Name: ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Bu eser NYSTEM tarafından desteklenen C030136 R.H. için vermek Bartek Jablonski onun geribildirim ve el yazması revizyonu için teşekkür etmek istiyorum

HSC ex vivo genişletme protokolü Mount Sinai Tıp Fakültesi araştırma Etik Kurulu kuralları izler.
1. arabellek ve medyası hazırlama
<ol><li>Ayrılık arabellek CD34 yalıtım önce 24 h hazırlamak+ hücreleri UBCs 2 mL 0.5 M etilen diamin Tetra Asetik asit (EDTA) ve % 7.5 33 mL ekleyerek sığır Serum Albumin (BSA) 465 arabelleğe alınmış mL serum fizyolojik (1 x PBS). Karışımı yavaşça ve arabellek gecede 4 ° C'de korumak</li>
	<li>Sıcak ortam arınma günü ...

<ol>
	<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation.">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D&#39;Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells.">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide,+a+SIRT1+inhibitor,+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment.">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), (2012).</li><li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Expansion+of+HSCs:+New+Possibilities+for+HSC+Transplants?.">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li><li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood:+Clinical+Trials.">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).</li><li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation.">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li><li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , (2019).</li><li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells.">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34(+)+cord+blood+stem+cells.">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li></ol>

Burada, biz hızla önemli bir dereceye UCBs fonksiyonel insan HSCs sayısını artırmak için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralını kullanan pilot ve Kinetik çalışmalar belirtmek ex vivo genişletilmiş hücreleri derhal elde etmek ve CD90 yanı sıra ilkel HSC metabolik özellikleri9dahil olmak üzere birkaç HSC fenotipik işaretleri ifade korumak.
Bu ex vivo genişletme protokolü nispeten basit ve güvenilir olduğunu. CD34 arıtma+ hücreleri...

Ex vivo genişleme hematopoetik kök hücre (HSCs) göbek kordon kanı (UCB) birim tutar HSC uygulamalar için büyük söz rejeneratif tıp ve nakli terapisi. UCB birimleri ile ekimi kolay koleksiyonu, yüksek kullanılabilirlik, en az tehlike-in hastalık, hastalık nüks düşük risk ve düşük frekans Greft versus host hastalığı (GVHD) gibi çeşitli benzersiz avantajları vardır. Ancak, bunların kullanımı klinik ayarları'nda önemli dezavantajları HSCs içinde her UCB birim1mevcut sınırlı sayıda vardır. HSCs sonuçları gecikmeli engraftment ve hematopoetik kurtarma, riski greft reddi ve anormal bağışıklık sulandırma yetersiz sayıda.
Şu anda, çeşitli yöntemler ve stratejiler ex vivo HSCs UCBs gelen sınırlı sayıda genişletmek için geliştirilmiştir. Farklı sitokin kokteyller küçük moleküller veya ex vivo kültürler sonucu genişleme HSC numaraları2,3,4,5,6değişik derecelerde bileşikler ile kombinasyonları, 7,8. Önemlisi, ex vivo kültür koşulları hızlı hücre çoğalması, artmış metabolik aktivite ve birincil HSCs tanımlamak ilkel özellikleri kaybı için önde gelen stres, ikna etmek. Bu nedenle, fonksiyonel HSCs yakından birincil ilkel HSCs benzer özelliklere sahip çok sayıda genişlemesi yol gelişmekte olan iletişim kurallarına gerek.
Serum-Alerjik kültürleri CD34+ hücreleri UCBs izole ve Valproik asit (VPA) sonucu çok sayıda ilkel HSCs4,9,10genişlemesi ile tedavi. HSC genişleme yalnızca UCBs türetilen varolan HSCs yayılması nedeniyle değil. Bunun yerine, bu genişleme sınırlı sayıda hücre bölünmeler ve nükleer silahların yayılmasına karşı9. ile kombine bir ilkel fenotip edinimi kaynaklanmaktadır İlk 24-48 h, sitokinler ve VPA, CD34 kombinasyonu ile kuluçka içinde+ hücreleri elde bir transcriptomic ve uzun vadeli HSCs karakterize fenotipik profil. HSCs yüzdesi önemli artış HSCs (VPA tedavinin 24 h içinde 63 kat artış)9sayısındaki hızlı artış eşlik ediyor. Özellikle, VPA-ex vivo genişleme stratejisi HSCs daha fazla vurgulamaktadır ilkel özellikleri düşük metabolik aktivite ile genişler.
Koşullar ve ex vivo genişlemesi ilkel HSCs için de önemli bir ölçüde yol tedavileri burada anlatılan yöntem sağlar klinik veya laboratuvar uygulamaları. Bu ex vivo genişleme stratejisi VPA tedavi ile kombine bir sitokin kokteyl kullanır. VPA bipolar bozukluklar ve diğer nörolojik hastalıkların tedavisi için FDA onaylı bir ilaçtır. HSC genişleme VPA ile komut istemi ve zaman manipülasyon ve bulaşma riskini en aza indirerek 7 gün içinde gerçekleşir. Önemlisi, bu iletişim kuralı uzun vadeli HSC fenotipik işaretleri CD90 ve CD49f gibi 24-48 h VPA9ile tedavi aşağıdaki içinde edinimi için izin verir. Bu iletişim kuralı ile oluşturulan genişletilmiş HSC Greftler onlar tüm hematopoietik hücre soy ayırt etmek ve uzun vadeli engraftment myeloablated NSG fareler nakli takip kurmak beri hematopoetik sistem yeniden kapasitesine sahiptir modelleri4. Ayrıca, bu iletişim kuralını son derece tekrarlanabilir ve uygun CD34 verimli ve hızlı yalıtım için sağlar+ hücreleri UCBs hangi bu yordamı sanayileşme için önemlidir.
VPA ex vivo genişletme protokolü de HSCs gen11düzenleme sırasında oluşur önemli kaybı üstesinden gelmek için potansiyele sahiptir. Düzenleme Gene Bisiklete binme hücreleri ve DNA tamir mekanizmaları harekete geçirmek için gerekli olan sitokinlerin maruz gerektirir. Gen değişikliği protokolleri genetiği değiştirilmiş hücreler daha yüksek bir sayı üretimi için uygun olan bir süre içinde kullanılması için VPA tedavisinin istemi üzerine etkileri nedeniyle, bu yöntem yararlı olabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CS2-0106-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Clone MOPC-21</td>
			<td>BD BIOSCIENCE</td>
			<td>555751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 15 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer and sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator device</td>
			<td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-PD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>BIOLEGEND</td>
			<td>400109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308FKN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbilical Cord-blood</td>
			<td>Placental Blood Program at the New York Blood Center</td>
			<td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood-derived cd34+ cells using valproic acid

Göbek Kordon kanı (UCB) birimleri alternatif kaynağı insan hematopoetik kök hücre (HSCs) allojenik kemik iliği nakli gerektiren hastalar için sağlar. UCB birkaç benzersiz avantajları olsa da, HSCs sınırlı sayıda her UCB birimi içinde rejeneratif tıp kullanımları ve erişkinlerde HSC nakli sınırlar. Fonksiyonel insan HSCs verimli genişlemesi elde edilebilir tarafından vivo CD34 kültür+ hücreleri izole--dan UCBs ve bir deacetylase inhibitörü, Valproik asit (VPA) ile tedavi. CD34 hızla yalıtmak için metodoloji ve kültür koşulları burada ayrıntılı protokolünü açıklar+ hücreleri ve yüksek bir dereceye kadar ilkel HSCs bir havuz genişletin. Genişletilmiş HSCs kısa ve uzun vadeli engraftment kurma yeteneğine ve farklılaştırılmış hematopoetik hücrelerin her türlü ortaya çıkmasına edebiliyoruz. Bu yöntem Ayrıca Otolog HSC gen tedavisi için klinik uygulama potansiyel tutar ve fonksiyonel HSCs gen düzenleme ile ilişkili kaybı üstesinden gelmek için çekici bir yaklaşım sağlar.

Ex vivo burada açıklanan protokol ilkel HSCs CD34 oluşturulan sayısını artırır.+ UCBs (şekil 1) izole hücreler. CD34 macun+ hücreler için 16 h ile bir sitokin kokteyl, ardından VPA ile tedavi için bir ek 7 gün, HSC genişleme büyük bir ölçüde yol açar. Dikkat çekici, havuzun genişletilmiş hücrelerin son derece phenotypically CD34 tarafından tanımlanmış olan HSCs için zenginleştirilmiştir+CD90<su...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid at JoVE.com

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Burada, biz eski tarif CD34 hematopoetik kök hücrelerden genişlemesi vivo+ hücreleri göbek kordon kanı türetilmiş bir sitokin kokteyl ve VPA kombinasyonu ile tedavi. Bu yöntem eski ilkel HSCs vivo genişlemesi için de önemli bir ölçüde yol açar klinik veya laboratuvar uygulamaları.

EX Vivo insan göbek kordon kanı elde edilen CD34 hematopoetik kök hücrelerden genişlemesi+ hücreleri kullanarak Valproik asit

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Göbek kordonkan ünitesinden hematopoetik kök hücrenin ek vivo genişlemesi rejeneratif tıp ve transplantasyon tedavisinde HSC uygulaması için büyük umut vaat ediyor. Bu protokol, valproik asit tedavisi ile birlikte bir sitokin kokteyli kullanarak primer ilkel HSC'lere çok benzeyen özelliklere sahip çok sayıda fonksiyonel HSC'yi hızla genişletmektedir.Bu yöntem, şu anda kullanılan gen modifikasyon protokolleri için geçerli olan bir süre içinde daha fazla sayıda genetiği değiştirilmiş hücrenin üretimi için yararlı olabilir. Valproik asit ex vivo genleşme protokolü nispeten basit ve güvenilirdir. CD34-pozitif hücrelerin hücre ayırıcı cihazı ile saflaştırılması son derece tekrarlanabilir ve hızlıdır, bu da yüksek oranda saflaştırılmış CD34-pozitif hücrelerin hızlı bir şekilde kurtarılmasına olanak sağlar.24 saat önce göbek kordon kanı CD-34 pozitif hücrelerin izolasyon, 0.5 molar EDTA iki mililitre ve 33 mililitre 7.5% BSA 465 mililitre 1X PBS ekleyerek ayırma tampon hazırlayın. Tamponu hafifçe karıştırın ve bir gecede dört santigrat derecede muhafaza edin. Arınma gününde, ortam oda sıcaklığına ısıtın.Tüm göbek kordonu kan ünitesini 75 santimetre karelik bir şişeye dağıtın. Oda sıcaklığında eşit miktarda PBS ile kanı seyreltin ve hafifçe karıştırın. Daha sonra, tüm göbek kordonu kan birimi işleme için gerekli tüplerin sayısını belirleyin.Her tüpe 15 mililitre yoğunluk gradyan ortam ekleyin. İki katman oluşturmak için tüpü 45 derecelik bir açıyla tutarken seyreltilmiş kanı yoğunluk degradesinin üzerine çok yavaş bir şekilde dağıtın. Düşük hızlanma ve yavaşlama hızı ile tüpü 400 g'da 30 dakika santrifüj edin.Santrifüjden sonra mononükleer hücreler plazma ve yoğunluk gradyan ortam katmanları arasındaki beyaz tabakada yer alacaktır. Buffy coat tabakasını yeni, 50 mililitrelik bir tüpe dikkatlice aktarın. 25 mililitre ulaşana kadar 50 mililitrelik bir tüp içine aynı göbek kordon kan ünitesinden mononükleer hücrelerin tüm toplayın.25 mililitre mononükleer hücre içeren tüpe 25 mililitre soğuk PBS ekleyin ve iyice karıştırın. Santrifüj 400 g ve 4 santigrat derecede 10 dakika. Dikkatle supernatant aspire ve soğuk PBS 50 mililitre hücre pelet resuspend.Bundan sonra, saymak için hücre süspansiyon 20 mikrolitre çıkarın. Acridine turuncu veya propidium iyodür ile boyanmış hücre sayısını saymak ve toplam mononükleer hücre sayısını hesaplamak için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Sonra, hücreleri 400 g ve 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj edin.İlk olarak, 10 milyon mononükleer hücreden CD34-pozitif hücreleri izole etmek için insan FCR insan IgG 100 mikrolitre ve CD34 manyetik boncuk 100 mikrolitre ile ayırma tampon 300 mikrolitre karıştırın. Daha sonra, daha önce santrifüj edilmiş mononükleer hücrelerin bir tüpten supernatant dikkatlice çıkarın. 10 milyon hücre başına 500 mikrolitre kullanarak manyetik boncuk çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın.Yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca dört derece santigrat de kuluçka. Kuluçka sırasında, depolama çözümlerini çalışan tamponla değiştirerek ve ardından bir yıkama programı çalıştırarak hücre ayırıcı cihazını hazırlayın. Daha sonra, tüp tamamen dolana kadar hücre karışımı içeren tüp için tampon çalışan soğuk hücre ayırıcı ekleyin.Tüpü 400 g ve 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj edin. Supernatant aspire ve 10 milyon hücre başına iki mililitre kullanarak tampon çalışan soğuk ayırıcı hücre pelet resuspend. 15 mililitrelik tüpler içine iki mililitre hücre süspansiyon karışımı aktarın.Tüplerin üç setini, önceden soğutulmuş olan hücre ayırıcı rafına yükleyin. Tüpler bir dizi MMCs içerir, tüplerin ikinci seti negatif fraksiyonu toplamak için kullanılacak, ve tüpler üçüncü bir set saf CD34-pozitif hücreleri toplamak için kullanılacaktır. Rafı hücre ayırıcı cihazına yükleyin ve önceden ayarlanmış programı çalıştırın.Bundan sonra, 400 g ve dört derece santigrat pozitif fraksiyonu içeren tüpler 15 dakika santrifüj. Süpernatant aspire ve serum içermeyen medya bir mililitre safCD34-pozitif hücreleri resuspend. Daha sonra, acridine turuncu veya propidium iyodür ile boyanmış hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın.İlk olarak, saflaştırılmış CD34-pozitif hücreleri mililitre başına 33,000 hücre yoğunluğunda plakalamak için yeterli miktarda ortam hazırlayın. Saflaştırılmış CD34 pozitif hücreleri, her kuyuda 1,5 mililitre lik bir hücre yoğunluğunda 12 kuyuluktaki bir plakaya yerleştirin. %5 karbondioksit nemlendirilmiş kuluçka makinesinde 37 derecede 16 saat kuluçka ya.Son konsantrasyon bir milimolar olduğunu kültürlere valproik asit ekleyin. Hücreleri yedi gün daha aynı koşullarda ek olarak ek olarak ekleme devam edin. Bu ex vivo protokolde, göbek kordon uğundan izole edilen CD34 pozitif hücrelerden üretilen ilkel hematopoetik kök hücrelerin sayısı artmaktadır.Tek başına sitokin kokteyli ile tedavi edilen kültürlerde çekirdekli hücrelerin toplam sayısı önemli ölçüde daha yüksektir. Toplam çekirdekli hücre sayısının artmasına rağmen, sitokin kokteyli alan kültürlerdeki hematopoetik kök hücre sayısı, sitokin kokteyli ve valproik asit le tedavi edilen kültürlere kıyasla tüm genişleme döneminde düşük kalır. Hematopoetik kök hücrelerin en çok sitokin kokteyl ve valproik asit kombinasyonu ile tedavi kültürlerde oluşturulur.Özellikle valproik asit ile tedaviden beş ila yedi gün sonra en büyük genişlemeye ulaşılır. Hematopoetik kök hücre bu artan sayıda valproik asit ile tedaviden sonra 24 saat içinde kayda değer hematopoetik kök hücre yüzdesinde hızlı bir artış ile ilişkilidir. Yüzdedeki artış ex vivo kültürünün ilk dört gününde korunurken, beş ila yedi günlük tedaviden sonra giderek azalır.Ancak, bu azalma ters hematopoetik kök hücrelerin mutlak sayısındaki bir artış ile ilişkilidir. Valproik asit ile tedavi edilen kültürlerde hematopoetik kök hücre yüzdesinde hızlı artış CD90 fenotip edinimi kaynaklanmaktadır. CD90'ı ifade eden CD34-pozitif hücreler, sitokin kokteyli ve valproik asit ile dört gün boyunca tedavi edilen ex vivo kültürlerde genişleyen hücrelerin neredeyse %40-50'sine ulaşır.CD90 fenotip edinimi daha sonra CD90 belirteci ifade eksikliği yüksek saflaşmış CD34-pozitif hücrelerin ex vivo genişleme ile doğrulanır. Valproik asit ile tedaviden sonraki 24 saat içinde, ex vivo genişletilmiş hücrelerin neredeyse %75'i CD90'ı ifade eder. Bu fenotip bu kültürlerde ilk dört gün boyunca yüksek oranda korunur.Seyreltilmiş kordon kanı, iki farklı katman oluşturmak için tüpü 45 derecelik bir açıyla tutarken yoğunluk degradesinin üzerine çok yavaş bir şekilde dağıtılmalıdır. Bu ex vivo genişleme prosedürü nden sonra, genişletilmiş hücreler işlevselliklerini ve engraftment potansiyelini test etmek için miyeloablated bağışıklık eksikliği NSG fareler içine enjekte edilebilir. Genişletilmiş hücreler, hem insan hem de fare HSC'nin biyolojisi ve farklı genlerin veya kritik oyuncunun HSC'lerin işlevsel bütünlüğü üzerindeki rolü ile ilgili çeşitli soruları test etmek için kullanılabilir.Bu tekniği kullanarak insan göbek kordonu kan ünitesinden ex vivo genişletilmiş HSC işlevselliği, allojenik kemik iliği nakli gerektiren hematolojik maligniteleri olan hastada klinik bir çalışmada yakında test edilecektir. Bu teknik aynı zamanda VPA tedavisi ile ex vivo expansion'ın altında yatan mekanizmayı araştırmamıza ve ilkel HSC'lerin biyolojisi hakkında bilgi edinmemize olanak sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

İnsan Hücre Lines Kemorezistans Yumurtalık Kanser Kök Hücreleri Zenginleştirme

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

İnsan Karaciğer Kök Hücreler kullanma Insanlaşmış Fare Karaciğer Üretimi

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...