Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

De auteurs bedanken Orsolina Petillo voor technische ondersteuning. De auteurs danken Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) voor bibliografische ondersteuning. De auteurs bedanken Dr Gustavo Damiano Mita voor de invoering ervan aan de EDC wereld. De auteurs danken Leica Microsystems en Pasquale Romano voor hun hulp. Dit onderzoek werd ondersteund door project PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie oriënteren alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Project PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

1. voedselbereiding
<ol><li>
Voor voorraad onderhoud en voor larvale groei, gebruik maken van een flappen medium met 3% poeder gist, 10% sacharose, 9% voorgekookt flappen, 0,4% agar, daarna genoemd flappen medium (CM).
	<ol>
<li>Zet 30 g gist in 100 mL van leidingwater, breng het aan de kook en laat het koken voor 15 minuten.</li>
		<li>Afzonderlijk, meng goed 90 g van voorgekookte flappen, 100 g suiker, en 4 g agar in 900 mL van leidingwater.</li>
		<li>Breng de oplossing aan de kook, lager het vuur e...

De fruitvlieg D. melanogaster is op grote schaal gebruikt als een in vivo modelsysteem om de mogelijke effecten van milieu EDC'S zoals DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31te onderzoeken, 32, DEHP33, en EE234. Verschillende redenen hebben geleid tot het gebruik ervan als een model op dit gebied van onderzoek. Naast zijn onbetwiste ...

Menselijke activiteiten zijn het vrijgeven van in het milieu een enorme hoeveelheid chemicaliën, die een ernstig probleem voor organismen en voor natuurlijke ecosystemen vertegenwoordigen1. Van deze verontreinigende stoffen wordt geschat dat ongeveer 1.000 verschillende chemicaliën het normale evenwicht van endocriene systemen kunnen veranderen; Volgens deze eigenschap, worden zij geclassificeerd als endocriene verstorende chemische producten (Edc's). Specifiek, op basis van een recente definitie van de endocriene samenleving, de Edc's zijn "een exogene chemische stof, of een mengsel van chemicaliën, die kunnen interfereren met elk aspect van hormoon actie"2. In de afgelopen drie decennia zijn er steeds meer wetenschappelijke aanwijzingen dat edc's de voortplanting en ontwikkeling van dieren en planten3,4,5,6,7, 8. Verder, EDC blootstelling is gerelateerd aan de toenemende prevalentie van sommige ziekten van de mens, met inbegrip van kanker, obesitas, diabetes, schildklier ziekten, en gedragsstoornissen9,10,11.
Algemene mechanismen van EDC
Door hun moleculaire eigenschappen, edc's gedragen zich als hormonen of hormoon precursoren3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. In deze zin kunnen ze binden aan de receptor van een hormoon en verstoren endocriene systemen, hetzij door het nabootsen van hormoon activiteit of door het blokkeren van endogene hormonen bindend. In het eerste geval, na binding aan de receptor, kunnen ze activeren als zijn natuurlijke hormoon zou doen. In het andere geval, binding van het EDC aan de receptor voorkomt dat de binding van zijn natuurlijke hormoon, zodat de receptor is geblokkeerd en kan niet meer worden geactiveerd, zelfs in de aanwezigheid van zijn natuurlijke hormoon3. Als gevolg daarvan kan Edc's invloed hebben op verschillende processen, zoals de synthese, secretie, transport, metabolisme, of perifere werking van endogene hormonen die verantwoordelijk zijn voor het onderhoud van de homeostase, voortplanting, ontwikkeling, en/of gedrag van het organisme. Receptor binding is niet de enige manier van handelen tot nu toe beschreven voor de Edc's. Het is nu duidelijk dat zij ook kunnen handelen door het aanwerven van coactivatoren of corepressors in enzymatische wegen of door het wijzigen van epigenetische markers die gen-uitdrukking10,11,12,13 dereguleren ,14, met gevolgen niet alleen voor de huidige generatie maar ook voor de gezondheid van generaties om8te komen.
Fruitvliegje hormonen
De potentiële effecten van geselecteerde Edc's zijn op grote schaal bestudeerd, zowel in wilde dierensoorten als in verschillende modelsystemen waarin endocriene mechanismen redelijk bekend zijn. Voor ongewervelden, endocriene systemen die de groei, ontwikkeling en voortplanting beïnvloeden zijn uitvoerig gekenmerkt bij insecten om verschillende redenen, waarbij hun uitgebreide gebruik op het gebied van biologisch onderzoek, hun economisch belang, en Ten slotte is de ontwikkeling van insecticiden in staat om zich specifiek te bemoeien met het hormoon systeem van plagen insecten.
In het bijzonder, onder insecten, heeft de fruitvlieg D. melanogaster bewezen een zeer krachtig modelsysteem te zijn om de potentiële endocriene gevolgen van edc's te evalueren. In D. melanogaster, evenals in gewervelde dieren, hormonen spelen een belangrijke rol gedurende de hele levenscyclus. In dit organisme, zijn er drie belangrijke hormonale systemen, die de steroïde hormoon 20-hydroxyecdyson (20e)15,16, de sesquiterpenoid jeugd hormoon (JH)17te betrekken, en de peptiden en peptide/eiwit hormonen18. Deze derde groep bestaat uit verschillende peptiden ontdekt meer recentelijk, maar duidelijk betrokken bij een grote verscheidenheid van fysiologische en gedragsmatige processen, zoals levensduur, homeostase, metabolisme, voortplanting, geheugen, en bewegingscontrole. 20E is homoloog aan cholesterol-afgeleide steroïde hormonen zoals estradiol, terwijl JH sommige gelijkenissen met retinol zuur deelt; beiden zijn de beter bekende hormonen in fruitvliegje19,20. Hun evenwicht is van vitaal belang bij de coördinatie van molting en metamorfose, evenals bij het beheersen van verschillende postdevelopmental processen, zoals voortplanting, levensduur, en gedrag21, waardoor het aanbieden van verschillende mogelijkheden voor het testen van endocriene verstoring in fruitvliegje. Verder, ecdysteroid hormonen en JHs zijn de belangrijkste doelstellingen van de zogenaamde derde generatie insecticiden, ontwikkeld om zich te bemoeien met ontwikkelings-en reproductieve endocriene-gemedieerde processen in insecten. De agonist of antagonist werking van deze chemicaliën is bekend, en dus kunnen ze dienen als referentienormen voor de evaluatie van de effecten van potentiële Edc's op de groei, voortplanting en ontwikkeling van insecten22. Bijvoorbeeld, Methopreen, die op grote schaal is gebruikt bij de bestrijding van muggen en andere aquatische insecten23,24, werkt als een JH-agonist en onderdrukt 20e-geïnduceerde gen transcriptie en metamorfose.
In aanvulling op hormonen, de nucleaire receptor (NR) Superfamily in fruitvliegje is ook goed bekend; het bestaat uit 18 evolutionair behouden transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de bestrijding van hormonale-afhankelijke ontwikkelingstrajecten, evenals de voortplanting en fysiologie25. Deze hormoon NRs behoren tot alle zes NR superfamilie subtypen, met inbegrip van die betrokken bij neurotransmissie26, twee voor retinoic zuur NRs, en die voor steroïde NRs die, in gewervelde dieren, één van de primaire doelstellingen van edc's27vertegenwoordigen.
Fruitvliegje als modelsysteem voor het bestuderen van Edc's
Op dit moment, op basis van moleculaire eigenschappen, zijn verschillende milieu-agentschappen over de hele wereld toe te schrijven het potentieel om te interfereren met de endocriene systemen om verschillende kunststof-en-klare chemicaliën. Aangezien de Edc's een mondiaal en alomtegenwoordig probleem zijn voor het milieu en voor organismen, is het algemene doel van het onderzoek op dit gebied het verminderen van hun ziektelast en het beschermen van levende organismen tegen hun schadelijke effecten. Om het inzicht in de mogelijke endocriene effecten van een chemische stof te verdiepen, is het noodzakelijk om het in vivo te testen. Hiertoe vertegenwoordigt D. melanogaster een geldig modelsysteem. Tot op heden, is de fruitvlieg uitgebreid gebruikt zoals in vivo model om de gevolgen van verscheidene milieu Edc's te evalueren; Er is gemeld dat de blootstelling aan verschillende Edc's, zoals dibutylftalaat ftalaten (DBP)28, Bisfenol a (BPA), 4-nonylfenol (4-NP), 4-tert-octylfenol (4-tert-op)29, Methylparaben (MP)30, Ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-ethylhexyl) FTALATEN (DEHP)33, en 17-α-ethinylestradiol (EE2)34, invloeden metabolisme en endocriene functies zoals in gewervelde modellen. Verschillende redenen hebben geleid tot het gebruik ervan als een model op dit gebied van onderzoek. Naast een uitstekende kennis van de endocriene systemen, verdere voordelen zijn de korte levenscyclus, lage kosten, gemakkelijk manipuleerbaar genoom, een lange geschiedenis van het onderzoek, en diverse technische mogelijkheden (Zie de FlyBase website, http://flybase.org/). D. melanogaster biedt ook een krachtig model voor het gemakkelijk bestuderen van transgenerationele effecten en bevolkings reacties op omgevingsfactoren8 en vermijdt ethische kwesties die relevant zijn voor in vivo studies bij hogere dieren. Daarnaast is de fruitvlieg aandelen een hoge mate van het behoud van het gen met mensen die het mogelijk maken voor vlieg fruit EDC assays te helpen bij het voorspellen of suggereren potentiële effecten van deze chemicaliën voor de menselijke gezondheid. Naast het vergroten van het begrip over de gevolgen voor de gezondheid van de mens kan fruitvliegje bijdragen aan de beoordeling van Risico's van EDC-blootstelling aan het milieu, zoals verlies van biodiversiteit en milieudegradatie. Ten slotte, de fruitvlieg biedt het extra voordeel dat wordt gebruikt in laboratoria, waar de factoren die mogelijk van invloed zijn ontwikkeling, voortplanting, en levensduur kan worden gehouden onder controle om elke variatie aan de te testen stof toeschrijven.
Met dit in gedachten, hebben we geoptimaliseerd eenvoudige en robuuste fitness-analyses voor het bepalen van EDC-effecten op sommige fruitvliegje hormonale eigenschappen, zoals Fecundity/vruchtbaarheid, ontwikkelingsstoornissen timing, en volwassen levensduur. Deze tests zijn op grote schaal gebruikt voor een aantal edc's23,24,25,26,27. In het bijzonder hebben we gebruik gemaakt van de volgende protocollen om de effecten van de blootstelling aan de synthetische oestrogeen EE234 en BPA en bisfenol af (BPA F) (ongepubliceerde gegevens) te evalueren. Deze protocollen kunnen gemakkelijk worden gewijzigd om de effecten van een bepaald EDC te onderzoeken op een moment, evenals de gecombineerde effecten van meerdere Edc's in D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

In de afgelopen jaren is er steeds meer bewijs dat alle organismen en het milieu worden blootgesteld aan hormoon-achtige chemicaliën, bekend als endocriene verstorende chemicaliën (Edc's). Deze chemische stoffen kunnen veranderen de normale balans van endocriene systemen en leiden tot negatieve effecten, evenals een toenemend aantal hormonale stoornissen in de menselijke populatie of verstoorde groei en verminderde voortplanting in de wild levende dieren. Voor sommige Edc's, zijn er gedocumenteerd gezondheidseffecten en beperkingen op het gebruik ervan. Nochtans, voor de meesten van hen, is er nog geen wetenschappelijk bewijsmateriaal in deze betekenis. Om de mogelijke endocriene effecten van een chemische stof in het volledige organisme te verifiëren, moeten we deze testen in geschikte modelsystemen, evenals in de fruitvlieg, melanogaster. Hier rapporteren wij gedetailleerde in vivo protocollen om endocriene verstoring in fruitvliegje te bestuderen, dat EDC gevolgen voor de Fecundity/de vruchtbaarheid, ontwikkelings timing, en levensduur van de vlieg aanpakt. In de afgelopen jaren, gebruikten we deze vlieg fruit levens trekken om de effecten van blootstelling aan 17-α-ethinylestradiol (EE2), Bisfenol A (BPA), en bisfenol AF (BPA F) te onderzoeken. In totaal behandelden deze analyses alle stadia van het fruitvliegje en maakten ze het mogelijk om de endocriene ontwrichting in alle hormoon gemedieerde processen te evalueren. Fecundity/vruchtbaarheid en ontwikkeling timing assays waren nuttig om de EDC impact op de Fly reproductieve prestaties en ontwikkelingsstadia te meten, respectievelijk. Ten slotte, de levensduur assay betrokken chronische EDC blootstelling aan volwassenen en gemeten hun overlevingspensioen. Deze levens eigenschappen kunnen echter ook worden beïnvloed door verschillende experimentele factoren die zorgvuldig gecontroleerd moesten worden. Dus, in dit werk, raden we een reeks van procedures die we hebben geoptimaliseerd voor de juiste uitkomst van deze tests. Deze methoden kunnen wetenschappers vast te stellen endocriene ontwrichting voor een EDC of voor een mengsel van verschillende Edc's in fruitvliegje, hoewel het endocriene mechanisme verantwoordelijk voor het effect te identificeren, verdere essays nodig zou kunnen zijn.

In deze sectie worden de belangrijkste stappen van de bovenstaande protocollen gerapporteerd in de vorm van vereenvoudigde regelingen. Gezien het dat vliegen de neiging om onsmakelijke verbindingen te vermijden, het eerste ding om te doen is om de smaak van de geselecteerde EDC assay. Dit kan worden gedaan door het mengen van een levensmiddel kleuren (bijvoorbeeld rood voedsel kleurstof No. 40)35 met het voedsel aangevuld met de geselecteerde EDC bij verschillende doses of met het oplosmiddel alle...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocriene verstorende chemicaliën (Edc's) vormen een ernstig probleem voor organismen en voor natuurlijke omgevingen. Fruit vliegje melanogaster is een ideaal model om EDC-effecten in vivo te bestuderen. Hier presenteren we methoden om endocriene verstoring in fruitvliegje te onderzoeken, het aanpakken van EDC effecten op Fecundity, vruchtbaarheid, ontwikkelingsstoornissen timing, en de levensduur van de vliegen.

Methoden voor het testen van endocriene verstoring in fruitvliegje melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster is een krachtig model om in vivo de potentiële toxische en endocriene effecten van chemische stoffen, zoals hormoonontregelaars, die een ernstig probleem vormen voor de menselijke gezondheid en natuurlijke omgevingen te evalueren. Het aanpakken van het effect van EDC's op de hormonale levenseigenschappen van de vlieg, zoals vruchtbaarheid, vruchtbaarheid, ontwikkelingstijd en de levensduur. Het is een eenvoudige, goedkope en snelle manier om hormoonontregeling in vivo te onderzoeken.De vruchtbaarheid, ontwikkeling, en levensduur in Drosophila kan worden beïnvloed door verschillende factoren die zorgvuldig moeten worden gecontroleerd om de succesvolle uitkomst van dit protocol te waarborgen. Daarom is maximale aandacht bij het grootbrengen en hanteren van vliegen vereist. Om de smaak van de geselecteerde EDC te testen, breng je na verdoving 15 jonge vliegen van het vliegbed naar vier parallelle flesjes met maïsmeelmedium gemengd met een kleurstof.De controle flacon bevat het oplosmiddel alleen, en de drie andere flesjes worden aangevuld met verschillende doses van de geselecteerde EDCs. Bewaar de flesjes in een bevochtigde couveuse voor één dag met een natuurlijk licht van 12 uur. Na het verdoven van de vliegen weer, breng de geïmmobiliseerde vliegen naar een wit papier, en plaats het onder een stereo microscoop te observeren.Vergelijk de buikkleuring van elke behandelingsgroep met betrekking tot de controlegroep. Om de reproductieve prestaties van de vliegen te testen, bereid drie flacons van vliegen voor elke EDC als ouderfolie, met acht wijfjes en vier mannetjes in 10 milliliter van maïsmeelmedium aangevuld met EE2. Voor de controle, bereiden zes flesjes van vliegen, elk met acht vrouwtjes en vier mannetjes in 10 milliliter maïsmeel medium voedsel aangevuld met EE2 oplosmiddel.Achtervliegen in een couveuse bij 25 graden Celsius. Tijdens hun ontwikkeling, vermijd overbevolking van de larven. Na vier dagen, omkeren elke flesje over een etherizer om de ouders te verwijderen en de flesjes terug te keren naar de couveuse voor vijf dagen.In de late namiddag van dag negen, omkeren elke flacon over een etherizer om alle nieuw opgedoken vliegen te verwijderen uit de flesjes en zet de flesjes in een andere incubator op 18 graden Celsius 's nachts. Op de ochtend van dag 10, op een Drosophila kooldioxide werkstation, voorzichtig omkeren van de cultuur flacon om te voorkomen dat verdoofde vliegen vallen op medium en steek een rubberen buis met een naald in de flacon tussen de katoenen stop en de flacon wand. Open de klep om kooldioxide te leveren.Binnen enkele seconden, breng de vliegen naar een vliegenbed onder een microscoop. Verzamel maagdelijke vrouwtjes en jonge mannetjes afzonderlijk in twee groepen op het vliegbed. Verdeel willekeurig elke groep vliegen in kleine subgroepen, met 10 vrouwtjes of 20 mannetjes per flesje gevuld met verse overeenkomstige maïsmeelmedium.Doorgaan met incubatie en verzamelen 30 maagdelijke vrouwtjes en 30 mannetjes voor elke EDC, en 90 maagdelijke vrouwtjes en 90 mannetjes voor de controle. Huis deze groepen vliegen op 25 graden Celsius tot ze vier dagen na de sluiting zijn. Breng ze vervolgens om de twee dagen over in nieuwe flesjes met vers bijbehorend medium.Controleer of er geen larven in de flesjes van vrouwtjes zitten. Label dan flesjes met een andere reeks opeenvolgende getallen voor de volgende behandeling. Breng na verdovende houding één met EE2 oplosmiddel behandeld vrouwtje over in een klein flesje met vers maïsmeeltomaatmedium zonder EE2 en voeg één met EE2 oplosmiddelen behandeld mannetje toe voor de controle over.Koppel een met EE2 behandelde man met met EE2 oplosmiddel behandelde vrouw of met EE2 behandelde vrouw voor elke behandeling met een met EE2 behandeld mannetje. Huis 20 enkele kruisen bij 25 graden Celsius. Breng elk paar paar aan verse maïsmeel tomaat medium flacons zonder EDC elke dag voor de daaropvolgende 10 dagen.Visueel inspecteren elke flacon elke dag voor de eieren en melden hun nummer op de vruchtbaarheid spreadsheet. Controleer in elke flacon goed op nieuw opgedoken vliegen en notiek het dagelijkse aantal volwassen nakomelingen over de periode van 10 dagen. Na 10 dagen na de eerste paring, verwijder de ouders uit de laatste reeks flesjes.In eclosion test protocollen, ten eerste, voor elke behandeling groep, het opzetten van 10 flesjes van jonge, gezonde vliegen minder dan twee dagen oud, elk met zes vrouwtjes en drie mannetjes in 10 milliliter maïsmeel voedsel zonder EDC. Achter de vliegen op voedsel voor 24 uur en laat ze om te paren. Bereid vervolgens nog eens 10 parallelle flacons per behandelingsgroep met 10 milliliter elk van verse maïsmeel voedingsmiddelen aangevuld met verschillende EDC concentraties of de EE2 oplosmiddel alleen voor de controle.Breng de gedekte vliegen naar deze nieuwe flesjes. Maak een ontwikkelingsspreadsheet om de verschillende series op te nemen. Laat de vliegen 16 uur eieren leggen.Verwijder vervolgens de ouders uit de flesjes. Broed de flesjes drie tot vier dagen op 25 graden Celsius, of totdat zwervende larven zichtbaar zijn. Tel elke dag het aantal nieuwe poppen in elke flacon door een nummer in volgorde te schrijven door elke pop aan de buitenkant van de flacon om te voorkomen dat ze twee keer dezelfde pop tellen.Meld het aantal pas opgedoken poppen gedurende drie tot vier dagen, of tot er geen poppenvorm meer is. Vanaf dag negen, tellen het aantal opkomende volwassenen dagelijks, totdat er niet meer volwassenen ontstaan. Meld het op de ontwikkelingsspreadsheet en voer de rest van de eclosion-test uit volgens het manuscript.In het levensduurprotocol, eerst opgezet 20 flesjes met acht vrouwtjes en vier mannetjes, elk gevuld met 10 milliliter maïsmeel voedsel en huis ze op 25 graden Celsius. Gooi na vier dagen de vliegen weg en plaats de flesjes terug in de couveuse. In de late namiddag van dag negen, verwijder alle nieuw opgedoken vliegen uit de flesjes en breng de flesjes terug naar de couveuse.Verdeel na 16 tot 24 uur 250 eendags-oude volwassen vliegen van beide geslachten in vier groepen onder lichte koolstofdioxideverdovending en breng ze over op flessen van 250 milliliter met volwassen medium voeding, drie aangevuld met verschillende EDC-concentraties en één met het EE2-oplosmiddel alleen. Houd de vliegen op 25 graden Celsius voor twee tot drie dagen om hen te laten paren. Sorteer vervolgens elk cohort vliegen op geslacht in twee groepen.Binnen elke behandelingsvoorwaarde, voor beide geslachten, verdeelt elke groep willekeurig in vijf parallelle flesjes bij een dichtheid van 20 individuen per flacon. Maak een spreadsheet over de levensduur waarin het aantal dode vliegen wordt afgetrokken van het aantal overlevende vliegen van de vorige overdracht, zodat het aantal overlevenden bij elke overdracht automatisch wordt verkregen. Breng de vliegen na drie dagen zonder verdoving over naar nieuwe flesjes met het bijbehorende voedsel op hetzelfde moment en controleer op overlijden.Nota van de leeftijd van de vliegen en het aantal dode vliegen. Herhaal de overdracht om de drie dagen tot alle vliegen sterven. In dit experiment werden levensduurcurven uitgezet als het cumulatieve overlevingsleven ten opzichte van de verstreken dagen voor elke EDC-concentratie en de controle.Voor de controle, na een lange initiële periode waarin de survivorship curve relatief hoog bleef, daalde het exponentieel na ongeveer 60 dagen. Na EDC blootstelling, het overlevingsschip curve van de behandelde vliegen werd aanzienlijk beïnvloed en toonde dramatische daling na 36 dagen. Het is geadviseerd over dat de parallelle flesjes in analyse moet zeer vergelijkbaar zijn, anders zal het moeilijk zijn om te begrijpen welke te verwijderen.Daarom raden we aan om goed op te zien, een goede experimentele praktijk aan te nemen, met behulp van een grote steekproefgrootte. Volgens deze protocollen is het ook mogelijk om de transgenerationele impact van een geselecteerde hormoonontregelaar te evalueren en de mogelijke additieve effecten van een combinatie van verschillende hormoonontregelaars te testen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Testen Bloedcel Populaties van de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Het grootbrengen de fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Onder Axenische en gnotobiotische voorwaarden

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methoden om Onderzoek de lymfeklier en Hemocytes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocollen voor het visualiseren steroidogenic organen en hun Interactive Organen met Immunokleuring in de fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methoden voor Imaging intracellulaire pH van de follikel stamcel overdrachtslijn in Live Drosophila eierstokweefsel

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Ontdooien, kweken en Cryopreserving van Drosophila cellijnen

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging van Drosophila melanogaster met behulp van Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

Live-Cell Imaging van Drosophila melanogaster Derde Instar Larvale Hersenen

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...