina regenerativa y terapia de trasplante. Trasplante con unidades de la UCB tiene varias ventajas únicas como colección easy, alta disponibilidad, mínimo riesgo de infección, bajo riesgo de recaída de la enfermedad y la baja frecuencia de injerto contra enfermedad del anfitrión (GVHD). Sin embargo, las principales desventajas de su uso en contextos clínicos son el limitado número de HSCs presentes dentro de cada unidad UCB1. El número insuficiente de HSCs resultados en retardada injerto y recuperación hematopoyética, riesgo de rechazo al injerto y reconstitución inmune aberrante.
En la actualidad, ha desarrollado diversos métodos y estrategias ex vivo ampliar el limitado número de HSCs de UCBs. Combinaciones de citoquinas diferentes cócteles con pequeñas moléculas o compuestos en ex vivo culturas dan como resultado diferentes grados de expansión en HSC números2,3,4,5,6, 7,8. Lo importante es ex vivo cultura condiciones inducen estrés, llevando a la proliferación celular rápida, aumento de la actividad metabólico y pérdida de las características primitivas que definen HSCs primarias. Por lo tanto, están necesario desarrollar protocolos que conducen a la expansión de un gran número de HSCs funcionales con características que asemejan HSCs primitivo primarias.
Cultivos libres de suero de CD34+ las células aisladas de UCBs y tratamiento con valproico ácido (VPA) dan como resultado la expansión de un gran número de primitivos HSCs4,9,10. La expansión de HSC no es únicamente debido a la proliferación de las HSCs existentes derivados de UCBs. En cambio, esta expansión es debido a la adquisición de un fenotipo primitivo combinado con un número limitado de divisiones celulares y proliferación9. Dentro de la inicial 24-48 h de incubación con una combinación de citocinas y VPA, CD34+ células adquieren un perfil fenotípico que caracterizan a las HSCs a largo plazo y transcriptómicos. El aumento significativo en el porcentaje de HSCs es acompañado por un aumento rápido del número de HSCs (63 veces aumento dentro de las 24 h de tratamiento de VPA)9. En particular, la estrategia de expansión de VPA-ex vivo expande HSCs con baja actividad metabólica, que resalta aún más sus características primitivas.
El método aquí descrito ofrece condiciones y tratamientos que conducen a un grado significativo de ex vivo expansión de HSCs primitivo ya sea clínica o aplicaciones de laboratorio. Este ex vivo estrategia de expansión utiliza un cóctel de cytokine combinado con el tratamiento de VPA. VPA es un fármaco aprobado por la FDA para el tratamiento de trastornos bipolares y otras enfermedades neurológicas. La expansión de HSC con VPA es rápida y ocurre dentro de 7 días, minimizando el tiempo de manipulación y el riesgo de contaminación. Lo importante, este protocolo permite la adquisición de los marcadores fenotípicos a largo plazo de HSC como CD90 y CD49f dentro de las 24-48 h después del tratamiento con VPA9. Injertos HSC ampliados con este protocolo tienen la capacidad de regenerar el sistema hematopoyético, puesto que pueden diferenciarse en todos los linajes de células hematopoyéticas y establecer a largo plazo injerto tras trasplante en los ratones del grupo de myeloablated modelos4. Por otra parte, este protocolo es altamente reproducible y permite un aislamiento eficiente y rápido de CD34 viable+ células de UCBs, que es fundamental para la industrialización de este procedimiento.
La APV ex vivo protocolo de expansión también tiene el potencial para superar la pérdida significativa de HSCs que ocurre durante la edición11del gene. Gen de edición requiere exposición a citoquinas, que son necesarios para ciclismo las células y la activación de mecanismos de reparación del ADN. Debido a la rápida de tratamiento de VPA, este método podría ser beneficioso para la generación de un mayor número de células genéticamente modificadas en un período de tiempo que es relevante para la actualidad utiliza protocolos de modificación génica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

Unidades de cordón umbilical sangre (UCB) proporcionan una fuente alternativa de humanos las células madre hematopoyéticas (HSCs) para pacientes que requieren trasplante de médula ósea alogénica. Mientras que la UCB tiene varias ventajas únicas, un número limitado de HSCs dentro de cada unidad UCB limita su uso en medicina regenerativa y el trasplante de HSC en adultos. Expansión eficiente de HSCs humanas funcionales puede lograrse ex vivo cultivo de CD34+ de las células aisladas de UCBs y tratados con un inhibidor de la deacetilasa, ácido valproico (VPA). El protocolo detallado aquí describe la metodología para aislar rápidamente a CD34 y condiciones de cultivo+ células y ampliar a un alto grado un grupo de primitivos HSCs. Las HSCs ampliadas son capaces de establecer engraftment tanto a corto como a largo plazo y son capaces de dar lugar a todos los tipos de células hematopoyéticas diferenciadas. Este método también tiene potencial para el uso clínico en terapia del gene de autólogo HSC y ofrece un enfoque atractivo para superar la pérdida de HSCs funcionales asociados con la edición de genes.

El ex vivo protocolo descrito aquí aumenta el número de primitivas HSCs generados a partir de CD34+ células aisladas de UCBs (figura 1). Cebado de CD34+ células por 16 h con una citoquina coctel, seguida por el tratamiento con VPA para otros 7 días, conduce a un gran grado de expansión de HSC. Notablemente, el conjunto de células mayores es altamente enriquecido de HSCs, que fenotípicamente son definidas por CD34+CD90<...

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Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Aquí, describimos la ex vivo expansión de células madre hematopoyéticas de CD34+ en células de sangre de cordón umbilical trataron con una combinación de un cytokine cóctel y VPA. Este método conduce a un grado significativo de ex vivo expansión de HSCs primitivo ya sea clínica o aplicaciones de laboratorio.

Ex Vivo expansión de células madre hematopoyéticas de cordón Umbilical humano derivadas de sangre CD34+ las células usando el ácido valproico

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

La expansión ex vivo de células madre hematopoyéticas de la unidad de sangre del cordón umbilical es muy prometedora para la aplicación de HSC en la medicina regenerativa y la terapia de trasplante. Este protocolo utiliza un cóctel de citoquinas combinado con el tratamiento con ácido valproico para expandir rápidamente un gran número de HSC funcionales con características que se asemejan mucho a los HSC primitivos primarios.Este método podría ser beneficioso para la generación de un mayor número de células modificadas genéticamente dentro de un período de tiempo que es relevante para los protocolos de modificación genética utilizados actualmente. El protocolo de expansión ex vivo de ácido valproico es relativamente simple y fiable. La purificación de células CD34 positivas con el dispositivo separador celular es altamente reproducible y rápida, lo que permite una rápida recuperación de células CD34 positivas altamente purificadas.24 horas antes del aislamiento de células positivas CD-34 de sangre del cordón umbilical, preparar el tampón de separación añadiendo dos mililitros de 0,5 MOLar EDTA y 33 mililitros de 7,5%BSA a 465 mililitros de 1X PBS. Mezcle el tampón suavemente y mantenlo durante la noche a cuatro grados centígrados. El día de la purificación, calentar los medios a temperatura ambiente.Dispensar toda la unidad de sangre del cordón umbilical en un matraz de 75 centímetros cuadrados. Diluir la sangre con un volumen igual de PBS a temperatura ambiente y mezclar suavemente. A continuación, determine el número de tubos necesarios para procesar toda la unidad de sangre del cordón umbilical.Agregue 15 mililitros de medios de gradiente de densidad a cada tubo. Dispensar la sangre diluida muy lentamente en la parte superior del gradiente de densidad mientras sostiene el tubo en un ángulo de 45 grados para crear dos capas. Centrifugar el tubo a 400 g durante 30 minutos con una baja velocidad de aceleración y desaceleración.Después de la centrifugación, las células mononucleares se ubicarán en la capa blanca entre el plasma y las capas de medios de gradiente de densidad. Transfiera cuidadosamente la capa de capa buffy a un nuevo tubo de 50 mililitros. Recoger todas las células mononucleares de la misma unidad de sangre del cordón umbilical en un tubo de 50 mililitros hasta llegar a 25 mililitros.Añadir 25 mililitros de PBS frío al tubo que contiene 25 mililitros de células mononucleares y mezclar bien. Centrifugar a 400 g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 50 mililitros de PBS frío.Después de esto, retire 20 microlitros de la suspensión celular para el recuento. Utilice un contador de celdas automatizado para contar el número de células manchadas con yoduro de acridina naranja o propidium y calcule el número total de células mononucleares. Luego, centrifuga las células a 400 g y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos.En primer lugar, mezcle 300 microlitros de búfer de separación con 100 microlitros de IgG humano FCR y 100 microlitros de cuentas magnéticas CD34 para aislar las células CD34 positivas de 10 millones de células mononucleares. A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante de un tubo de células mononucleares previamente centrifugadas. Resuspender el pellet en la solución de perlas magnéticas utilizando 500 microlitros por cada 10 millones de células.Mezclar suavemente e incubar a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Durante la incubación, prepare el dispositivo separador de células reemplazando la solución de almacenamiento por el búfer de trabajo y ejecutando un programa de lavado seguido de un programa de enjuague. A continuación, agregue el búfer de funcionamiento del separador de celda fría al tubo que contiene la mezcla celular hasta que el tubo esté completamente lleno.Centrifugar el tubo a 400 g y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en el búfer de funcionamiento del separador en frío utilizando dos mililitros por cada 10 millones de células. Transfiera la mezcla de suspensión de células de dos mililitros en tubos de 15 mililitros.Cargue tres juegos de los tubos en el bastidor separador de celdas, que se ha enfriado previamente a cuatro grados centígrados. Un conjunto de tubos contiene MMC, el segundo conjunto de tubos se utilizará para recoger la fracción negativa, y un tercer conjunto de tubos se utilizará para recoger células purificadas CD34 positivas. Cargue el bastidor en el dispositivo separador de celdas y ejecute el programa preestablecido.Después de esto, centrifugar los tubos que contienen la fracción positiva a 400 g a y cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células purificadas CD34 positivas en un mililitro de medios libres de suero. Luego, utilice un contador de células automatizado para contar las células manchadas con acridina naranja o yoduro propidium.En primer lugar, prepare un volumen suficiente de medios para placar las células purificadas CD34 positivas a una densidad de 33.000 células por mililitro. Placar las células purificadas CD34-positivas en una placa de 12 pozos a una densidad celular de 50.000 células en 1,5 mililitros de medios por pozo. Incubar a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono del 5% durante 16 horas.Añadir ácido valproico a los cultivos de tal manera que la concentración final sea de un milimolar. Continúe cultivando las células en las mismas condiciones durante siete días adicionales. En este protocolo ex vivo, aumenta el número de células madre hematopoyéticas primitivas generadas a partir de células CD34 positivas aisladas de la sangre del cordón umbilical.El número total de células nucleadas es significativamente mayor en cultivos tratados solo con el cóctel de citoquinas. A pesar del mayor número de células nucleadas totales, el número de células madre hematopoyéticas en los cultivos que reciben el cóctel de citoquinas por sí solo permanece bajo durante todo el período de expansión, en comparación con los cultivos tratados con cóctel de citoquinas y ácido valproico. El mayor número de células madre hematopoyéticas se genera en cultivos tratados con una combinación del cóctel de citoquinas y ácido valproico.En particular, la mayor expansión se alcanza después de cinco a siete días después del tratamiento con ácido valproico. Este aumento del número de células madre hematopoyéticas se correlaciona con un rápido aumento en el porcentaje de células madre hematopoyéticas, que se destaca dentro de las 24 horas del tratamiento con ácido valproico. Mientras que el aumento en el porcentaje se mantiene durante los primeros cuatro días de cultivo ex vivo, disminuye progresivamente después de cinco a siete días de tratamiento.Sin embargo, esta disminución se correlaciona inversamente con un aumento en el número absoluto de células madre hematopoyéticas. El rápido aumento del porcentaje de células madre hematopoyéticas en cultivos tratados con ácido valproico se debe a la adquisición del fenotipo CD90. Las células CD34 positivas que expresan el marcador fenotípico CD90 alcanzan casi 40 a 50% de las células expandidas en cultivos ex vivo tratados con el cóctel de citoquinas y ácido valproico durante cuatro días.La adquisición del fenotipo CD90 se confirma entonces por la expansión ex vivo de las células CD34 positivas altamente purificadas que carecen de expresión del marcador CD90. Dentro de las 24 horas de tratamiento con ácido valproico, casi el 75% de las células expandidas ex vivo expresan CD90. Este fenotipo es altamente retenido durante los primeros cuatro días en estas culturas.La sangre del cordón umbilical diluido se debe dispensar muy lentamente en la parte superior del gradiente de densidad mientras se mantiene el tubo en un ángulo de 45 grados para crear dos capas distintas. Después de este procedimiento de expansión ex vivo, las células expandidas se pueden inyectar en los ratones sin efectos inmunes e inmunes con deficiencia de mieloablados para probar su funcionalidad y potencial de injerto. Las células expandidas se pueden utilizar para probar una variedad de preguntas con respecto a la biología de HSC humano y ratón y el papel de diferentes genes o actor crítico en la integridad funcional de los HSC.La funcionalidad del HSC expandido ex vivo de la unidad de sangre del cordón umbilical humano, utilizando esta técnica, pronto se probará en un ensayo clínico en pacientes con neoplasias malignas hematológicas que requieren trasplante de médula ósea alogénico. Esta técnica también nos ha permitido investigar el mecanismo subyacente a la expansión ex vivo con el tratamiento VPA y obtener información sobre la biología de los HSC primitivos.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

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Investigación

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