Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
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Les auteurs remercient Orsolina Petillo pour son soutien technique. Les auteurs remercient le Dr Mariarosaria Aletta (CNR) pour son soutien bibliographique. Les auteurs remercient le Dr Gustavo Damiano Mita de les avoir introduits dans le monde d'EDC. Les auteurs remercient Leica Microsystems et Pasquale Romano pour leur aide. Cette recherche a été appuyée par le projet PON03PE-00110-1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projet PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

1. Préparation des aliments
<ol><li>
Pour l'entretien des stocks et pour la croissance larvaire, utilisez un milieu de semoule de maïs contenant 3 % de levure en poudre, 10 % de saccharose, 9 % de semoule de maïs précuite, 0,4 % d'agar, par la suite appelé maïs moyen (CM).
	<ol>
<li>Mettre 30 g de levure dans 100 ml d'eau du robinet, porter à ébullition et laisser bouillir pendant 15 min.</li>
		<li>Séparément, bien mélanger 90 g de semoule de maïs précuite, 100 g de sucre et 4 g d'agar da...

La mouche des fruits D. melanogaster a été largement utilisé comme un système de modèle in vivo pour étudier les effets potentiels des EDC environnementales telles que DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33, et EE234. Plusieurs raisons ont conduit son utilisation comme modèle dans ce domaine de recherche. Outre se...

Les activités humaines ont libéré dans l'environnement une quantité massive de produits chimiques, qui représentent un grave problème pour les organismes et pour les écosystèmes naturels1. Parmi ces polluants, on estime qu'environ 1 000 produits chimiques différents peuvent modifier l'équilibre normal des systèmes endocriniens; selon cette propriété, ils sont classés comme produits chimiques perturbateurs endocriniens (EDC). Plus précisément, sur la base d'une définition récente de la Société endocrinienne, les EDC sont « un produit chimique exogène, ou mélange de produits chimiques, qui peut interférer avec n'importe quel aspect de l'action hormonale »2. Au cours des trois dernières décennies, il y a eu de plus en plus de preuves scientifiques que les EDC peuvent affecter la reproduction et le développement des animaux et des plantes3,4,5,6,7, 8. En outre, l'exposition à EDC a été liée à la prévalence croissante de certaines maladies humaines, y compris le cancer, l'obésité, le diabète, les maladies thyroïdiennes, et les troubles du comportement9,10,11.
Mécanismes généraux d'EDC
En raison de leurs propriétés moléculaires, les EDC se comportent comme des hormones ou des précurseurs d'hormones3,5,6,7,8,9, 10,11,12. En ce sens, ils peuvent se lier au récepteur d'une hormone et perturber les systèmes endocriniens soit en imitant l'activité hormonale ou en bloquant les hormones endogènes liant. Dans le premier cas, après la liaison au récepteur, ils peuvent l'activer comme son hormone naturelle ferait. Dans l'autre cas, la liaison de l'EDC au récepteur empêche la liaison de son hormone naturelle, de sorte que le récepteur est bloqué et ne peut plus être activé, même en présence de son hormone naturelle3. En conséquence, les EDC peuvent affecter plusieurs processus, tels que la synthèse, la sécrétion, le transport, le métabolisme, ou l'action périphérique des hormones endogènes qui sont responsables du maintien de l'homéostasie, de la reproduction, du développement, et/ou du comportement de l'organisme. La liaison des récepteurs n'est pas le seul moyen d'action décrit jusqu'à présent pour les CED. Il est maintenant clair qu'ils peuvent également agir en recrutant des coactivateurs ou des corepresseurs dans des voies enzymatiques ou en modifiant des marqueurs épigénétiques déréglementant l'expression génique10,11,12,13 ,14, avec des conséquences non seulement pour la génération actuelle, mais aussi pour la santé des générations à venir8.
Hormones drosophiles
Les effets potentiels de certains CED ont été largement étudiés, tant chez les espèces sauvages que dans plusieurs systèmes modèles où les mécanismes endocriniens sont raisonnablement bien connus. Pour les invertébrés, les systèmes endocriniens qui influencent la croissance, le développement et la reproduction ont été largement caractérisés chez les insectes pour plusieurs raisons, impliquant leur utilisation étendue dans le domaine de la recherche biologique, leur importance économique, et enfin le développement d'insecticides capables d'interférer spécifiquement avec le système hormonal des insectes nuisibles.
En particulier, chez les insectes, la mouche des fruits D. melanogaster s'est avérée être un système modèle très puissant pour évaluer les effets endocriniens potentiels des SEE. Dans D. melanogaster, ainsi que chez les vertébrés, les hormones jouent un rôle important tout au long du cycle de vie. Dans cet organisme, il ya trois principaux systèmes hormonaux, qui impliquent l'hormone stéroïde 20-hydroxyecdysone (20E)15,16, l'hormone juvénile sesquiterpenoid (JH)17, et les neuropeptides et peptide / protéines hormones18. Ce troisième groupe se compose de plusieurs peptides découverts plus récemment mais clairement impliqués dans une grande variété de processus physiologiques et comportementaux, tels que la longévité, l'homéostasie, le métabolisme, la reproduction, la mémoire et le contrôle locomoteur. 20E est homologue aux hormones stéroïdes cholestérol-dérivées telles que l'estradiol, alors que JH partage quelques similitudes avec l'acide rétinoïque ; les deux sont les hormones les plus connues dans Drosophila19,20. Leur équilibre est essentiel dans la coordination de la mue et de la métamorphose, ainsi que dans le contrôle de plusieurs processus post-développementaux, tels que la reproduction, la durée de vie et le comportement21, offrant ainsi différentes possibilités pour tester le système endocrinien perturbation dans Drosophila. En outre, les hormones ecdysteroid et les JHsont les principales cibles des insecticides dits de troisième génération, développés pour interférer avec les processus développementaux et reproducteurs médiés par le système endocrinien chez les insectes. Le mode d'action agoniste ou antagoniste de ces produits chimiques est bien connu, et donc ils peuvent servir de normes de référence pour évaluer les effets des EDC potentiels sur la croissance, la reproduction et le développement des insectes22. Par exemple, la métahoprène, qui a été largement utilisée dans la lutte contre les moustiques et autres insectes aquatiques23,24, agit comme agoniste JH et réprime la transcription des gènes induite par 20E et la métamorphose.
En plus des hormones, la superfamille des récepteurs nucléaires (NR) dans Drosophila est également bien connue; il se compose de 18 facteurs de transcription évolutivement conservés impliqués dans le contrôle des voies de développement hormonales dépendantes, ainsi que la reproduction et la physiologie25. Ces NR d'hormone appartiennent à chacun des six sous-types de superfamille de NR, y compris ceux impliqués dans la neurotransmission26, deux pour l'acide rétinoïque NRs, et ceux pour les NRs stéroïdes qui, dans les vertébrés, représentent l'une des cibles primaires des EDCs27.
La drosophile comme système modèle d'étude des DEC
Actuellement, sur la base de propriétés moléculaires, plusieurs agences environnementales à travers le monde attribuent le potentiel d'interférer avec les systèmes endocriniens à différents produits chimiques d'origine humaine. Étant donné que les SEE constituent un problème mondial et omniprésent pour l'environnement et les organismes, l'objectif global de la recherche dans ce domaine est de réduire leur fardeau de morbidité et de protéger les organismes vivants contre leurs effets néfastes. Afin d'approfondir la compréhension des effets endocriniens potentiels d'un produit chimique, il est nécessaire de le tester in vivo. À cette fin, D. melanogaster représente un système de modèle valide. À ce jour, la mouche des fruits a été largement utilisée comme modèle in vivo pour évaluer les effets de plusieurs SEE environnementales; il a été signalé que l'exposition à plusieurs EDC, tels que le phtalate de dibutyle (DBP)28, bisphénol A (BPA), 4-nonylphénol (4-NP), 4-tert-octylphénol (4-tert-OP)29, methylparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-éthylhexyl) phtalate (DEHP)33, et 17-ethinylestradiol (EE2)34, influence le métabolisme et les fonctions endocriniennes comme dans les modèles vertébrés. Plusieurs raisons ont conduit à son utilisation comme modèle dans ce domaine de recherche. Au-delà d'une excellente connaissance de ses systèmes endocriniens, d'autres avantages incluent son cycle de vie court, son faible coût, son génome facilement manipulable, une longue histoire de recherche et plusieurs possibilités techniques (voir le site Web flyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster fournit également un modèle puissant pour étudier facilement les effets transgénérationnels et les réponses des populations aux facteurs environnementaux8 et évite les questions éthiques pertinentes pour les études in vivo chez les animaux plus élevés. En outre, la mouche des fruits partage un degré élevé de conservation des gènes avec les humains, ce qui pourrait permettre à Drosophila EDC d'essayer de prédire ou de suggérer les effets potentiels de ces produits chimiques pour la santé humaine. En plus d'élargir la compréhension des effets sur la santé humaine, Drosophila peut aider à évaluer les risques d'exposition d'EDC à l'environnement, tels que la perte de biodiversité et la dégradation de l'environnement. Enfin, la mouche des fruits offre l'avantage supplémentaire d'être utilisée dans les laboratoires, où les facteurs susceptibles d'affecter son développement, sa reproduction et sa durée de vie peuvent être maîtrisés afin d'attribuer toute variation à la substance à tester.
Dans cet esprit, nous avons optimisé des tests de condition physique simples et robustes pour déterminer les effets d'EDC sur certains traits hormonaux Drosophila, tels que la fécondité/fertilité, le moment du développement et la durée de vie adulte. Ces essais ont été largement utilisés pour certains EDCs23,24,25,26,27. En particulier, nous avons utilisé les protocoles suivants pour évaluer les effets de l'exposition à l'oestrogène synthétique EE234 et au BPA et au bisphénol AF (BPA F) (données non publiées). Ces protocoles peuvent être facilement modifiés pour étudier les effets d'un EDC donné à la fois, ainsi que les effets combinés de plusieurs EDC dans D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

Ces dernières années, il y a eu de plus en plus de preuves que tous les organismes et l'environnement sont exposés à des produits chimiques hormonaux, connus sous le nom de produits chimiques perturbateurs endocriniens (CED). Ces produits chimiques peuvent modifier l'équilibre normal des systèmes endocriniens et entraîner des effets néfastes, ainsi qu'un nombre croissant de troubles hormonaux dans la population humaine ou une croissance perturbée et une reproduction réduite chez les espèces sauvages. Pour certains EDC, il y a des effets documentés sur la santé et des restrictions sur leur utilisation. Cependant, pour la plupart d'entre eux, il n'y a toujours aucune preuve scientifique en ce sens. Afin de vérifier les effets endocriniens potentiels d'un produit chimique dans l'organisme entier, nous devons le tester dans les systèmes modèles appropriés, ainsi que dans la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Ici nous rapportons les protocoles in vivo détaillés pour étudier la perturbation endocrinienne dans Drosophila, traitant des effets d'EDC sur la fécondité/fertilité, le moment développemental, et la durée de vie de la mouche. Au cours des dernières années, nous avons utilisé ces traits de vie Drosophila pour étudier les effets de l'exposition à 17-ethinylestradiol (EE2), bisphénol A (BPA), et bisphénol AF (BPA F). Au total, ces essais couvraient toutes les étapes de la vie de Drosophila et permetaient d'évaluer la perturbation endocrinienne dans tous les processus à médiation hormonale. Les tests de fécondité/fertilité et de synchronisation du développement ont été utiles pour mesurer l'impact d'EDC sur la performance reproductrice de la mouche et sur les stades de développement, respectivement. Enfin, l'exemple de durée de vie impliquait une exposition chronique d'EDC aux adultes et mesurait leur survie. Cependant, ces traits de vie peuvent également être influencés par plusieurs facteurs expérimentaux qui ont dû être soigneusement contrôlés. Donc, dans ce travail, nous suggérons une série de procédures que nous avons optimisées pour le bon résultat de ces essais. Ces méthodes permettent aux scientifiques d'établir une perturbation endocrinienne pour n'importe quelle EDC ou pour un mélange de différentes EDC dans Drosophila, bien que pour identifier le mécanisme endocrinien responsable de l'effet, d'autres essais pourraient être nécessaires.

Dans cette section, les étapes clés des protocoles ci-dessus sont signalées sous la forme de schémas simplifiés. Étant donné que les mouches ont tendance à éviter les composés désagréables, la première chose à faire est d'essayer le goût de la EDC sélectionnée. Cela peut être fait en mélangeant un colorant alimentaire (par exemple, colorant alimentaire rouge no 40)35 avec l'aliment complété avec l'EDC sélectionné à diverses doses ou avec le solvant seul. Les mouches nourrie...

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Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Les perturbateurs chimiques endocriniens (CED) représentent un grave problème pour les organismes et pour les milieux naturels. Drosophila melanogaster représente un modèle idéal pour étudier les effets d'EDC in vivo. Ici, nous présentons des méthodes pour étudier la perturbation endocrinienne dans Drosophila, traitant des effets d'EDC sur la fécondité, la fertilité, le moment développemental, et la durée de vie de la mouche.

Méthodes pour tester la perturbation endocrinienne dans le mélanogaster drosophila

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster est un modèle puissant pour évaluer in vivo les effets toxiques et endocriniens potentiels des produits chimiques, tels que les perturbateurs endocriniens, qui représentent un grave problème pour la santé humaine et les environnements naturels. S’attaquer à l’effet des CED sur les traits de vie hormonaux de la mouche, tels que la fécondité, la fertilité, le temps de développement et la durée de vie. C’est un moyen facile, bon marché et rapide d’enquêter sur les perturbations endocriniennes in vivo.La fertilité, le développement et la durée de vie dans Drosophila peuvent être affectés par plusieurs facteurs qui doivent être soigneusement contrôlés pour assurer le succès de ce protocole. Par conséquent, une attention maximale dans l’élevage et la manipulation des mouches est nécessaire. Pour goûter au goût de l’EDC sélectionnée, après anesthésie, transférez 15 jeunes mouches du lit de mouche à quatre flacons parallèles contenant du milieu de semoule de maïs mélangé à une coloration alimentaire.Le flacon de commande contient le solvant seul, et les trois autres flacons sont complétés par différentes doses des CED sélectionnés. Gardez les flacons dans un incubateur humidifié pendant une journée avec une lumière naturelle de 12 heures. Après anesthésier à nouveau les mouches, transférez les mouches immobilisées sur un livre blanc et placez-les sous un microscope stéréo pour l’observer.Comparez la coloration abdominale de chaque groupe de traitement par rapport au groupe témoin. Pour améliorer la performance reproductive des mouches, préparez trois flacons de mouches pour chaque EDC en tant que flacons parentaux, avec huit femelles et quatre mâles dans 10 millilitres de milieu de semoule de maïs complétés par eE2. Pour la lutte, préparer six flacons de mouches, chacun avec huit femelles et quatre mâles dans 10 millilitres de farine de maïs moyen alimentaire complété par solvant EE2.L’arrière vole dans un incubateur à 25 degrés Celsius. Pendant leur développement, évitez de surcharger les larves. Après quatre jours, inverser chaque flacon sur un étherisateur pour enlever les parents et retourner les flacons à l’incubateur pendant cinq jours de plus.En fin d’après-midi du neuvième jour, inverser chaque flacon au-dessus d’un étherisateur pour enlever toutes les mouches nouvellement émergées des flacons et mettre les flacons dans un autre incubateur à 18 degrés Celsius pendant la nuit. Le matin du jour 10, sur un poste de travail sur le dioxyde de carbone de Drosophila, inversez soigneusement le flacon de culture pour empêcher les mouches anesthésiées de tomber sur le milieu et insérez un tube en caoutchouc avec une aiguille dans le flacon entre le bouchon de coton et le mur de flacon. Ouvrez la vanne pour fournir du dioxyde de carbone.En quelques secondes, transférez les mouches dans un lit volant au microscope. Recueillir les femelles vierges et les jeunes mâles séparément en deux groupes sur le lit de mouche. Subdiviser aléatoirement chaque groupe de mouches en petits sous-groupes, avec 10 femelles ou 20 mâles par flacon rempli de farine de maïs fraîche correspondante moyenne.Poursuivre l’incubation et recueillir 30 femelles vierges et 30 mâles pour chaque EDC, et 90 femelles vierges et 90 mâles pour le contrôle. Abritez ces groupes de mouches à 25 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient âgées de quatre jours après l’éclosion. Ensuite, transférez-les dans de nouveaux flacons contenant du milieu correspondant frais tous les deux jours.Vérifiez qu’il n’y a pas de larves dans les flacons des femelles. Étiquetez ensuite les flacons avec une série différente de nombres séquentiels pour le traitement suivant. Après l’anesthésie, transférer une femelle traitée au solvant EE2 dans un petit flacon contenant du milieu frais de tomate semoule de maïs sans EE2 et ajouter un mâle traité au solvant EE2 pour le contrôle à travers.Jumeler un mâle traité à l’EE2 avec une femelle traitée au solvant EE2 ou une femelle traitée à l’EE2 avec un mâle traité au solvant EE2 pour chaque traitement. Maison 20 croix simples à 25 degrés Celsius. Transférer chaque paire d’accouplement dans des flacons moyens de tomates semoule de maïs fraîches sans EDC tous les jours pendant les 10 jours suivants.Inspectez visuellement chaque flacon chaque jour pour les oeufs et signalez leur nombre sur la feuille de calcul de fertilité. Dans chaque flacon, vérifiez de près les mouches nouvellement émergées et enregistrez le nombre quotidien de descendances adultes au cours de la période de 10 jours. Après 10 jours à partir de l’accouplement initial, retirez les parents de la dernière série de flacons.Dans les protocoles d’analyse de l’éclosion, d’abord, pour chaque groupe de traitement, mettre en place 10 flacons de jeunes mouches en bonne santé de moins de deux jours, chacune avec six femelles et trois mâles dans 10 millilitres d’aliments de semoule de maïs sans EDC. Élever les mouches sur la nourriture pendant 24 heures et leur permettre de s’accoupler. Préparez ensuite 10 flacons parallèles par groupe de traitement avec 10 millilitres chacun d’aliments frais de semoule de maïs complétés par différentes concentrations d’EDC ou le solvant EE2 seul pour le contrôle.Transférez les mouches agenées sur ces nouveaux flacons. Faites une feuille de calcul de développement pour enregistrer les différentes séries. Laisser pondre les mouches pendant 16 heures.Ensuite, retirez les parents des flacons. Incuber les flacons à 25 degrés Celsius pendant trois à quatre jours, ou jusqu’à ce que les larves errantes soient visibles. Chaque jour, comptez le nombre de nouvelles nymphes dans chaque flacon en écrivant un numéro dans l’ordre par chaque pupe à l’extérieur du flacon pour éviter de compter deux fois la même pupe.Signalez le nombre de pupes nouvellement apparues pendant trois à quatre jours, ou jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de pupes. À partir du neuvième jour, compter le nombre d’adultes émergents par jour, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’adultes. Signalez-le sur la feuille de calcul du développement et effectuez le reste de l’analyse d’éclosion selon le manuscrit.Dans le protocole de durée de vie, d’abord mis en place 20 flacons avec huit femelles et quatre mâles, chacun rempli de 10 millilitres de nourriture semoule de maïs et les loger à 25 degrés Celsius. Après quatre jours, jeter les mouches et remettre les flacons dans l’incubateur. En fin d’après-midi du neuvième jour, retirez toutes les mouches nouvellement émergées des flacons et retournez les flacons à l’incubateur.Après 16 à 24 heures, divisez 250 mouches adultes d’un jour des deux sexes en quatre groupes sous anesthésie légère de dioxyde de carbone et transférez-les dans des bouteilles de 250 millilitres contenant des aliments moyens pour adultes, trois complétées par différentes concentrations d’EDC et une avec le solvant EE2 seul. Maintenez les mouches à 25 degrés Celsius pendant deux à trois jours pour leur permettre de s’accoupler. Ensuite, trier chaque cohorte de mouches par sexe en deux groupes.Dans chaque condition de traitement, pour les deux sexes, subdiviser aléatoirement chaque groupe en cinq flacons parallèles à une densité de 20 individus par flacon. Préparez une feuille de calcul de la durée de vie dans laquelle le nombre de mouches mortes est soustrait du nombre de mouches survivantes du transfert précédent, de sorte que le nombre de survivants à chaque transfert soit automatiquement obtenu. Après trois jours, transférer les mouches sans anesthésie sur de nouveaux flacons contenant les aliments correspondants en même temps et vérifier la mort.Enregistrez l’âge des mouches et le nombre de mouches mortes. Répétez le transfert tous les trois jours jusqu’à ce que toutes les mouches meurent. Dans le cadre de cette expérience, les courbes de durée de vie ont été tracées comme la survie cumulative par rapport aux jours écoulés pour chaque concentration d’EDC et le contrôle.Pour le contrôle, après une longue période initiale au cours de laquelle la courbe de survie est restée relativement élevée, elle a diminué de façon exponentielle après environ 60 jours. À la suite de l’exposition à EDC, la courbe de survie des mouches traitées a été affectée de façon significative et a connu une baisse spectaculaire après 36 jours. Il est informé que les flacons parallèles en cours d’analyse devraient être très similaires, sinon il sera difficile de comprendre lequel jeter.Par conséquent, nous suggérons de prendre grand soin, en adoptant une bonne pratique expérimentale, en utilisant une grande taille d’échantillon. Suivant ces protocoles, il est également possible d’évaluer l’impact transgénérationnel d’un perturbateur endocrinien sélectionné ainsi que de tester les effets additifs potentiels d’une combinaison de différents perturbateurs endocriniens.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Dosage des populations de cellules de sang de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larve

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Recherche

Biologie du développement

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

L&#39;élevage du Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sous axéniques et gnotobiotique Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Méthodes pour examiner la lymphe et Gland hémocytes dans<em&gt; Drosophila</em&gt; larves

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Dégel, cultivant et cryoconservation des lignées de cellules de drosophile

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Imagerie d’animaux entiers de Drosophila melanogaster à l’aide de la tomographie microcalculée

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Imagerie d’explants cérébraux vivants de larves de Drosophila melanogaster au troisième stade

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Pleins feux sur l’auteur : Étude de la dynamique de la division cellulaire asymétrique : un protocole pour l’imagerie en direct des explants cérébraux de larves de drosophile 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imagerie de cellules vivantes du cerveau larvaire du troisième stade de Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...