Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Forfatterne takker Orsolina Petillo for teknisk support. Forfatterne takker Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) for bibliografisk støtte. Forfatterne takker Dr. Gustavo Damiano Mita for at introducere dem til EDC verden. Forfatterne takker Leica Microsystems og Pasquale Romano for deres assistance. Denne forskning blev støttet af Project PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate Alla Rigenerazione e ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica i Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projekt PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

1. tilberedning af fødevarer
<ol><li>
Til vedligeholdelse af lageret og til vækst af larve skal der anvendes et korn mel, der indeholder 3% pulveriseret gær, 10% saccharose, 9% forooked majsmel, 0,4% agar, derefter kaldet majsmel medium (cm).
	<ol>
<li>Sæt 30 g gær i 100 mL ledningsvand, Bring det i kog og lad det koge i 15 min.</li>
		<li>Hver for sig blandes godt 90 g forkogt majsmel, 100 g sukker og 4 g agar i 900 mL ledningsvand.</li>
		<li>Bring opløsningen i kog, Sænk varmen og kog i 5 min...

Frugtflue D. melanogaster er blevet flittigt ansat som et in vivo modelsystem til at undersøge de potentielle virkninger af miljømæssige edc'er såsom DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31, 32, DEHP33og EE234. Flere grunde har ført til, at det er blevet brugt som model på dette forskningsområde. Bortset fra sine ubestridte fo...

Menneskelige aktiviteter har i miljøet frigivet en massiv mængde kemikalier, som udgør et alvorligt problem for organismer og for naturlige økosystemer1. Af disse forurenende stoffer anslås det, at omkring 1.000 forskellige kemikalier kan ændre den normale balance af endokrine systemer; Ifølge denne egenskab klassificeres de som endokrine forstyrrende kemikalier (Edc'er). Specifikt, baseret på en nylig definition af endokrine Society, Edc'er er "en eksogen kemiske, eller blanding af kemikalier, der kan forstyrre ethvert aspekt af hormon aktion"2. I løbet af de sidste tre årtier har der været voksende videnskabelige beviser for, at edc'er kan påvirke reproduktion og udvikling af dyr og planter3,4,5,6,7, 8. den er Yderligere, EDC eksponering har været relateret til den stigende forekomst af nogle menneskelige sygdomme, herunder kræft, fedme, diabetes, skjoldbruskkirtel sygdomme, og adfærdsmæssige lidelser9,10,11.
Generelle mekanismer i EDC
På grund af deres molekylære egenskaber opfører edc'er sig som hormoner eller hormon prækursorer3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. I denne forstand, de kan binde til et hormonreceptor og forstyrre endokrine systemer enten ved at efterligne hormon aktivitet eller ved at blokere endogene hormoner binding. I det første tilfælde, efter binding til receptoren, de kan aktivere det som sin naturlige hormon ville gøre. I det andet tilfælde, binding af EDC til receptoren forhindrer bindingen af dens naturlige hormon, så receptoren er blokeret og kan ikke længere aktiveres, selv i nærværelse af sin naturlige hormon3. Som en konsekvens, kan Edc'er påvirke flere processer, såsom syntese, sekretion, transport, metabolisme, eller perifer virkning af endogene hormoner, der er ansvarlige for opretholdelse af homøostase, reproduktion, udvikling og/eller opførsel af organismen. Receptor binding er ikke den eneste metode, der hidtil er beskrevet for Edc'er. Det er nu klart, at de også kan handle ved at rekruttere koaktivatorer eller corepressorer i enzymatiske veje eller ved at ændre epigenetiske markører deregulerende genekspression10,11,12,13 ,14, med konsekvenser ikke kun for den nuværende generation, men også for sundheden for generationer til at komme8.
Drosophila hormoner
De potentielle virkninger af udvalgte Edc'er er blevet undersøgt bredt, både i dyrearter og i flere modelsystemer, hvor endokrine mekanismer er rimeligt velkendte. For hvirvelløse dyr er endokrine systemer, der påvirker vækst, udvikling og reproduktion, blevet udførligt karakteriseret i insekter af flere årsager, hvilket involverer deres omfattende anvendelse inden for biologisk forskning, deres økonomiske betydning og Endelig udvikling af insekticider i stand til at blande sig specifikt med hormonsystemet af skadedyr insekter.
Især blandt insekter, frugtflue D. melanogaster har vist sig at være en meget kraftfuld modelsystem til at vurdere de potentielle endokrine virkninger af edc'er. I D. melanogaster, såvel som i hvirveldyr, spiller hormoner en vigtig rolle i hele livscyklussen. I denne organisme, der er tre vigtigste hormonelle systemer, som involverer steroid hormon 20-hydroxyecdysone (20E)15,16, sesquiterpenoid juvenil hormon (JH)17, og Neuro peptider og peptid/protein hormoner18. Denne tredje gruppe består af flere peptider opdaget for nylig, men klart involveret i et stort udvalg af fysiologiske og adfærdsmæssige processer, såsom lang levetid, homøostase, metabolisme, reproduktion, hukommelse, og lokomotor kontrol. 20E er homologe til kolesterol-afledte steroid hormoner såsom estradiol, mens JH deler nogle ligheder med retinoinsyre; begge af dem er de bedre kendte hormoner i Drosophila19,20. Deres balance er afgørende i at koordinere støbning og metamorfose, samt i at kontrollere flere post-udviklingsmæssige processer, såsom reproduktion, levetid, og adfærd21, således at tilbyde forskellige muligheder for testning endokrine afbrydelse af Drosophila. Yderligere, ecdysteroide hormoner og Jh'er er de vigtigste mål for den såkaldte tredje generations insekticider, der er udviklet til at forstyrre udviklingsmæssige og reproduktive endokrine medierede processer i insekter. Den agonist eller antagonist virkningsmåde af disse kemikalier er velkendt, og dermed kan de tjene som reference standarder for evaluering af virkningerne af potentielle Edc'er om vækst, reproduktion og udvikling af insekter22. F. eks. er methopren, som i vid udstrækning er blevet anvendt til at kontrollere myg og andre akvatiske insekter23,24, en JH agonist og undertrykker 20E-induceret gentransskription og metamorfose.
Ud over hormoner, den nukleare receptor (NR) super familie i Drosophila er også velkendt; Den består af 18 evolutionært bevaret transkription faktorer, der er involveret i at kontrollere hormon-afhængige udviklingsmæssige veje, samt reproduktion og fysiologi25. Disse hormon-NR'er tilhører alle seks undertyper af NR-familien, herunder dem, der er involveret i neurotransmission26, 2 for retinoinsyre NRS, og dem for steroid-NR'er, der i hvirveldyr udgør et af de primære mål for edcs27.
Drosophila som modelsystem til studier af Edc'er
I øjeblikket, på grundlag af molekylære egenskaber, flere miljøagenturer rundt om i verden tillægger potentialet til at blande sig med de endokrine systemer til forskellige menneskeskabte kemikalier. Da Edc'er er et globalt og allestedsnærværende problem for miljøet og for organismer, er det overordnede mål med forskningen på dette område at reducere deres sygdomsbyrde samt at beskytte levende organismer mod deres skadelige virkninger. For at uddybe forståelsen om de potentielle endokrine virkninger af et kemikalie, er det nødvendigt at teste det in vivo. Til dette formål repræsenterer D. melanogaster et gyldigt modelsystem. Til dato er frugtflue blevet flittigt anvendt som in vivo model til at vurdere virkningerne af flere miljømæssige Edc'er; Det er blevet rapporteret, at eksponeringen for flere edc'er, såsom dibutylphthalatfyldte phthalat (DBP)28, Bisphenol a (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-Octylphenol (4-tert-op)29, methylparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-ethylhexyl) phthalat (dehp)33og 17-α-ethinylestradiol (EE2)34, påvirker metabolisme og endokrine funktioner som i hvirveldyr modeller. Flere grunde har ført til, at det er blevet brugt som model på dette forskningsområde. Ud over en fremragende viden om sine endokrine systemer, yderligere fordele omfatter sin korte livscyklus, lave omkostninger, let manipulerbare genom, en lang historie af forskning, og flere tekniske muligheder (Se FlyBase hjemmeside, http://flybase.org/). D. melanogaster giver også en effektiv model til let at studere Trans generations effekter og befolkningens respons på miljøfaktorer8 og undgår etiske spørgsmål, der er relevante for in vivo-undersøgelser af højere dyr. Desuden, frugtflue deler en høj grad af genbevaring med mennesker, som kan gøre det muligt for Drosophila EDC analyser til at hjælpe med at forudsige eller foreslå potentielle virkninger af disse kemikalier for menneskers sundhed. Ud over at udvide forståelsen om menneskers sundhed virkninger, Drosophila kan bidrage til at vurdere risiciene for EDC eksponering for miljøet, såsom biodiversitet tab og miljøforringelse. Endelig giver frugtfluen den yderligere fordel, at den anvendes i laboratorier, hvor de faktorer, der potentielt påvirker dens udvikling, reproduktion og levetid, kan holdes under kontrol for at tilskrive enhver variation af det stof, der skal testes.
Med dette i tankerne, har vi optimeret enkle og robuste fitness analyser til bestemmelse af EDC effekter på nogle Drosophila hormonelle træk, såsom frugtbarhed/fertilitet, udviklingsmæssige timing, og voksen levetid. Disse analyser har været almindeligt anvendt til nogle edcs23,24,25,26,27. Især har vi brugt følgende protokoller til at vurdere virkningerne af eksponeringen for syntetisk østrogen EE234 og til BPA og til Bisphenol af (BPA F) (ikke-offentliggjorte data). Disse protokoller kan let ændres for at undersøge virkningerne af en given EDC på et tidspunkt, samt de kombinerede virkninger af flere Edc'er i D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

I de seneste år har der været voksende beviser for, at alle organismer og miljøet er udsat for hormon-lignende kemikalier, kendt som endokrine forstyrrende stof kemikalier (edc'er). Disse kemikalier kan ændre den normale balance af endokrine systemer og føre til negative virkninger, samt et stigende antal hormonelle lidelser i den menneskelige befolkning eller forstyrret vækst og reduceret reproduktion i de vilde dyr arter. For nogle Edc'er, der er dokumenteret sundhedsmæssige virkninger og begrænsninger på deres anvendelse. Men for de fleste af dem er der stadig ingen videnskabelige beviser i denne forstand. For at verificere potentielle endokrine virkninger af et kemikalie i hele organismen, er vi nødt til at teste det i passende modelsystemer, samt i frugtflue, Drosophila melanogaster. Her rapporterer vi detaljerede in vivo protokoller for at studere endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressere EDC effekter på frugtbarhed/fertilitet, udviklingsmæssige timing, og levetiden af flue. I de sidste par år, vi brugte disse Drosophila liv træk til at undersøge virkningerne af eksponering for 17-α-ethinylestradiol (EE2), Bisphenol A (BPA), og bisphenol AF (BPA F). Tilsammen dækkede disse analyser alle Drosophila livsstadier og gjorde det muligt at evaluere endokrine forstyrrelser i alle hormon-medierede processer. Fecundity/fertilitet og udviklingsmæssige timing analyser var nyttige til at måle EDC indvirkning på flue reproduktionsevne og på udviklingsmæssige stadier, hhv. Endelig, levetid assay involveret kronisk EDC eksponeringer mod voksne og målte deres overlevelse. Men disse livs træk kan også være påvirket af flere eksperimentelle faktorer, der skulle kontrolleres nøje. Så i dette arbejde, foreslår vi en række procedurer, vi har optimeret til det rigtige resultat af disse assays. Disse metoder gør det muligt for videnskabsfolk at etablere endokrine forstyrrelser for ethvert EDC eller for en blanding af forskellige Edc'er i Drosophila, selv om at identificere den endokrine mekanisme ansvarlig for effekten, yderligere essays kunne være behov for.

I dette afsnit rapporteres de vigtigste trin i ovennævnte protokoller i form af forenklede ordninger. I betragtning af at fluer har tendens til at undgå ubehagelige forbindelser, den første ting at gøre, er at assay smagen af den valgte EDC. Dette kan gøres ved at blande en fødevare farve (for eksempel, rød mad Dye No. 40)35 med den mad suppleret med den valgte EDC i forskellige doser eller med opløsningsmidlet alene. Fluer fodret på disse medier er undersøgt under en stereo mikroskopi o...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Hormonforstyrrende stoffer (EDC) udgør et alvorligt problem for organismer og for naturlige miljøer. Drosophila melanogaster er en ideel model til at studere EDC effekter in vivo. Her præsenterer vi metoder til at undersøge endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressere EDC effekter på frugtbarhed, frugtbarhed, udviklingsmæssige timing, og levetiden af flue.

Metoder til test endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster er en kraftfuld model til at vurdere in vivo de potentielle giftige og endokrine virkninger af kemikalier, såsom hormonforstyrrende stoffer, der udgør et alvorligt problem for menneskers sundhed og naturlige miljøer. Håndtering af effekten af EDC'er på de hormonelle livstræk af fluen, såsom frugtbarhed, frugtbarhed, udviklingstid, og levetiden. Det er en nem, billig og hurtig måde at undersøge hormonforstyrrende forstyrrelser in vivo.Frugtbarhed, udvikling og levetid i Drosophila kan påvirkes af flere faktorer, der skal kontrolleres omhyggeligt for at sikre et vellykket resultat af denne protokol. Derfor kræves der størst mulig opmærksomhed i opdræt og håndtering af fluer. At analysere smagen af den valgte EDC, efter bedøvelse, overføre 15 unge fluer fra flueseng til fire parallelle hætteglas, der indeholder majsmel blandet med en fødevare farve.Kontrolhætteglasset indeholder opløsningsmidlet alene, og de tre andre hætteglas suppleres med forskellige doser af de valgte EDC'er. Hold hætteglassene i en befugtet inkubator i en dag med et naturligt 12-timers lys. Efter bedøvelse af fluerne igen, overføre de immobiliserede fluer til et hvidt papir, og placere den under et stereomikroskop til at observere.Sammenlign den abdominale farve af hver behandlingsgruppe med hensyn til kontrolgruppen. For at analysere fluers reproduktionsevne tilberedes tre hætteglas med fluer for hver EDC som forældrehætteglas med otte hunner og fire hanner i 10 milliliter majsmel suppleret med EE2. Til kontrol forberedes seks hætteglas fluer, hver med otte hunner og fire hanner i 10 milliliter majsmelsføde suppleret med EE2 opløsningsmiddel.Bageste flyver i en kuvøse ved 25 grader Celsius. Under deres udvikling, undgå overbelægning af larver. Efter fire dage, invertere hvert hætteglas over en etherizer at fjerne forældrene og returnere hætteglassene til rugemaskinen i fem dage mere.I den sene eftermiddag på dag ni, invertere hvert hætteglas over et æterisk at fjerne alle nyligt fremståede fluer fra hætteglassene og sætte hætteglas i en anden kuvøse på 18 grader Celsius natten over. Om morgenen på dag 10, på en Drosophila kuldioxid arbejdsstation, omhyggeligt vende kultur hætteglasset for at forhindre bedøvet fluer falder på medium og indsætte en gummirør med en nål i hætteglasset mellem bomuld prop og hætteglasvæggen. Åbn ventilen for at levere kuldioxid.I løbet af få sekunder, overføre fluerne til en flue seng under et mikroskop. Saml jomfru hunner og unge mænd separat i to grupper på fluesengen. Tilfældigt underinddelte hver gruppe fluer i små undergrupper, med 10 hunner eller 20 hanner pr hætteglas fyldt med friske tilsvarende majsmel.Fortsæt inkubation og indsamle 30 jomfru hunner og 30 hanner for hver EDC, og 90 jomfru hunner og 90 hanner til kontrol. House disse grupper af fluer på 25 grader Celsius, indtil de er i alderen fire dage efter eclosion. Derefter overføres dem til nye hætteglas, der indeholder frisk tilsvarende medium hver anden dag.Kontroller, at der ikke er larver i hætteglassene hos hunnerne. Derefter mærkes hætteglas med en anden serie af sekventielle numre til følgende behandling. Efter bedøvelse overføres en EE2 opløsningsmiddelbehandlet hun til et lille hætteglas med frisk majsmel tomatmedium uden EE2, og der tilsættes en EE2 opløsningsmiddelbehandlet han til kontrol på tværs.Par en EE2-behandlet han med EE2 opløsningsmiddelbehandlet hun eller EE2-behandlet hun med EE2 opløsningsmiddelbehandlet han for hver behandling. Hus 20 enkelt krydser ved 25 grader Celsius. Overfør hvert parringspar til friske majsmelsglas uden EDC hver dag i de efterfølgende 10 dage.Synd hvert hætteglas visuelt hver dag for æggene og rapporter deres nummer på fertilitetsregnearket. I hvert hætteglas skal du kontrollere de nyopkomne fluer nøje og registrere det daglige antal voksne afkom i løbet af 10-dages perioden. Efter 10 dage fra den første parring, fjerne forældrene fra den sidste serie af hætteglas.I eclosion assay protokoller, første, for hver behandling gruppe, oprette 10 hætteglas af unge, sunde fluer mindre end to dage gammel, hver med seks hunner og tre hanner i 10 milliliter majsmel mad uden EDC. Bag fluerne på mad i 24 timer og give dem mulighed for at parre sig. Derefter forberedes yderligere 10 parallelle hætteglas pr. behandlingsgruppe med 10 milliliter hver af friske majsmelsføder suppleret med forskellige EDC-koncentrationer eller EE2-opløsningsmidlet alene til kontrollen.Overfør de parrede fluer til disse nye hætteglas. Lav et udviklingsregneark for at optage de forskellige serier. Lad fluerne lægge æg i 16 timer.Fjern derefter forældrene fra hætteglassene. Inkuber hætteglassene ved 25 grader Celsius i tre til fire dage, eller indtil omvandrende larver er synlige. Hver dag tælles antallet af nye pupper i hvert hætteglas ved at skrive et nummer i rækkefølge af hver pupper på ydersiden af hætteglasset for at undgå at tælle den samme pupper to gange.Rapportér antallet af nyopkomne pupper i tre til fire dage, eller indtil der ikke dannes mere pupperform. Fra dag ni tælle antallet af nye voksne dagligt, indtil der ikke flere voksne opstår. Rapporter det om udviklingsregnearket og udfør resten af eclosion-analysen i henhold til manuskriptet.I levetidsprotokollen, der først blev oprettet 20 hætteglas med otte hunner og fire hanner, hver fyldt med 10 milliliter majsmel mad og hus dem på 25 grader Celsius. Efter fire dage kasseres fluerne, og hætteglassene sættes tilbage i rugemaskinen. Sidst på eftermiddagen på dag ni fjernes alle nyopstod fluer fra hætteglassene, og hætteglassene returneres til kuvøset.Efter 16 til 24 timer opdeles 250 endagsgamle voksne fluer af begge køn i fire grupper under let kuldioxidbedøvelse og overføre dem til 250 milliliterflasker indeholdende voksen medium mad, tre suppleret med forskellige EDC-koncentrationer og en med EE2-opløsningsmidlet alene. Vedligehold fluerne ved 25 grader Celsius i to til tre dage for at give dem mulighed for at parre sig. Derefter sortere hver kohorte af fluer efter køn i to grupper.Inden for hver behandlingstilstand, for begge køn, tilfældigt underinddele hver gruppe i fem parallelle hætteglas med en tæthed på 20 personer pr hætteglas. Forbered et levetidsregneark, hvor antallet af døde fluer trækkes fra antallet af overlevende fluer fra den tidligere overførsel, således at antallet af overlevende ved hver overførsel automatisk opnås. Efter tre dage overføres fluerne uden anæstesi til nye hætteglas med den tilsvarende fødevare på samme tid, og der kontrolleres, om der er død.Optag fluens alder og antallet af døde fluer. Gentag overførslen hver tredje dag, indtil alle fluerne dør. I dette eksperiment blev levetidskurver afbildet som det kumulative overlevelsesskib i forhold til de forløbne dage for hver EDC-koncentration og kontrol.For kontrol, efter en lang indledende periode, hvor overlevelseskurven forblev relativt høj, faldt den eksponentielt efter ca. 60 dage. Efter EDC-eksponering blev overlevelseskurven for de behandlede fluer påvirket betydeligt og viste et dramatisk fald efter 36 dage. Det er rådgivet om, at de parallelle hætteglas under analyse bør være meget ens, ellers vil det være vanskeligt at forstå, hvilke at skille sig af med.Derfor foreslår vi at tage stor omhu, vedtage en god eksperimentel praksis, ved hjælp af en stor stikprøvestørrelse. Efter disse protokoller er det også muligt at vurdere den transgenerationelle virkning af et udvalgt hormonforstyrrende stoffer samt at teste de potentielle additivvirkninger af en kombination af forskellige hormonforstyrrende stoffer.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Analyse blodlegemer befolkninger i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Opdræt bananfluen<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Under Axeniske og gnotobiotiske Betingelser

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Metoder til at undersøge lymfeknuder kirtel og hæmocytter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protokoller til visualisering steroidogeniske organer og deres interaktive organer med Immunfarvning i bananfluen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Assay for blod-hjerne barriere integritet i Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Hele Animal Imaging af Drosophila melanogaster ved hjælp af microcomputed tomografi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Billeddannelse af levende hjerneeksplantationer fra Drosophila melanogaster tredje stjernelarver

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Forfatter Spotlight: Undersøgelse af asymmetrisk celledelingsdynamik: En protokol til live-billeddannelse af Drosophila-larvehjerneeksplanter 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Live-celle billeddannelse af Drosophila melanogaster tredje stjerne larvehjerner

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...