Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Die Autoren danken Orsolina Petillo für die technische Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) für die bibliographische Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Gustavo Damiano Mita für die Einführung in die EDC-Welt. Die Autoren danken Leica Microsystems und Pasquale Romano für ihre Unterstützung. Diese Forschung wurde vom Projekt PON03PE_00110_1 unterstützt. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projekt PO FESR Kampanien 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

1. Lebensmittelzubereitung
<ol><li>
Für die Bestandspflege und das Larvenwachstum ein Maismehlmedium verwenden, das 3 % Pulverhefe, 10 % Saccharose, 9 % vorgekochtes Maismehl, 0,4 % Agar, danach Maismehlmedium (CM) enthält.
	<ol>
<li>30 g Hefe in 100 ml Leitungswasser geben, zum Kochen bringen und 15 min kochen lassen.</li>
		<li>Getrennt gut 90 g vorgekochtes Maismehl, 100 g Zucker und 4 g Agar in 900 ml Leitungswasser mischen.</li>
		<li>Bringen Sie die Lösung zum Kochen, senken Sie die Hitze und ...

Die Fruchtfliege D. melanogaster wurde ausgiebig als In-vivo-Modellsystem eingesetzt, um die potenziellen Auswirkungen von Umwelt-EDCs wie DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33und EE234. Mehrere Gründe haben seine Verwendung als Modell in diesem Forschungsbereich geführt. Abgesehen von seinen unbestrittenen Vorteilen ...

Menschliche Aktivitäten haben eine enorme Menge an Chemikalien in die Umwelt freigesetzt, die ein ernstes Problem für Organismen und für natürliche Ökosysteme darstellen1. Von diesen Schadstoffen wird geschätzt, dass etwa 1.000 verschiedene Chemikalien das normale Gleichgewicht der endokrinen Systeme verändern können; nach dieser Eigenschaft werden sie als endokrine störende Chemikalien (EDCs) klassifiziert. Insbesondere auf der Grundlage einer kürzlichen Definition der Endokrinen Gesellschaft sind die EDCs "eine exogene Chemikalie oder eine Mischung von Chemikalien, die jeden Aspekt der Hormonwirkung beeinträchtigen können"2. In den letzten drei Jahrzehnten hat es immer mehr wissenschaftliche Beweise dafür gegeben, dass EDCs die Fortpflanzung und Entwicklung von Tieren und Pflanzen beeinflussen können3,4,5,6,7, 8. Darüber hinaus wurde die EDC-Exposition mit der zunehmenden Prävalenz einiger menschlicher Krankheiten zusammen, einschließlich Krebs, Fettleibigkeit, Diabetes, Schilddrüsenerkrankungen und Verhaltensstörungen9,10,11.
Allgemeine Mechanismen der EZ
Aufgrund ihrer molekularen Eigenschaften verhalten sich EDCs wie Hormone oder Hormonvorläufer3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. In diesem Sinne, Sie können an einen Hormonrezeptor binden und stören endokrine Systeme entweder durch Nachahmung der Hormonaktivität oder durch Blockierung endogene Hormone Bindung. Im ersten Fall, nach der Bindung an den Rezeptor, Sie können es aktivieren, wie sein natürliches Hormon tun würde. Im anderen Fall verhindert die Bindung des EDC an den Rezeptor die Bindung seines natürlichen Hormons, so dass der Rezeptor blockiert ist und auch in Gegenwart seines natürlichen Hormons3nicht mehr aktiviert werden kann. Infolgedessen können EDCs mehrere Prozesse beeinflussen, wie die Synthese, Sekretion, Transport, Stoffwechsel oder periphere Wirkung von endogenen Hormonen, die für die Aufrechterhaltung der Homöostase, Fortpflanzung, Entwicklung und/oder Verhalten von den Organismus. Die Rezeptorbindung ist nicht die einzige bisher beschriebene Wirkungsweise für die EDCs. Es ist jetzt klar, dass sie auch handeln können, indem sie Koaktivatoren oder Corepressoren in enzymatischen Bahnen rekrutieren oder epigenetische Marker modifizieren, die die Genexpression10,11,12,13 deregulieren. ,14, mit Folgen nicht nur für die aktuelle Generation, sondern auch für die Gesundheit der kommenden Generationen8.
Drosophila-Hormone
Die potenziellen Auswirkungen ausgewählter EDCs wurden umfassend untersucht, sowohl bei Tierarten als auch in mehreren Modellsystemen, in denen endokrine Mechanismen einigermaßen gut bekannt sind. Bei wirbellosen Tieren wurden endokrine Systeme, die Wachstum, Entwicklung und Fortpflanzung beeinflussen, bei Insekten aus mehreren Gründen stark charakterisiert, was ihre umfangreiche Verwendung im Bereich der biologischen Forschung, ihre wirtschaftliche Bedeutung und schließlich die Entwicklung von Insektiziden, die in der Lage sind, speziell in das Hormonsystem von Schädlingsinsekten einzugreifen.
Insbesondere unter Insekten hat sich die Fruchtfliege D. melanogaster als ein sehr leistungsfähiges Modellsystem zur Bewertung der möglichen endokrinen Wirkungen von EDCs erwiesen. Bei D. melanogaster, sowie bei Wirbeltieren, Hormone spielen eine wichtige Rolle über den gesamten Lebenszyklus. In diesem Organismus gibt es drei Haupthormonsysteme, die das Steroidhormon 20-Hydroxyecdyson (20E)15,16, das sesquiterpenoide Juvenile Hormon (JH)17, und die Neuropeptide und Peptid/Protein beinhalten Hormone18. Diese dritte Gruppe besteht aus mehreren Peptiden, die in jüngerer Zeit entdeckt wurden, aber eindeutig an einer Vielzahl von physiologischen und Verhaltensprozessen beteiligt sind, wie Langlebigkeit, Homöostase, Stoffwechsel, Reproduktion, Gedächtnis und Bewegungssteuerung. 20E ist homologe zu Cholesterin-abgeleiteten Steroidhormonen wie Estradiol, während JH einige Ähnlichkeiten mit Retinsäure teilt; beide sind die bekannteren Hormone in Drosophila19,20. Ihr Gleichgewicht ist entscheidend für die Koordination von Molting und Metamorphose sowie für die Steuerung mehrerer postentwicklungsmäßiger Prozesse, wie Fortpflanzung, Lebensdauer und Verhalten21, und bietet somit verschiedene Möglichkeiten zur Erprobung endokriner Störung in Drosophila. Darüber hinaus sind Ecdysteroidhormone und JHs die Hauptziele der sogenannten Insektizide der dritten Generation, die entwickelt wurden, um entwicklungs- und reproduktive endokrine Prozesse bei Insekten zu stören. Die agonistische oder antagonistische Wirkungsweise dieser Chemikalien ist bekannt und kann daher als Referenzstandards für die Bewertung der Auswirkungen potenzieller EDCs auf das Wachstum, die Fortpflanzung und die Entwicklung von Insekten dienen22. Zum Beispiel, Methopren, das weit verbreitet bei der Bekämpfung von Mücken und anderen Wasserinsekten23,24, arbeitet als JH-Agonist und unterdrückt 20E-induzierte Gentranskription und Metamorphose.
Neben Hormonen ist auch die Superfamilie des Nuklearrezeptors (NR) in Drosophila bekannt; Es besteht aus 18 evolutionär konservierten Transkriptionsfaktoren, die an der Kontrolle hormonabhängiger Entwicklungspfade sowie Reproduktion und Physiologie25beteiligt sind. Diese Hormon NRs gehören zu allen sechs NR-Überfamilie Subtypen, einschließlich der an der Neurotransmissionbeteiligt 26, zwei für Retinsäure NRs, und diejenigen für Steroid NRs, die bei Wirbeltieren, eines der primären Ziele von EDCs27darstellen.
Drosophila als Modellsystem zum Studium von EDCs
Derzeit führen mehrere Umweltagenturen auf der ganzen Welt auf der Grundlage molekularer Eigenschaften das Potenzial, die endokrinen Systeme zu stören, verschiedenen vom Menschen hergestellten Chemikalien zu. Da die EDC ein globales und allgegenwärtiges Problem für die Umwelt und für Organismen darstellen, besteht das übergeordnete Ziel der Forschung auf diesem Gebiet darin, ihre Krankheitslast zu verringern und lebende Organismen vor ihren nachteiligen Auswirkungen zu schützen. Um das Verständnis über die möglichen endokrinen Wirkungen einer Chemikalie zu vertiefen, ist es notwendig, sie in vivo zu testen. Zu diesem Zweck stellt D. melanogaster ein gültiges Modellsystem dar. Bis heute wurde die Fruchtfliege ausgiebig als In-vivo-Modell verwendet, um die Auswirkungen mehrerer Umwelt-EDCs zu bewerten; Es wurde berichtet, dass die Exposition gegenüber mehreren EDCs, wie Dibutylphthalat (DBP)28, Bisphenol A (BPA), 4-Nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, Methylparaben (MP)30, Ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-ethylhexyl) phthalat (DEHP)33, und 17-a-ethinylestradiol (EE2)34, beeinflusst den Stoffwechsel und die endokrinen Funktionen wie bei Wirbeltiermodellen. Mehrere Gründe haben dazu geführt, dass er als Modell in diesem Forschungsbereich verwendet wurde. Neben der hervorragenden Kenntnis seiner endokrinen Systeme sind weitere Vorteile sein kurzer Lebenszyklus, niedrige Kosten, leicht zu manipulierbares Genom, eine lange Forschungsgeschichte und mehrere technische Möglichkeiten (siehe FlyBase-Website, http://flybase.org/). D. melanogaster bietet auch ein leistungsfähiges Modell für die einfache Untersuchung der transgenerationalen Effekte und Der Population Reaktionen auf Umweltfaktoren8 und vermeidet ethische Fragen, die für In-vivo-Studien an höheren Tieren relevant sind. Darüber hinaus teilt die Fruchtfliege ein hohes Maß an Generhaltung mit menschenweisen, was es Drosophila EDC-Assays ermöglichen könnte, bei der Vorhersage oder Demindizierung möglicher Auswirkungen dieser Chemikalien auf die menschliche Gesundheit zu helfen. Neben der Erweiterung des Verständnisses über die Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit kann Drosophila dazu beitragen, die Risiken einer EDC-Exposition gegenüber der Umwelt, wie den Verlust der biologischen Vielfalt und die Umweltzerstörung, zu bewerten. Schließlich bietet die Fruchtfliege den zusätzlichen Vorteil, in Laboratorien eingesetzt zu werden, in denen die Faktoren, die ihre Entwicklung, Fortpflanzung und Lebensdauer beeinflussen, unter Kontrolle gehalten werden können, um jede Variation dem zu prüfenden Stoff zuzuschreiben.
Vor diesem Hintergrund haben wir einfache und robuste Fitness-Assays optimiert, um EDC-Effekte auf einige Drosophila-Hormonmerkmale wie Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeit, Entwicklungszeitpunkt und Erwachsenenlebensdauer zu bestimmen. Diese Assays wurden weit verbreitet für einige EDCs23,24,25,26,27verwendet. Insbesondere haben wir die folgenden Protokolle verwendet, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber dem synthetischen Östrogen EE234 und BPA und Bisphenol AF (BPA F) (unveröffentlichte Daten) zu bewerten. Diese Protokolle können leicht geändert werden, um die Auswirkungen eines bestimmten EDC zu einem Zeitpunkt zu untersuchen, sowie die kombinierten Wirkungen mehrerer EDCs in D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

In den letzten Jahren mehren sich die Hinweise, dass alle Organismen und die Umwelt hormonähnlichen Chemikalien ausgesetzt sind, die als endokrine Disruptorchemikalien (EDCs) bekannt sind. Diese Chemikalien können das normale Gleichgewicht der endokrinen Systeme verändern und zu negativen Auswirkungen führen, sowie eine zunehmende Anzahl von hormonellen Störungen in der menschlichen Bevölkerung oder gestörtes Wachstum und verminderte Fortpflanzung in den Wildtierarten. Für einige EDCs gibt es dokumentierte gesundheitliche Auswirkungen und Einschränkungen für ihre Verwendung. Für die meisten von ihnen gibt es jedoch immer noch keine wissenschaftlichen Beweise in diesem Sinne. Um mögliche endokrine Wirkungen einer Chemikalie im vollwertigen Organismus zu überprüfen, müssen wir sie in geeigneten Modellsystemen sowie in der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster,testen. Hier berichten wir über detaillierte In-vivo-Protokolle zur Untersuchung endokriner Störungen in Drosophila, die edC-Effekte auf die Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeit, den Entwicklungszeitpunkt und die Lebensdauer der Fliege angehen. In den letzten Jahren haben wir diese Drosophila-Lebensmerkmale verwendet, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber 17-Ethinylestradiol (EE2), Bisphenol A (BPA) und Bisphenol AF (BPA F) zu untersuchen. Insgesamt deckten diese Assays alle Drosophila-Lebensstadien ab und ermöglichten es, endokrine Störungen in allen hormonvermittelten Prozessen zu bewerten. Fecundity/Fertility und Developmental Timing Assays waren nützlich, um die Auswirkungen des EDC auf die Reproduktivleistung der Fliege bzw. auf die Entwicklungsstadien zu messen. Schließlich umfasste der Lebensdauertest chronische EDC-Expositionen bei Erwachsenen und maß deren Überleben. Diese Lebensmerkmale können jedoch auch durch mehrere experimentelle Faktoren beeinflusst werden, die sorgfältig kontrolliert werden mussten. In dieser Arbeit schlagen wir daher eine Reihe von Verfahren vor, die wir für das richtige Ergebnis dieser Assays optimiert haben. Diese Methoden ermöglichen es Wissenschaftlern, endokrine Störungen für jedes EDC oder für eine Mischung verschiedener EDCs in Drosophila festzustellen, obwohl zur Identifizierung des für die Wirkung verantwortlichen endokkrinen Mechanismus weitere Essays erforderlich sein könnten.

In diesem Abschnitt werden die wichtigsten Schritte der oben genannten Protokolle in Form vereinfachter Schemata beschrieben. Da Fliegen dazu neigen, ungenießbare Verbindungen zu vermeiden, ist das erste, was zu tun ist, den Geschmack des ausgewählten EDC zu überprüfen. Dies kann durch Mischen einer Lebensmittelfärbung (z. B. roter Lebensmittelfarbstoff Nr. 40)35 mit dem Lebensmittel erfolgen, das mit dem ausgewählten EDC in verschiedenen Dosen oder mit dem Lösungsmittel allein ergänzt wir...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endokrine Disruptorchemikalien (EDCs) stellen ein ernstes Problem für Organismen und natürliche Umgebungen dar. Drosophila melanogaster stellt ein ideales Modell dar, um EDC-Effekte in vivo zu untersuchen. Hier stellen wir Methoden zur Untersuchung der endokrineStörung in Drosophila vor, die EDC-Effekte auf Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Entwicklungszeitpunkt und Lebensdauer der Fliege adressieren.

Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modell zur Bewertung der potenziellen toxischen und endokrinen Wirkungen von Chemikalien wie endokrinen Disruptoren, die ein ernstes Problem für die menschliche Gesundheit und die natürliche Umwelt darstellen. Angesprochen auf die Wirkung von EDCs auf die hormonellen Lebensmerkmale der Fliege, wie Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Entwicklungszeit, und die Lebensdauer. Es ist eine einfache, billige und schnelle Möglichkeit, endokrine Störungen in vivo zu untersuchen.Die Fruchtbarkeit, Entwicklung, und Lebensdauer in Drosophila kann durch mehrere Faktor beeinflusst werden, die sorgfältig kontrolliert werden müssen, um den erfolgreichen Ausgang dieses Protokolls zu gewährleisten. Daher ist maximale Aufmerksamkeit bei der Aufzucht und Handhabung von Fliegen erforderlich. Um den Geschmack des ausgewählten EDC zu beschwichtigen, übertragen Sie nach der Anästhesisierung 15 junge Fliegen vom Fliegenbett auf vier parallele Fläschchen mit Maismehlmedium, gemischt mit einer Lebensmittelfärbung.Die Steuerdurchstechflasche enthält das Lösungsmittel allein, und die drei anderen Durchstechflaschen werden durch verschiedene Dosen der ausgewählten EDCs ergänzt. Bewahren Sie die Fläschchen in einem befeuchteten Inkubator für einen Tag mit einem natürlichen 12-Stunden-Licht auf. Nach der erneuten Anästhesisierung der Fliegen die immobilisierten Fliegen auf ein weißes Papier übertragen und unter ein Stereomikroskop stellen, um sie zu beobachten.Vergleichen Sie die Bauchfärbung jeder Behandlungsgruppe in Bezug auf die Kontrollgruppe. Um die Fortpflanzungsleistung der Fliegen zu assay, bereiten Sie drei Fläschchen fliegen für jedes EDC als Elternfläschchen, mit acht Weibchen und vier Männchen in 10 Milliliter Maismehl Medium mit EE2 ergänzt. Für die Kontrolle, bereiten Sie sechs Fläschchen von Fliegen, jeweils mit acht Weibchen und vier Männchen in 10 Milliliter Maismehl mittlere Nahrung mit EE2 Lösungsmittel ergänzt.Hinterfliegen in einem Inkubator bei 25 Grad Celsius. Vermeiden Sie während ihrer Entwicklung eine Überbelegung der Larven. Nach vier Tagen, invertieren Sie jede Durchstechflasche über einem Äther, um die Eltern zu entfernen und die Fläschchen für fünf weitere Tage an den Inkubator zurückzugeben.Am späten Nachmittag des neunten Tages, invertieren Sie jede Durchstechflasche über einem Äther, um alle neu aufgetauchten Fliegen von den Fläschchen zu entfernen und die Fläschchen in einem anderen Inkubator bei 18 Grad Celsius über Nacht zu legen. Am Morgen des 10. Tages, auf einem Drosophila Kohlendioxid-Arbeitsplatz, vorsichtig invertieren die Kultur-Fläschchen, um zu verhindern, dass anästhesierte Fliegen auf Medium fallen und legen Sie ein Gummirohr mit einer Nadel in die Durchstechflasche zwischen dem Baumwollstopfen und der Durchstechflasche. Öffnen Sie das Ventil, um Kohlendioxid zu liefern.Innerhalb von Sekunden die Fliegen auf ein Fliegenbett unter dem Mikroskop zu übertragen. Sammeln Sie jungfräuliche Weibchen und junge Männchen getrennt in zwei Gruppen auf dem Fliegenbett. Unterteilen Sie jede Gruppe von Fliegen zufällig in kleine Untergruppen, wobei 10 Weibchen oder 20 Männchen pro Durchstechflasche mit frischem entsprechendem Maismehlmedium gefüllt sind.Setzen Sie die Inkubation fort und sammeln Sie 30 jungfräuliche Weibchen und 30 Männchen für jedes EDC, und 90 jungfräuliche Weibchen und 90 Männchen für die Kontrolle. Beherbergen Sie diese Gruppen von Fliegen bei 25 Grad Celsius, bis sie vier Tage nach der Eklat sind. Dann übertragen Sie sie alle zwei Tage in neue Fläschchen mit frischem entsprechendem Medium.Überprüfen Sie, ob sich keine Larven in den Fläschchen von Weibchen befinden. Dann beschriften Sie Fläschchen mit einer anderen Reihe von fortlaufenden Nummern für die folgende Behandlung. Nach der Anästhesisation ein mit EE2 lösungsmittelbehandeltes Weibchen in eine kleine Durchstechflasche mit frischem Maismehl-Tomatenmedium ohne EE2 übertragen und ein eE2-lösungsmittelbehandeltes Männchen zur Kontrolle quer geben.Paarieren Sie ein EE2-behandeltes Männchen mit EE2-lösungsmittelbehandeltem Weibchen oder EE2-behandeltem Weibchen mit EE2-Lösungsmittel-behandeltem Männchen für jede Behandlung. Haus 20 einzelne Kreuze bei 25 Grad Celsius. Übertragen Sie jedes Paar auf frische Maismehl Tomaten mittel Fläschchen ohne EDC jeden Tag für die folgenden 10 Tage.Überprüfen Sie jede Durchstechflasche jeden Tag visuell auf die Eier und melden Sie ihre Nummer auf der Fruchtbarkeitstabelle. Überprüfen Sie in jeder Durchstechflasche genau nach neu aufgetauchten Fliegen und erfassen Sie die tägliche Anzahl erwachsener Progenies über den 10-Tage-Zeitraum. Nach 10 Tagen nach der ersten Paarung, entfernen Sie die Eltern aus der letzten Serie von Fläschchen.In Eclosion Assay-Protokollen, zuerst, für jede Behandlungsgruppe, 10 Fläschchen von jungen, gesunden Fliegen weniger als zwei Tage alt, mit jeweils sechs Weibchen und drei Männchen in 10 Milliliter Maismehl Nahrung ohne EDC. Die Fliegen 24 Stunden auf dem Essen aufziehen und sich paaren lassen. Dann bereiten Sie weitere 10 parallele Fläschchen pro Behandlungsgruppe mit je 10 Millilitern frischer Maismehlnahrung zu, die mit unterschiedlichen EDC-Konzentrationen oder dem EE2-Lösungsmittel allein zur Kontrolle ergänzt wird.Übertragen Sie die gepaarten Fliegen auf diese neuen Fläschchen. Erstellen Sie eine Entwicklungstabelle, um die verschiedenen Serien aufzuzeichnen. Lassen Sie die Fliegen 16 Stunden lang Eier legen.Entfernen Sie dann die Eltern von den Fläschchen. Bebrüte die Fläschchen bei 25 Grad Celsius für drei bis vier Tage, oder bis wandernde Larven sichtbar sind. Zählen Sie jeden Tag die Anzahl der neuen Welpen in jeder Durchstechflasche, indem Sie eine Zahl nacheinander von jedem Pupa auf die Außenseite der Durchstechflasche schreiben, um zu vermeiden, dass die gleiche Pupa zweimal gezählt wird.Melden Sie die Anzahl der neu entstandenen Pupae für drei bis vier Tage, oder bis keine Pupae mehr Form. Ab dem neunten Tag zählen Sie täglich die Anzahl der aufstrebenden Erwachsenen, bis keine Erwachsenen mehr auftauchen. Melden Sie es über die Entwicklungstabelle und führen Sie den Rest des Eclosion-Assays gemäß dem Manuskript durch.Im Life-Life-Life-Protokoll wurden zunächst 20 Fläschchen mit acht Weibchen und vier Männchen aufgestellt, die jeweils mit 10 Millilitern Maismehl-Nahrung gefüllt sind und sie bei 25 Grad Celsius unterbringen. Nach vier Tagen die Fliegen entsorgen und die Fläschchen wieder in den Brutkasten legen. Am späten Nachmittag des neunten Tages entfernen Sie alle neu aufgetauchten Fliegen von den Fläschchen und bringen Sie die Fläschchen zum Brutkasten zurück.Nach 16 bis 24 Stunden 250 eintägige erwachsene Fliegen beiderlei Geschlechts unter leichter Kohlendioxidanästhesisierung in vier Gruppen aufteilen und in 250-Milliliter-Flaschen mit mittelschweren Lebensmitteln für Erwachsene übertragen, drei mit unterschiedlichen EDC-Konzentrationen und eine allein mit dem EE2-Lösungsmittel. Halten Sie die Fliegen bei 25 Grad Celsius für zwei bis drei Tage, damit sie sich paaren können. Sortieren Sie dann jede Kohorte von Fliegen nach Geschlecht in zwei Gruppen.Innerhalb jeder Behandlungsbedingung unterteilen Sie jede Gruppe für beide Geschlechter nach dem Zufallsprinzip in fünf parallele Fläschchen mit einer Dichte von 20 Individuen pro Durchstechflasche. Bereiten Sie eine Lebensspanne Tabelle, in der die Anzahl der toten Fliegen wird von der Anzahl der überlebenden Fliegen aus dem vorherigen Transfer subtrahiert, so dass die Anzahl der Überlebenden bei jedem Transfer automatisch erhalten wird. Nach drei Tagen die Fliegen ohne Anästhesie auf neue Fläschchen mit dem entsprechenden Futter zur gleichen Zeit übertragen und auf den Tod überprüfen.Erfassen Sie das Alter der Fliegen und die Anzahl der toten Fliegen. Wiederholen Sie den Transfer alle drei Tage, bis alle Fliegen sterben. In diesem Experiment wurden Lebensdauerkurven als kumulatives Überleben im Vergleich zu den verstrichenen Tagen für jede EDC-Konzentration und die Kontrolle dargestellt.Für die Kontrolle ging sie nach einer langen Anfangsphase, in der die Überlebenskurve relativ hoch blieb, nach etwa 60 Tagen exponentiell zurück. Nach der EDC-Exposition wurde die Überlebenskurve der behandelten Fliegen erheblich beeinflusst und zeigte nach 36 Tagen einen dramatischen Rückgang. Es wird empfohlen, dass die parallelen Fläschchen, die analysiert werden, sehr ähnlich sein sollten, sonst wird es schwierig zu verstehen sein, welche zu entsorgen sind.Daher empfehlen wir, große Sorgfalt zu walten, eine gute experimentelle Praxis zu übernehmen, indem wir eine große Stichprobengröße verwenden. Im Anschluss an diese Protokolle ist es auch möglich, die transgenerationellen Auswirkungen eines ausgewählten endokrinen Disruptors zu bewerten und die potenziellen additiven Wirkungen einer Kombination verschiedener endokriner Disruptoren zu testen.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Untersuchung von Blut Zellpopulationen des<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Aufzucht der Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Auftauen, Kultivierung und Cryopreserving Drosophila -Zell-Linien

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Assay für Blut - Hirn-Barriere Integrität in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Bildgebung von lebenden Hirnexplantaten von Drosophila melanogaster Larven des dritten Stadiums

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der asymmetrischen Zellteilungsdynamik: Ein Protokoll für die Live-Bildgebung von Drosophila-Larven-Hirnexplantaten 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...