Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

ويشكر المؤلفون أوسورسولينا بيتيلو على الدعم التقني. ويشكر المؤلفان الدكتورة مارياروساريا أليتا (CNR) على الدعم الببليوغرافي. ويشكر المؤلفون الدكتور غوستافو داميانو ميتا على تقديمهم إلى عالم مركز إدو. ويشكر المؤلفان لايكا ميكروسيستمز وباسكوال رومانو على مساعدتهما. تم دعم هذا البحث من قبل مشروع PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; الالتزام: PO FESR 2014-2020 كامبانيا; مشروع PO FESR كامبانيا 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE بير IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE النانوتكنولوجي الحيوي ATTIVE.

1. إعداد الطعام
<ol><li>
لمخزون صيانة وليرقات حالة نموّ, إستعمال [كرنميل] متوسّطة يحتوي 3% مسحوق خميرة, 10% [سكروس], 9% [بركوكد] دقيق الذرة, 0.4% [أغر], بعد ذلك يدعى [كورنميل] وسط ([كم]).
	<ol>
<li>ضع 30 غرام من الخميرة في 100 مل من ماء الصنبور، واتركه يغلي لمدة 15 دقيقة.</li>
		<li>بشكل منفصل، اخلطي جيداً 90 غرام...

وقد استخدمت ذبابة الفاكهة D. melanogaster على نطاق واسع كنظام نموذج في الجسم الحي للتحقيق في الآثار المحتملة للنظم البيئية مثل DBP28،BPA، 4-NP، 4-tert-OP29،MP30،EP31، 32،DEHP33،وEE234. وقد أدت عدة أسباب استخدامه ك...

وقد تم إطلاق الأنشطة البشرية في البيئة كمية هائلة من المواد الكيميائية، التي تمثل مشكلة خطيرة للكائنات الحية والنظم الإيكولوجية الطبيعية1. ومن بين هذه الملوثات، يقدر أن نحو 000 1 مادة كيميائية مختلفة قد تغير التوازن الطبيعي لنظم الغدد الصماء؛ وفقا لهذه الخاصية، وهي تصنف على أنها المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDCs). على وجه التحديد، استنادا إلى تعريف حديث من قبل جمعية الغدد الصماء، وEDCs هي "مادة كيميائية خارجية، أو خليط من المواد الكيميائية، التي يمكن أن تتداخل مع أي جانب من جوانب العمل الهرموني"2. على مدى العقود الثلاثة الماضية، كان هناك أدلة علمية متزايدة على أن EDCs يمكن أن تؤثر على تكاثر وتطوير الحيوانات والنباتات3،4،5،6،7، 8. وعلاوة على ذلك، كان التعرض EDC يرتبط بزيادة انتشار بعض الأمراض البشرية، بما في ذلك السرطان والسمنة والسكري وأمراض الغدة الدرقية، والاضطرابات السلوكية9،10،11.
الآليات العامة لـ EDC
بسبب خصائصها الجزيئية، والممارسات غير القانونية يتصرفمثل الهرمونات أو السلائف هرمون 3،4،5،6،7،8،9، 10,11,12. في هذا المعنى, أنها يمكن ربط مستقبلات هرمون وتعطيل نظم الغدد الصماء إما عن طريق محاكاة النشاط الهرموني أو عن طريق منع الهرمونات الذاتية ملزمة. في الحالة الأولى, بعد ملزمة لمستقبلات, أنها يمكن تفعيلها كما يفعل هرمونها الطبيعي. في الحالة الأخرى، وملزمة من EDC إلى مستقبلات يمنع الربط من هرمونها الطبيعي، وبالتالي يتم حظر مستقبلات ولم يعد يمكن تفعيلها، حتى في وجود هرمونها الطبيعي3. ونتيجة لذلك، يمكن أن تؤثر على العديد من العمليات، مثل التوليف، وإفراز، والنقل، والتمثيل الغذائي، أو العمل المحيطي للهرمونات الذاتية المسؤولة عن الحفاظ على التوازن، والتكاثر، والتنمية، و / أو سلوك الكائن الحي. والربط بين المستقبلات ليس هو السبيل الوحيد للعمل الذي تم وصفه حتى الآن بالنسبة للمراكز المعنية بمكافحة الفلور والألغام. ومن الواضح الآن أنها يمكن أن تعمل أيضا عن طريق تجنيد coactivators أو corepressors في مسارات الأنزيمية أو عن طريق تعديل علامات جينية تحرير التعبير الجينيالجيني 10،11،12،13 ،14، مع عواقب ليس فقط للجيل الحالي ولكن أيضا لصحة الأجيال القادمة8.
هرمونات الدروفيلا
وقد تم دراسة الآثار المحتملة لنخبة من المركبات المنتَجة للمواد الضارة بالحيوانات البرية على نطاق واسع، سواء في أنواع الأحياء البرية أو في عدة نظم نموذجية تكون فيها آليات الغدد الصماء معروفة جيداً إلى حد معقول. أما بالنسبة لللافقاريات، فقد تم وصف نظم الغدد الصماء التي تؤثر على النمو والتنمية والتكاثر على نطاق واسع في الحشرات لعدة أسباب، بما في ذلك استخدامها على نطاق واسع في مجال البحوث البيولوجية، وأهميتها الاقتصادية، و أخيرا تطوير المبيدات الحشرية قادرة على التدخل على وجه التحديد مع نظام هرمون الآفات.
على وجه الخصوص ، بين الحشرات ، ثبت أن ذبابة الفاكهة D. melanogaster نظام نموذجي قوي جدا لتقييم الآثار المحتملة لالغدد الصماء من EDCs. في D. الميلانوجاستر, وكذلك في الفقاريات, الهرمونات تلعب دورا هاما طوال دورة الحياة بأكملها. في هذا الكائن الحي، وهناك ثلاثة نظم الهرمونية الرئيسية، والتي تنطوي على هرمون الستيرويد 20-هيدروكسيكديسون (20E)15،16، وهرمون الأحداث sesquiterpenoid (JH)17، والببتيدات العصبية والببتيد / البروتين الهرمونات18. تتكون هذه المجموعة الثالثة من العديد من الببتيدات التي تم اكتشافها في الآونة الأخيرة ولكن تشارك بوضوح في مجموعة كبيرة من العمليات الفسيولوجية والسلوكية، مثل طول العمر، التوازن، التمثيل الغذائي، والإنجاب، والذاكرة، والتحكم في الحركة. 20E هو متجانسة لهرمونات الستيرويد المشتقة من الكولسترول مثل استراديول, في حين JH تشترك في بعض أوجه التشابه مع حمض الريتينويك; كلاهما الهرمونات المعروفة في Drosophila19,20. توازنها أمر حيوي في تنسيق الصهر والتحوّل، وكذلك في السيطرة على العديد من العمليات ما بعد النمو، مثل التكاثر، والعمر، والسلوك21،وبالتالي توفير إمكانيات مختلفة لاختبار الغدد الصماء اضطراب في Drosophila. وعلاوة على ذلك، فإن هرمونات الإيكوستيرويد وJHs هي الأهداف الرئيسية لما يسمى بالمبيدات الحشرية من الجيل الثالث، والتي تم تطويرها للتدخل في العمليات التنموية والإنجابية بوساطة الغدد الصماء في الحشرات. وطريقة عمل هذه المواد الكيميائية من الناهض أو الخصم معروفة جيدا، وبالتالي يمكن أن تكون بمثابة معايير مرجعية لتقييم آثار الـ EDCs المحتملة على نمو الحشرات وتكاثرها وتطويرها22. على سبيل المثال ، الميثوبرين ، الذي تم استخدامه على نطاق واسع في السيطرة على البعوض والحشرات المائية الأخرى23،24، يعمل كناهض JH وتقوّق نسخ الجينات الناجم عن 20E والتحوّل.
بالإضافة إلى الهرمونات, مستقبلات النووية (NR) الأسرة الفائقة في Drosophila هو أيضا معروفة جيدا; وهو يتألف من 18 عوامل النسخ المحفوظة تطوريا المشاركة في السيطرة على مسارات النمو المعتمدة على هرمون، فضلا عن التكاثر وعلم وظائف الأعضاء25. هذه الهرمونات NRs تنتمي إلى جميع الأنواع الفرعية NR ستة, بما في ذلك تلك التي تشارك في الإرسال العصبي26, اثنان لحمض الريتينويك روبية, وتلك لNRs الستيرويد التي, في الفقاريات, تمثل واحدة من الأهداف الأساسية لـ EDCs27.
Drosophila كنظام نموذجي لدراسة EDCs
وفي الوقت الراهن، تقوم عدة وكالات بيئية في جميع أنحاء العالم، على أساس الخصائص الجزيئية، بإسناد إمكانية التدخل في نظم الغدد الصماء إلى مختلف المواد الكيميائية من صنع الإنسان. ونظرا لأن هذه المراكز هي مشكلة عالمية وشاملة بالنسبة للبيئة وللكائنات الحية، فإن الهدف العام للبحوث في هذا المجال هو تخفيف عبء الأمراض التي تتحملها، فضلا عن حماية الكائنات الحية من آثارها الضارة. من أجل تعميق فهم الآثار المحتملة لالغدد الصماء من مادة كيميائية، فمن الضروري لاختباره في الجسم الحي. ولهذه الغاية، يمثل د. ميلانوجاستر نظاماً نموذجياً صالحاً. وحتى الآن، استخدمت ذبابة الفاكهة على نطاق واسع في نموذج الحي الحي لتقييم آثار العديد من الـEDCs البيئية؛ وقد أفيد أن التعرض للعديد من مركبات الميتاليك الهيدرولية، مثل ثنائي بوتيل الفثالات (DBP)28، البيسفينول A (BPA)، 4-nonylphenol (4-NP)، 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29، ميثيل بارابين (MP)30، إيثيل بارابين (EP)31، 32، bis-(2-ethylhexyl) الفثالات (DEHP)33، و 17-α-ethinylestradiol (EE2)34، يؤثر على وظائف التمثيل الغذائي والغدد الصماء كما هو الحال في نماذج الفقاريات. وقد أدت عدة أسباب إلى استخدامه كنموذج في هذا المجال من البحث. بالإضافة إلى المعرفة الممتازة بنظم الغدد الصماء، تشمل المزايا الأخرى دورة حياتها القصيرة، والتكلفة المنخفضة، والجينوم القابل للنبض بسهولة، وتاريخ طويل من البحث، والعديد من الإمكانيات التقنية (انظر موقع FlyBase على الويب، http://flybase.org/). كما يوفر د. ميلانوجاستر نموذجاً قوياً لدراسة الآثار عبر الأجيال والاستجابات السكانية للعوامل البيئية8 بسهولة، ويتجنب القضايا الأخلاقية ذات الصلة بالدراسات الحية في الحيوانات الأعلى. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ذبابة الفاكهة تشترك في درجة عالية من الحفاظ على الجينات مع البشر مما قد يجعل من الممكن لفحوصات Drosophila EDC للمساعدة في التنبؤ أو اقتراح الآثار المحتملة لهذه المواد الكيميائية على صحة الإنسان. وإلى جانب توسيع نطاق فهم الآثار على صحة الإنسان، يمكن أن تساعد Drosophila في تقييم مخاطر التعرض لـ EDC للبيئة، مثل فقدان التنوع البيولوجي والتدهور البيئي. وأخيراً، فإن ذبابة الفاكهة توفر ميزة إضافية تتمثل في استخدامها في المختبرات، حيث يمكن إبقاء العوامل التي يحتمل أن تؤثر على تطورها وتكاثرها وعمرها تحت السيطرة من أجل عزو أي اختلاف إلى المادة التي يتعين اختبارها.
مع هذا في الاعتبار، قمنا بتحسين اختبارات اللياقة البدنية بسيطة وقوية لتحديد آثار EDC على بعض الصفات الهرمونية Drosophila، مثل الخصوبة / الخصوبة، وتوقيت النمو، وعمر الكبار. وقد استخدمت هذه الاختبارات على نطاق واسع لبعض EDCs23،24،25،26،27. على وجه الخصوص, لقد استخدمنا البروتوكولات التالية لتقييم آثار التعرض لهرمون الاستروجين الاصطناعية EE234 وBPA وإلى التركيز البؤري التلقائي البيسفينول (BPA F) (بيانات غير منشورة). ويمكن تعديل هذه البروتوكولات بسهولة للتحقيق في آثار EDC معينة في وقت واحد، فضلا عن الآثار مجتمعة من EDCs متعددة في D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

في السنوات الأخيرة كانت هناك أدلة متزايدة على أن جميع الكائنات الحية والبيئة تتعرض للمواد الكيميائية الشبيهة بالهرمونات، والمعروفة باسم المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDCs). وقد تغير هذه المواد الكيميائية التوازن الطبيعي لأنظمة الغدد الصماء وتؤدي إلى آثار ضارة، فضلا عن زيادة عدد الاضطرابات الهرمونية في السكان أو اضطراب النمو وانخفاض التكاثر في أنواع الحياة البرية. وبالنسبة لبعض مراكز إدوْن، هناك آثار صحية موثقة وقيود على استخدامها. ومع ذلك، بالنسبة لمعظمهم، لا يوجد حتى الآن أي دليل علمي بهذا المعنى. من أجل التحقق من آثار الغدد الصماء المحتملة للمادة الكيميائية في الكائن الحي الكامل، ونحن بحاجة لاختباره في نظم النموذج المناسب، وكذلك في ذبابة الفاكهة، Drosophila الميلانوجاستر. هنا نبلغ مفصلة في بروتوكولات الجسم الحي لدراسة اضطراب الغدد الصماء في Drosophila, معالجة آثار EDC على الخصوبة / الخصوبة, توقيت النمو, وعمر الذبابة. في السنوات القليلة الماضية، استخدمنا هذه الصفات الحياة Drosophila للتحقيق في آثار التعرض ل17-α-ethinylestradiol (EE2)، بيسفينول A (BPA)، وبيسفينول التركيز البؤري التلقائي (BPA F). وإجمالاً، غطت هذه الفحوصات جميع مراحل حياة دروسوفيلا وجعلت من الممكن تقييم اضطراب الغدد الصماء في جميع العمليات التي يتم بوساطتها الهرمونات. وكانت اختبارات الخصوبة/الخصوبة وأوقات النمو مفيدة لقياس تأثير التكافؤ في الأداء على الأداء التناسلي للذبابة وعلى مراحل النمو، على التوالي. وأخيراً، انطوى التقييم العمري على التعرض المزمن للكبار للأشخاص البالغين وقياس نجاتهم. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تتأثر هذه الصفات الحياة من قبل العديد من العوامل التجريبية التي كان لا بد من السيطرة عليها بعناية. لذلك، في هذا العمل، نقترح سلسلة من الإجراءات التي قمنا بتحسينها للنتيجة الصحيحة لهذه الاختبارات. وتسمح هذه الأساليب للعلماء بتحديد اضطراب الغدد الصماء لأي من مركبات نقص التغذية أو لخليط من مختلف مركبات التغذية المنسّكة في دروسسوفيلا، وإن كان من الضروري تحديد آلية الغدد الصماء المسؤولة عن هذا التأثير، إلى مزيد من المقالات.

في هذا القسم، يتم الإبلاغ عن الخطوات الرئيسية للبروتوكولات المذكورة أعلاه في شكل مخططات مبسطة. وبالنظر إلى أن الذباب تميل إلى تجنب المركبات غير مستساغة, أول شيء القيام به هو أن نحسب طعم EDC مختارة. ويمكن القيام بذلك عن طريق خلط تلوين الطعام (على سبيل المثال، أحمر الغذاء صبغ رقم 40)35</...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

وتمثل المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء مشكلة خطيرة بالنسبة للكائنات الحية والبيئات الطبيعية. Drosophila الميلانوغاستر يمثل نموذجا مثاليا لدراسة آثار EDC في الجسم الحي. هنا، نقدم أساليب للتحقيق في اضطراب الغدد الصماء في Drosophila، ومعالجة آثار EDC على الخصوبة والخصوبة وتوقيت النمو، وعمر الذبابة.

طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في الميلانوجاستر Drosophila

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila الميلانوغاستر هو نموذج قوي لتقييم في الجسم الحي الآثار السامة والغدد الصماء المحتملة من المواد الكيميائية، مثل الغدد الصماء، التي تمثل مشكلة خطيرة لصحة الإنسان والبيئات الطبيعية. معالجة تأثير EDCs على سمات الحياة الهرمونية للذبابة ، مثل البراز والخصوبة ووقت النمو والعمر الافتراضي. إنها طريقة سهلة ورخيصة وسريعة للتحقيق في اضطراب الغدد الصماء في الجسم الحي.يمكن أن تتأثر الخصوبة والتنمية والعمر الافتراضي في دروسوفيليا بعدة عوامل يجب التحكم فيها بعناية لضمان النتيجة الناجحة لهذا البروتوكول. لذلك ، مطلوب أقصى قدر من الاهتمام في تربية الذباب والتعامل معه. لمقايسة طعم EDC المختارة ، بعد التخدير ، نقل 15 ذبابًا صغيرًا من السرير المتطاير إلى أربع قوارير متوازية تحتوي على متوسط دقيق الذرة الممزوج بتلوين الطعام.تحتوي قارورة التحكم على المذيبات وحدها ، ويتم استكمال قوارير الثلاث الأخرى بجرعات مختلفة من EDCs المختارة. احتفظ بالقنينات في حاضنة مرطبة ليوم واحد مع ضوء طبيعي لمدة 12 ساعة. بعد تخدير الذباب مرة أخرى، نقل الذباب غير المُشلَّم إلى ورقة بيضاء، ووضعها تحت مجهر ستيريو لمراقبة.قارن تلوين البطن لكل مجموعة من مجموعات العلاج فيما يتعلق بمجموعة التحكم. لمقايسة الأداء الإنجابي للذباب، وإعداد ثلاث قوارير من الذباب لكل EDC كما قارورة الوالدين، مع ثماني إناث وأربعة ذكور في 10 ملليلتر من متوسط دقيق الذرة تستكمل مع EE2. للسيطرة، وإعداد ست قوارير من الذباب، كل مع ثماني الإناث وأربعة ذكور في 10 ملليلتر من الغذاء متوسط دقيق الذرة تكملها المذيبات EE2.الخلفية تطير في حاضنة في 25 درجة مئوية. أثناء نموها ، تجنب اكتظاظ اليرقات. بعد أربعة أيام، عكس كل قارورة على الأثير لإزالة الآباء وإعادة القنينات إلى الحاضنة لمدة خمسة أيام أخرى.في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم التاسع، عكس كل قارورة على الأثير لإزالة جميع الذباب ظهرت حديثا من قوارير ووضع قارورة في حاضنة أخرى في 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم 10، على محطة عمل 2 أكسيد الكربون Drosophila، عكس بعناية قارورة الثقافة لمنع الذباب تخدير من السقوط على المتوسطة وإدراج أنبوب مطاطي مع إبرة في القارورة بين سدادة القطن وجدار القارورة. افتح الصمام لتوصيل ثاني أكسيد الكربون.في غضون ثوان، نقل الذباب إلى سرير ذبابة تحت المجهر. جمع العذراء الإناث والذكور الصغار بشكل منفصل في مجموعتين على السرير يطير. تقسيم عشوائي كل مجموعة من الذباب في مجموعات فرعية صغيرة، مع 10 الإناث أو 20 الذكور لكل قارورة مليئة الطازجة مطابقة دقيق الذرة المتوسطة.مواصلة حضانة وجمع 30 عذراء الإناث و 30 الذكور لكل EDC، و 90 الإناث العذراء والذكور 90 الذكور للسيطرة. بيت هذه المجموعات من الذباب في 25 درجة مئوية حتى أنها تبلغ من العمر أربعة أيام بعد انهيار. ثم نقلها إلى قارورة جديدة تحتوي على وسيط جديد مطابق كل يومين.تحقق من عدم وجود يرقات في قوارير الإناث. ثم قم بتسمية قوارير بسلسلة مختلفة من الأرقام المتسلسلة للعلاج التالي. بعد التخدير، نقل أنثى واحدة EE2 المذيبات المعالجة إلى قارورة صغيرة تحتوي على طماطم دقيق الذرة الطازجة المتوسطة دون EE2 وإضافة واحد EE2 المذيبات المعالجة الذكور للسيطرة عبر.إقران ذكر EE2 معاملة مع الإناث EE2 المعالجة المذيبات أو الإناث EE2 المعالجة مع الذكور EE2 المعالجة بالمذيبات لكل علاج. منزل 20 واحد الصلبان في 25 درجة مئوية. نقل كل زوج التزاوج إلى قنينات الطماطم الطازجة الطماطم المتوسطة دون EDC كل يوم لمدة 10 أيام لاحقة.فحص بصريا كل قارورة كل يوم للبيض والإبلاغ عن رقمها على جدول الخصوبة. في كل قارورة، تحقق عن كثب للذباب الناشئ حديثاً وسجل العدد اليومي للذروة البالغة على مدى فترة 10 أيام. بعد 10 أيام من التزاوج الأولي، إزالة الآباء من السلسلة الأخيرة من قوارير.في بروتوكولات فحص الكسر ، أولاً ، لكل مجموعة علاجية ، وضعت 10 قوارير من الذباب الصغير السليم أقل من يومين ، كل منها مع ست إناث وثلاثة ذكور في 10 ملليلتر من طعام دقيق الذرة دون EDC. تربية الذباب على الطعام لمدة 24 ساعة والسماح لهم بالتزاوج. ثم قم بإعداد 10 قوارير متوازية أخرى لكل مجموعة معالجة مع 10 ملليلترات كل من أغذية دقيق الذرة الطازجة المكملة لتركيزات EDC مختلفة أو مذيب EE2 وحده للتحكم.نقل الذباب تزاوج إلى هذه القوارير الجديدة. قم بعمل جدول بيانات تطويري لتسجيل السلسلة المختلفة. السماح للذباب لوضع البيض لمدة 16 ساعة.ثم، إزالة الآباء من قارورة. احتضان القنينات في 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام، أو حتى اليرقات تجول مرئية. كل يوم، عد عدد من pupae جديدة في كل قارورة عن طريق كتابة رقم في تسلسل من قبل كل خادرة على السطح الخارجي للقارورة لتجنب عد نفس pupa مرتين.الإبلاغ عن عدد من pupae ظهرت حديثا لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام، أو حتى لا أكثر شكل pupae. بدءا من اليوم التاسع، عد عدد البالغين الناشئين يوميا، حتى لا يظهر المزيد من البالغين. الإبلاغ عنها على جدول التنمية وأداء بقية فحص الزخرفة وفقا للمخطوطة.في بروتوكول العمر الافتراضي، وضعت لأول مرة 20 قنينة مع ثماني إناث وأربعة ذكور، كل مليئة 10 ملليلتر من الغذاء دقيق الذرة وسكن لهم في 25 درجة مئوية. بعد أربعة أيام، تخلص من الذباب ووضع القنينات مرة أخرى في الحاضنة. في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم التاسع، إزالة جميع الذباب ظهرت حديثا من قارورة والعودة قارورة إلى الحاضنة.بعد 16 إلى 24 ساعة، تقسيم 250 الذباب البالغ من العمر يوم واحد من كلا الجنسين إلى أربع مجموعات تحت التخدير ثاني أكسيد الكربون الخفيف ونقلها إلى زجاجات 250 ملليلتر تحتوي على الغذاء المتوسط الكبار، وثلاثة تستكمل مع تركيزات مختلفة EDC وواحدة مع المذيبات EE2 وحدها. الحفاظ على الذباب في 25 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام للسماح لهم بالتزاوج. ثم، فرز كل فوج من الذباب حسب الجنس في مجموعتين.في كل حالة علاج، لكلا الجنسين، تقسيم كل مجموعة بشكل عشوائي إلى خمس قوارير متوازية بكثافة 20 فردًا لكل قارورة. إعداد جدول بيانات عمر يتم فيه طرح عدد الذباب الميت من عدد الذباب الباقي من النقل السابق، بحيث يتم الحصول على عدد الناجين في كل عملية نقل تلقائياً. بعد ثلاثة أيام، نقل الذباب دون تخدير إلى قنينات جديدة تحتوي على الغذاء المقابل في نفس الوقت والتحقق من الموت.سجل عمر الذباب وعدد الذباب الميت. كرر النقل كل ثلاثة أيام حتى يموت كل الذباب. في هذه التجربة، تم رسم منحنيات العمر على أنها الناجين التراكمي مقابل الأيام المنقضية لكل تركيز EDC والتحكم.بالنسبة للسيطرة، بعد فترة أولية طويلة حيث ظل منحنى الناجين مرتفعًا نسبيًا، انخفض بشكل كبير بعد حوالي 60 يومًا. وفي أعقاب التعرض للذباب المعالجة، تأثر منحنى الناجين من الذباب المعالج تأثراً كبيراً، وأظهر انخفاضاً كبيراً بعد 36 يوماً. ينصح حول أن قنينات موازية قيد التحليل ينبغي أن تكون مشابهة جدا، وإلا فإنه سيكون من الصعب أن نفهم أي لتجاهل.لذلك، نقترح الحرص الشديد، واعتماد ممارسة تجريبية جيدة، وذلك باستخدام حجم عينة كبيرة. وبعد هذه البروتوكولات، من الممكن أيضاً تقييم الأثر العابر للأجيال لمخلِّفات الغدد الصماء المختارة، وكذلك اختبار الآثار المضافة المحتملة لمزيج من مختلف تشوهات الغدد الصماء.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

يعاير بالسكان خلية الدم لل<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; اليرقة

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

تربية ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تحت ممحوضة ومعروف المعايشات شروط

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

طرق لفحص الليمفاوية الغدة وHemocytes في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

فحص لسلامة حاجز الدم في الدماغ في دروسوفيلا melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

التصوير الحيواني كله من الميلانوغاستر Drosophila باستخدام التصوير المقطعي microcomputed

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

تصوير نبتات الدماغ الحية من ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر يرقات Instar الثالثة

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في ديناميكيات انقسام الخلايا غير المتماثلة: بروتوكول للتصوير الحي لنباتات دماغ يرقات ذبابة الفاكهة 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

تصوير الخلايا الحية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر أدمغة اليرقات الثالثة

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...