Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Detta arbete stöds av NYSTEM bevilja C030136 till R.H. Vi vill tacka Bartek Jablonski för hans feedback och granskning av manuskript

HSC ex vivo expansion protokoll följer riktlinjerna i den forskningsetisk kommitté vid Mount Sinai School of Medicine.
1. buffert och Media förberedelse
<ol><li>Förbereda separation buffert 24 h före isolering av CD34+ celler från UBCs genom att lägga till 2 mL 0,5 M eten Diamine Tetra-ättiksyra (EDTA) och 33 mL 7,5% bovint serumalbumin (BSA) till 465 mL buffrad koksaltlösning (1 x PBS). Blanda försiktigt och underhålla bufferten över natten vid 4 ° C.</li>
	<li>Varm ...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide,+a+SIRT1+inhibitor,+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment.">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), (2012).</li><li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Expansion+of+HSCs:+New+Possibilities+for+HSC+Transplants?.">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li><li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

Häri, presenterar vi ett protokoll för att snabbt utöka till en viktig grad antalet funktionella mänsklig Förenta från UCBs. Pilot och kinetiska studierna använder detta protokoll indikerar att den ex vivo expanderade celler snabbt förvärva och behålla uttrycket av flera HSC fenotypiska markörer inklusive CD90 samt primitiva HSC metabola egenskaper9.
Detta ex vivo expansion protokoll är relativt enkel och tillförlitlig. Rening av CD34+ celler med...

Ex vivo expansion av hematopoetiska stamceller (Förenta) från navelsträngsblod (UCB) enheter innehar stort löfte för HSC applikationer inom regenerativ medicin och transplantation terapi. Transplantation med UCB enheter har flera unika fördelar som enkel samling, hög tillgänglighet, minimal risk för infektion, låg risk för återfall, och låg frekvens av transplantat-kontra-värd-sjuka (GVHD). De största nackdelarna av deras användning i kliniska inställningar är dock det begränsade antalet Förenta inom varje UCB enhet1. Ett otillräckligt antal Förenta resulterar i försenad engraftment och hematopoetisk återhämtning, risken för transplantatavstötning och avvikande immun beredning.
För närvarande har olika metoder och strategier utvecklats för att expandera det begränsade antalet Förenta från UCBs ex vivo. Kombinationer av olika cytokin cocktails med små molekyler eller föreningar i ex vivo kulturer resultera i olika grader av expansion i HSC nummer2,3,4,5,6, 7,8. Ännu viktigare, ex vivo kultur inducera villkor stress, vilket leder till snabb cellproliferation, ökad metabolisk aktivitet och förlust av de primitiva egenskaper som definierar primära Förenta. Därför behövs utveckla protokoll som leder till expansion av ett stort antal funktionella Förenta med egenskaper som liknar primära primitiva Förenta.
Serumfritt kulturer av CD34+ celler isolerade från UCBs och behandlas med valproic syra (VPA) resultat i utbyggnaden av stort antal primitiva Förenta4,9,10. HSC utbyggnaden är inte enbart på grund av spridningen av de befintliga Förenta härrör från UCBs. I stället beror denna expansion på förvärvet av en primitiv fenotyp kombinerat med ett begränsat antal celldelningar och spridning9. Inom de första 24-48 h inkubation med en kombination av cytokiner och VPA, CD34+ celler förvärva en transcriptomic och fenotypiska profil som kännetecknar långsiktiga Förenta. Den betydande ökningen i procentandelen av Förenta åtföljs av en snabb ökning av antalet Förenta (63 faldig ökning inom 24 h VPA behandling)9. Särskilt, expanderar VPA-ex vivo expansionsstrategin Förenta med låg metabolisk aktivitet, som ytterligare belyser deras primitiva kännetecken.
Den metod som beskrivs här ger tillstånd och behandlingar som leder till en betydande grad av ex vivo expansion av primitiva Förenta för antingen kliniska eller laboratorium program. Detta ex vivo expansionsstrategi använder en cytokin cocktail kombinerat med VPA behandling. VPA är en FDA godkända läkemedel för behandling av bipolär sjukdom och andra neurologiska sjukdomar. HSC expansion med VPA är snabb och sker inom 7 dagar, både tidpunkten för manipulation och risken för kontaminering minimeras. Allt möjliggör detta protokoll förvärv av långsiktiga HSC fenotypiska markörer såsom CD90 och CD49f inom 24-48 h efter behandling med VPA9. Utökad HSC ympkvistar skapas med detta protokoll har kapacitet att generera det hematopoetiska systemet eftersom de kan differentieras till alla hematopoetiska celler härstamningar och etablera långsiktiga engraftment efter transplantation i myeloablated NSG möss modeller4. Dessutom detta protokoll är mycket reproducerbara och möjliggör snabb och effektiv isolering av livskraftiga CD34+ celler från UCBs, som är avgörande för industrialisering av detta förfarande.
Frivilligt ex vivo expansion protokoll har också potential att övervinna den betydande förlust av Förenta som uppstår under gen redigering11. Gen redigering kräver exponering för cytokiner, som är nödvändiga för cykling celler och aktivering av DNA-reparationsmekanismer. På grund av de snabba effekterna av VPA behandling, kan denna metod vara fördelaktigt för generering av ett högre antal genetiskt modifierade celler inom en tidsperiod som är relevant för närvarande utnyttjas gen ändring protokoll.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

Navelsträngen blod (UCB) enheter ger en alternativ källa av hematopoetiska stamceller (Förenta) för patienter som kräver allogen benmärgstransplantation. Även om UCB har flera unika fördelar, begränsar begränsade antalet Förenta inom varje UCB enhet deras användning i regenerativ medicin och HSC transplantation hos vuxna. Effektiv utbyggnad av funktionella mänsklig Förenta kan uppnås genom ex vivo odling av CD34+ celler isolerade från UCBs och behandlas med en histondeacetylas hämmare, valproinsyra (VPA). Protokollet beskrivs här beskriver odlingsbetingelser och metod att snabbt isolera CD34+ celler och expandera i hög grad en pool av primitiva Förenta. De utökade Förenta klarar av att upprätta både kortsiktiga och långsiktiga engraftment och kan ge upphov till alla typer av differentierade hematopoetiska celler. Denna metod har potential för klinisk tillämpning i autologa HSC genterapi och ger en attraktiv metod för att övervinna förlusten av funktionella Förenta associerade med gen editering.

De ex vivo protokollet som beskrivs här ökar antalet primitiva Förenta genereras från CD34+ celler isolerade från UCBs (figur 1). Primerbehandling av CD34+ celler för 16 h med ett cytokin cocktail, följt av behandling med VPA för ytterligare 7 dagar, leder till en stor grad av HSC expansion. Anmärkningsvärt, poolen av utökade celler är höganrikat för Förenta, som definieras fenotypiskt av CD34+CD90+ m...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Här beskriver vi ex vivo expansion av hematopoetiska stamceller från CD34+ celler från navelsträngsblod behandlas med en kombination av en cytokin cocktail och VPA. Denna metod leder till en betydande grad av ex vivo expansion av primitiva Förenta för antingen kliniska eller laboratorium program.

Ex Vivo Expansion av hematopoetiska stamceller från mänskliga navelsträngen blod-derived CD34+ celler med valproinsyra

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Ex vivo expansion av hematopoietic stamcell från navelsträngsblod enhet hålla stort löfte för HSC ansökan i regenerativ medicin och transplantation terapi. Detta protokoll använder en cytokin cocktail i kombination med valproic syra behandling för att snabbt utöka ett stort antal funktionella HSCs med egenskaper som liknar primära primitiva HSCs. På grund av de snabba effekterna av valproic syra behandling, denna metod har också potential att övervinna förlusten av HSCs är associerade med genredigering.Denna metod kan vara till nytta för generering av ett större antal genetiskt modifierade celler inom en tidsperiod som är relevant för för närvarande använda genmodifieringsprotokoll. Expansionsprotokollet valproinsyra ex vivo är relativt enkelt och tillförlitligt. Rening av CD34-positiva celler med cellen separator enheten är mycket reproducerbara och snabb, vilket möjliggör snabb återvinning av mycket renat CD34-positiva celler.24 timmar före isoleringen av CD-34 positiva celler från navelsträngsblod, bereda separationsbufferten genom att tillsätta två milliliter på 0,5 molar EDTA och 33 milliliter på 7,5%BSA till 465 milliliter 1X PBS. Blanda bufferten försiktigt och underhålla den över natten vid fyra grader Celsius. På dagen för rening, värma media till rumstemperatur.Fördela hela navelsträngsblodenheten i en 75-kvadratcentimeterskolv. Späd blodet med en lika stor volym PBS i rumstemperatur och blanda försiktigt. Därefter bestämma antalet rör som krävs för bearbetning av hela navelsträngsblodenheten.Lägg till 15 milliliter densitetsgradientmedia till varje rör. Dispensera det utspädda blodet mycket långsamt ovanpå densitetsgradienten medan du håller röret i 45 graders vinkel för att skapa två lager. Centrifugera röret vid 400 g i 30 minuter med låg acceleration och inbromsningshastighet.Efter centrifugeringen kommer de mononukleära cellerna att ligga i det vita lagret mellan plasma- och densitetsgradientmediaskikten. Överför försiktigt buffy coat lagret i en ny, 50-milliliter rör. Samla alla mononukleära celler från samma navelsträngsblod enhet i en 50-milliliter rör tills nå 25 milliliter.Tillsätt 25 milliliter kall PBS till röret som innehåller 25 milliliter mononukleära celler och blanda väl. Centrifugera vid 400 g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Aspirera försiktigt supernatanten och resuspend cellpelleten i 50 milliliter av kallt PBS.Efter detta, ta bort 20 mikroliter av cellen suspension för räkning. Använd en automatiserad cellräknare för att räkna antalet celler som färgats med antingen acridinorange eller propidiumjodid och beräkna det totala antalet mononukleära celler. Sedan centrifugera cellerna vid 400 g och vid fyra grader Celsius i 15 minuter.För det första, blanda 300 mikroliter av separationsbuffert med 100 mikroliter av mänskliga FCR mänskliga IgG och 100 mikroliter av CD34 magnetiska pärlor att isolera CD34-positiva celler från 10 miljoner mononukleära celler. Därefter försiktigt ta bort supernatanten från ett rör av tidigare centrifugerade mononukleära celler. Resuspend pelleten i den magnetiska pärla lösningen med hjälp av 500 mikroliter per 10 miljoner celler.Blanda försiktigt och inkubera i fyra grader Celsius i 30 minuter. Under inkubationen, preparera cellavskiljaren genom att byta ut lagringslösningen mot arbetsbufferten och köra ett tvättprogram följt av ett sköljprogram. Tillsätt sedan kall cellavskiljare som kör buffert till röret som innehåller cellblandningen tills röret är helt fyllt.Centrifugera röret vid 400 g och vid fyra grader Celsius i 15 minuter. Aspirera supernatanten och resuspend cell pelleten i kall separator kör buffert med hjälp av två milliliter per 10 miljoner celler. Överför blandningen av cellupphängning med två milliliter i 15 milliliterrör.Ladda tre uppsättningar av rören i cellavskiljare rack, som har pre-kyld till fyra grader Celsius. En uppsättning rör innehåller MMC, den andra uppsättningen rör kommer att användas för att samla in den negativa fraktionen, och en tredje uppsättning rör kommer att användas för att samla in renade CD34-positiva celler. Ladda rack i cellavgränsaren och kör det förinställda programmet.Efter detta centrifugera rören som innehåller den positiva fraktionen vid 400 g vid och fyra grader Celsius i 15 minuter. Aspirera supernatanten och resuspend de renade CD34-positiva cellerna i en milliliter av serum-fria medier. Använd sedan en automatiserad cellräknare för att räkna cellerna som färgats med acridinorange eller propidiumjodid.Först förbereda en tillräcklig volym av media för att plattan de renade CD34-positiva cellerna vid en densitet av 33, 000 celler per milliliter. Platta de renade CD34-positiva cellerna i en 12-brunnsplatta vid en celltäthet på 50 000 celler i 1,5 milliliter media per brunn. Inkubera vid 37 grader Celsius i en 5%koldioxidfuktad inkubator i 16 timmar.Tillsätt valproinsyra till kulturerna så att den slutliga koncentrationen är en millimolar. Fortsätt att kultföra cellerna på samma villkor i ytterligare sju dagar. I detta ex vivo-protokoll ökas antalet primitiva hematopoitiska stamceller som genereras från CD34-positiva celler som isolerats från navelsträngsblod.Det totala antalet nucleated celler är betydligt högre i kulturer som behandlats med cytokin cocktail ensam. Trots det högre antalet totala kärnceller förblir antalet hematopoietiska stamceller i de kulturer som får cytokincocktailen ensamt lågt under hela expansionsperioden, jämfört med kulturer som behandlats med cytokincocktail och valproic syra. Det största antalet hematopoietiska stamceller genereras i kulturer som behandlas med en kombination av cytokincocktailen och valproicsyran.I synnerhet nås den största expansionen efter fem till sju dagar efter behandling med valproic syra. Detta ökade antal hematopoietiska stamceller korrelerar med en snabb ökning av andelen hematopoitiska stamceller, vilket är anmärkningsvärt inom 24 timmar efter behandling med valproic syra. Medan ökningen av andelen bibehålls under de första fyra dagarna av ex vivo kultur, minskar det successivt efter fem till sju dagars behandling.Denna minskning är dock omvänt korrelerad med en ökning av det absoluta antalet hematopoetiska stamceller. Den snabba ökningen av andelen hematopoietiska stamceller i valproic-acid-behandlade kulturer beror på förvärvet av phenotypen CD90. CD34-positiva celler uttrycker CD90 fenotypiska markören nå nästan 40 till 50%av celler expanderade i ex vivo kulturer behandlas med cytokin cocktail och valproic syra i fyra dagar.Förvärvet av CD90 fenotyp bekräftas sedan av ex vivo expansion av de mycket-renade CD34-positiva celler som saknar uttryck för CD90 markören. Inom 24 timmar efter behandling med valproinsyra, nästan 75%av de ex vivo expanderade cellerna express CD90. Denna fenotyp är mycket behålls under de första fyra dagarna i dessa kulturer.Det utspädda navelsträngsblodet ska dispenseras mycket långsamt ovanpå densitetsgradienten medan du håller röret i 45 graders vinkel för att skapa två distinkta lager. Efter detta ex vivo expansionsförfarande kan de expanderade cellerna injiceras i de myeloalated immun-brist NSG möss för att testa deras funktionalitet och engraftment potential. De expanderade cellerna kan användas för att testa en mängd olika frågor rörande biologin hos både human och mus HSC och olika geners eller kritiska spelares roll på HSCs funktionella integritet.Funktionaliteten hos ex vivo expanderat HSC från mänskliga navelsträngsblod enhet, med hjälp av denna teknik, kommer snart testas i en klinisk prövning i patient med blodsjukdomar Maligniteter som kräver allergiframkallande bone marrow transplantation. Denna teknik har också gjort det möjligt för oss att undersöka mekanismen bakom ex vivo expansionen med VPA behandling och få insikter i biologi primitiva HSCs.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Bildning av Human Prostate Epitel Använda Tissue rekombination av gnagare Urogenital Sinus mesenkym och mänskliga stamceller

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sekventiell<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av Osteogena Stem / progenitorceller Under Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av cancer stamceller från mänskliga Prostate Cancer Prov

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Anrikning för kemoterapiresistent Ovarian cancerstamceller från humana cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generation Microtumors Använda 3D Human Biogel odlingssystemet och patientgenererade glioblastomceller för Kinomic Profilering och läkemedelssvar Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering av en humaniserad muslever Använda Human lever stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininducerad Svullnad i Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analys av Läkemedels svar i patienter med cystisk fibros

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...