Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

המחברים מודים לאורסולינה פטורו לקבלת תמיכה טכנית. המחברים מודים לד ר מריארטריה אלטה (CNR) לתמיכה ביבליוגרפית. המחברים מודים לד ר גוסטבו דמייאנו מיטה עבור הצגת אותם בעולם EDC. המחברים מודים לייקה מיקרוסיסטמס ופסקואלה רומנו על עזרתם. מחקר זה נתמך על ידי Project PON03PE_00110_1. "המילה הטובה ביותר היא מילה של משפחה, ולהשתלות את הצ" בדונטויטיקה, לאחר שacronimo, הייתה מאוד מלאה בשיניים ובקללות. Committente: פו FESR 2014-2020 קמפאנייה; פרויקט פו פהאב קמפאנייה 2007-2013 "ננו-לוגי לפני RILASCIO בלטו בסין".

1. הכנת מזון
<ol><li>
לתחזוקת מניות ולגידול זחל, השתמש במדיום ארוחה בינונית המכילה 3% אבקת שמרים, 10% סוכרוז, 9% קמח תירס מבושל מראש, 0.4% אגר, לאחר מכן המכונה בינונית קמח תירס (CM).
	<ol>
<li>לשים 30 גרם של שמרים לתוך 100 mL של מי ברז, להביא אותו לרתיחה ולתת לו לרתוח עבור 15 דקות.</li>
		<li>בנפרד, מערבבים היט?...

זבוב הפירות D. melanogaster היה מועסק בהרחבה כמו במערכת vivo model כדי לחקור את ההשפעות הפוטנציאליות של הסביבה edcs כגון dbp28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, dehp33, ו EE234. מספר סיבות הובילו את השימוש בו כמודל בתחום...

פעילויות אנושיות משחררים לסביבה כמות עצומה של כימיקלים, המייצגים בעיה רצינית לאורגניזמים ולמערכת אקולוגית טבעית1. מזהמים אלה, מעריכים כי על 1,000 כימיקלים שונים עשויים לשנות את האיזון הרגיל של מערכות אנדוקריניות; לפי תכונה זו, הם מסווגים כימיקלים המערכת האנדוקרינית משבש (EDCs). באופן ספציפי, מבוסס על הגדרה לאחרונה על ידי החברה האנדוקרינית, EDCs הם "כימיקל אקסוגני, או תערובת של כימיקלים, כי יכול להפריע לכל היבט של פעולה הורמונלית"2. בשלושת העשורים האחרונים, יש כבר גידול ראיות מדעיות כי edcs יכול להשפיע על רבייה ופיתוח של בעלי חיים וצמחים3,4,5,6,7, שמונה. יתר על כן, חשיפה edc היתה קשורה השכיחות הגוברת של כמה מחלות האדם, כולל סרטן, השמנת יתר, סוכרת, מחלות בלוטת התריס, הפרעות התנהגותיות9,10,11.
מנגנונים כלליים של EDC
עקב התכונות המולקולריות שלהם, edcs להתנהג כמו הורמונים או הורמונים מקדים3,4,5,6,7,8,9, . עשר,11,12 במובן זה, הם יכולים לאגד קולטן הורמון לשבש מערכות אנדוקריניות או על ידי מחקה פעילות הורמון או על ידי חסימת הורמונים אנדוגניים מחייב. במקרה הראשון, לאחר הכריכה לקולטן, הם יכולים להפעיל אותו כמו הורמון הטבעי שלו יעשה. במקרה השני, קשירה של ה-EDC לקולטן מונע את הכריכה של הורמון הטבעי שלה, כך הקולטן חסומה ולא ניתן עוד להפעיל, אפילו בנוכחות הורמון טבעי3. כתוצאה מכך, EDCs יכול להשפיע על מספר תהליכים, כגון סינתזה, הפרשה, תחבורה, חילוף החומרים, או פעולה היקפית של הורמונים אנדוגניים האחראים לתחזוקת הומאוסטזיס, רבייה, פיתוח, ו/או התנהגות של האורגניזם כריכת הקולטן אינה הדרך היחידה לפעולה המתוארת עד כה ל-EDCs. כעת ברור כי הם יכולים גם לפעול על ידי גיוס מפעילים או corepressors ב מסלולים אנזימטיים או על ידי שינוי סמנים אפיגנטיים להסיר ביטוי גנים10,11,12,13 ,14, עם השלכות לא רק עבור הדור הנוכחי אלא גם עבור בריאות של דורות לבוא8.
הורמוני דרוזופילה
ההשפעות הפוטנציאליות של ה-EDCs שנבחרו נחקרו רבות, הן במינים של חיות הבר והן במערכות מודל מסוימות בהן מנגנונים אנדוקריניים ידועים באופן סביר. עבור חסרי חוליות, מערכות אנדוקריניות המשפיעות על הצמיחה, הפיתוח והרבייה האופיינים בהרחבה בחרקים מכמה סיבות, תוך שימוש נרחב בתחום המחקר הביולוגי, החשיבות הכלכלית שלהם ו לבסוף התפתחות של קוטלי חרקים המסוגלים להתערב במיוחד במערכת ההורמונים של חרקים מזיקים.
במיוחד, בין חרקים, זבוב הפירות D. melanogaster הוכיחה להיות מערכת מודל רבת עוצמה כדי להעריך את ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של edcs. ב D. melanogaster, כמו גם בעלי חוליות, הורמונים לשחק תפקיד חשוב לאורך כל מחזור החיים. באורגניזם זה, יש שלוש מערכות הורמונליות הראשי, אשר כרוכות הורמון הסטרואידים 20-hydroxyecdysone (20e)15,16, הורמון הקטין לנוער sesquאיטראיד (jh)17, ואת נוירופפטידים ו פפטיד/חלבון הורמונים18. קבוצה שלישית זו מורכבת ממספר פפטידים שהתגלו לאחרונה אך בבירור מעורבים במגוון עצום של תהליכים פיזיולוגיים והתנהגותיים, כגון אריכות ימים, הומאוסטזיס, חילוף החומרים, רבייה, זיכרון, ו locomotor control. 20E הוא הומוולוגי להורמונים סטרואידים נגזרים כולסטרול כגון estradiol, בעוד JH שותפים כמה קווי דמיון עם חומצה retinoic; שניהם הורמונים ידועים יותר. בדרוזוהילה19,20 האיזון שלהם חיוני בתיאום המולטינג והגלגול, כמו גם בשליטה על מספר תהליכים פוסט-התפתחותיים, כגון רבייה, תוחלת חיים, והתנהגות21, ובכך מציעה אפשרויות שונות לבדיקה אנדוקרינית הפרעה בדרוזופילה. יתרה מזאת, הורמונים ecdysteroid ו-JHs הם המטרות העיקריות של האינסקטיצידים הדור השלישי, שפותחו כדי להפריע לתהליכים התפתחותיים והרבייה בתיווך בחרקים. הסוג האגוניסט או מצב היריב של הכימיקלים האלה ידוע היטב, ולכן הם יכולים לשמש כסטנדרטים להתייחסות להערכת ההשפעות של מחשבי ה-EDCs הפוטנציאליים על הצמיחה, הרבייה והפיתוח של חרקים22. לדוגמה, מתיונין, אשר כבר בשימוש נרחב בשליטה יתושים וחרקים מימיים אחרים23,24, עובד כמו אגוניסט jh ו לוחץ מחדש 20e המושרה שעתוק ומטמורפוזה.
בנוסף להורמונים הורמונים, הקולטן הגרעינית (NR) בדרוסופילה ידועה גם כן; הוא מורכב מ -18 מקדמי שימור ושימור שימור הקשורים במסלולים התפתחותיים תלויי הורמונים, כמו גם רבייה ופיזיולוגיה25. הורמון זה NRs שייך לכל ששת מיני-משפחה של ה-NR, כולל אלה מעורבים נוירותמסורת26, שניים עבור חומצה Retinoic nrs, אלה עבור סטרואידים nrs כי, בעלי חוליות, מייצגים אחד היעדים העיקריים של edcs27.
דרוסופילה כמערכת מודל לחקר הפקולטה למדעי המחשב
כיום, על בסיס של תכונות מולקולריות, מספר סוכנויות סביבתיות ברחבי העולם מייחס את הפוטנציאל להפריע למערכות האנדוקריניות לכימיקלים שונים מעשה ידי אדם. בהינתן כי EDCs הם בעיה גלובלית בכל מקום עבור הסביבה ועבור אורגניזמים, המטרה הכוללת של המחקר בתחום זה היא להפחית את נטל המחלה שלהם, כמו גם כדי להגן על אורגניזמים חיים מהשפעות שליליות שלהם. על מנת להעמיק את ההבנה על ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של כימיקל, יש צורך לבחון אותו בvivo. למטרה זו, ד. מלאנוגסטר מייצג מערכת מודל תקפה. עד היום, זבוב הפירות היה בשימוש נרחב כמו במודל vivo כדי להעריך את ההשפעות של מספר EDCs סביבתיים; דווח כי חשיפה לכמה edcs, כגון דיבוטיל פתלאט (dbp)28, בינתנול A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, מתיל paraben (MP)30, ethylparen (EP)31, 32, bis-(2-ethylyl) פתלאט (dehp)33, ו-17-α-ethinyלסטרנול (EE2)34, משפיע על חילוף החומרים ופונקציות אנדוקריניות כמו במודלים בעלי חוליות. מספר סיבות הובילו לשימוש בו כמודל בתחום זה של המחקר. מעבר לידע מצוין של המערכות האנדוקריניות שלה, יתרונות נוספים כוללים את מחזור החיים הקצר שלה, עלות נמוכה, בקלות manipulable הגנום, היסטוריה ארוכה של מחקר, ומספר אפשרויות טכניות (לראות את האתר FlyBase, http://flybase.org/). ד. melanogaster מספק גם מודל רב עוצמה לחקר בקלות השפעות טרנסדוריים ותגובות האוכלוסייה לגורמים סביבתיים8 ונמנע בעיות אתיות הרלוונטיות למחקרים vivo בבעלי חיים גבוהים יותר. בנוסף, זבוב הפירות משתף מידה גבוהה של שימור גנים עם בני אדם שעשויים לאפשר לדרוזוהילה edc בחני לסייע בחיזוי או בהצעת השפעות פוטנציאליות של כימיקלים אלה לבריאות האדם. מלבד הרחבת ההבנה על השפעות בריאותיות של האדם, דרוזופילה יכול לעזור להעריך את הסיכונים של חשיפת EDC לסביבה, כגון אובדן מגוון המינים והשפלה סביבתית. לבסוף, זבוב הפירות מציע את היתרון הנוסף של השימוש במעבדות, שבו הגורמים העלולים להשפיע על התפתחותו, הרבייה ותוחלת החיים ניתן לשמור תחת שליטה על מנת לייחס כל וריאציה על החומר להיבדק.
עם זאת בראש, יש לנו אופטימיזציה כושר פשוטה ואיתנה לקביעת אפקטים של EDC על כמה מאפיינים הורמונליים של דרוזוהילה, כגון פוריות/פוריות, עיתוי התפתחותי, ותוחלת חיים של מבוגרים. מספר זה שימשו באופן נרחב לכמה מהנגמ ש23,24,25,26,27. בפרט, השתמשנו בפרוטוקולים הבאים כדי להעריך את ההשפעות של החשיפה לאסטרוגן סינתטי EE234 ו BPA ו ביפרונול AF (BPA F) (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקולים אלה עשויים להיות שונה בקלות כדי לחקור את ההשפעות של EDC נתון בכל פעם, כמו גם את ההשפעות המשולבות של מספר Edc ב D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

בשנים האחרונות הוכחה גוברת כי כל האורגניזמים והסביבה חשופים לכימיקלים כמו הורמונים, המכונה המערכת האנדוקרינית כימיקלים (EDCs). כימיקלים אלה עשויים לשנות את האיזון הרגיל של מערכות אנדוקריניות להוביל לתופעות לוואי, כמו גם מספר גדל והולך של הפרעות הורמונליות באוכלוסייה האנושית או צמיחה מופרעת ורבייה מופחתת במינים חיות הבר. עבור חלק מ-EDCs, קיימים השפעות בריאותיות מתועדות והגבלות על השימוש בהם. עם זאת, עבור רובם, עדיין אין ראיות מדעיות במובן הזה. כדי לאמת את ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של כימיקל באורגניזם המלא, אנו צריכים לבדוק אותו במערכות מודל מתאימות, כמו גם בזבוב הפירות, דרוזופילה מלאנוגסטר. כאן אנו מדווחים מפורט בפרוטוקולים vivo כדי לחקור את ההפרעה האנדוקרינית בדרוזוהילה, מטפל בהשפעות EDC על פוריות/פוריות, התפתחות העיתוי, ותוחלת החיים של הזבוב. בשנים האחרונות, השתמשנו בתכונות אלה החיים הדרוזובית כדי לחקור את ההשפעות של חשיפה 17-α-ethinyלסטרנול (EE2), ביאגנול A (BPA), ו ביאגנול AF (BPA F). בסך הכל, אלה האומרים מכוסים כל החיים Drosophila ילה והפכה את האפשרות להעריך את ההפרעה האנדוקרינית בכל תהליכי הורמון בתיווך. פוריות/פריון והתפתחות עיתוי התפתחותי היו שימושיים למדוד את השפעת ה-EDC על ביצועי הרבייה לטוס ועל שלבים התפתחותיים, בהתאמה. בסופו של דבר, שיטת תוחלת החיים מעורבת בחשיפות EDC כרוניות למבוגרים ומדדו את ההישרדות שלהם. עם זאת, תכונות חיים אלה יכולים גם להיות מושפעים על ידי כמה גורמים ניסיוניים כי צריך להיות נשלט בקפידה. לכן, בעבודה זו, אנו מציעים סדרה של הליכים שאנו ממוטבים עבור התוצאה הנכונה של אלה מספר. שיטות אלה מאפשרות למדענים להקים שיבוש אנדוקריניות עבור כל EDC או לתערובת של מחשבי ה-Edc שונים בדרוזוהילה, למרות שכדי לזהות את המנגנון האנדוקרינית האחראי לאפקט, ניתן יהיה לדרוש חיבורים נוספים.

בסעיף זה, מדווחים שלבי המפתח של הפרוטוקולים הנ ל בצורה של סכימות פשוטות יותר. בהינתן כי זבובים נוטים להימנע תרכובות טעים, הדבר הראשון לעשות הוא לקבוע את הטעם של EDC נבחר. זה יכול להיעשות על ידי ערבוב של צביעה מזון (למשל, צבע אדום מאכל no. 40)35 עם המזון שיושלם עם edc נבחר במינונים שונים ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

המערכת האנדוקרינית (EDCs) מייצגת בעיה רצינית עבור אורגניזמים ובסביבות טבעיות. דרוזופילה מלאנוסטר מייצגת מודל אידיאלי לחקר אפקטי edc בvivo. כאן אנו מציגים שיטות לחקירת שיבוש המערכת האנדוקרינית בדרוזוהילה, לטיפול באפקטי EDC על פוריות, פוריות, תזמון התפתחותי ותוחלת חיים של הזבוב.

שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית בדרוזופילה מלאנוסטר

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster הוא מודל רב עוצמה כדי להעריך vivo את ההשפעות הרעילות והאנדוקריניות הפוטנציאליות של כימיקלים, כגון משבשים אנדוקריניים, המייצגים בעיה רצינית לבריאות האדם וסביבות טבעיות. טיפול בהשפעה של EDCs על תכונות החיים ההורמונליות של הזבוב, כגון פוריות, פוריות, זמן התפתחותי ותוחלת החיים. זוהי דרך קלה, זולה ומהירה לחקור הפרעה אנדוקרינית ב vivo.הפוריות, ההתפתחות ותוחלת החיים בדרוסופילה יכולים להיות מושפעים ממספר גורמים שיש לשלוט בהם בקפידה כדי להבטיח את התוצאה המוצלחת של פרוטוקול זה. לכן, נדרשת תשומת לב מרבית לגידול וטיפול בזבובים. כדי להתוות את הטעם של EDC שנבחר, לאחר הרדמה, להעביר 15 זבובים צעירים ממיטת הזבוב לארבעה בקבוקונים מקבילים המכילים מדיום קמח תירס מעורבב עם צבעי מזון.בקבוקון הבקרה מכיל את הממס בלבד, ושלושת הבקבוקונים האחרים מתווספים במינונים שונים של ה- EDCs שנבחרו. שמרו את הבקבוקונים באינקובטור לח ליום אחד עם אור טבעי של 12 שעות. לאחר הרדמה של הזבובים שוב, העבר את הזבובים משותקים לנייר לבן, והצב אותו תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי להתבונן.השווה את צביעת הבטן של כל קבוצת טיפול ביחס לקבוצת הביקורת. כדי להתבנות את ביצועי הרבייה של הזבובים, להכין שלושה בקבוקונים של זבובים עבור כל EDC כמו בקבוקונים הורים, עם שמונה נקבות וארבעה זכרים ב 10 מיליליטר של מדיום קמח תירס בתוספת EE2. לשליטה, להכין שישה בקבוקונים של זבובים, כל אחד עם שמונה נקבות וארבעה זכרים ב 10 מיליליטר של מזון בינוני קמח תירס בתוספת ממס EE2.אחורי זבובים באינקובטור ב 25 מעלות צלזיוס. במהלך התפתחותם, הימנע צפיפות הזחלים. לאחר ארבעה ימים, להפוך כל בקבוקון על אתר כדי להסיר את ההורים ולהחזיר את הבקבוקונים לאינקובטור במשך חמישה ימים נוספים.בשעות אחר הצהריים המאוחרות של היום התשיעי, הפוך כל בקבוקון מעל אתרייזר כדי להסיר את כל הזבובים החדשים שיצאו מהבקבוקונים ולשים את הבקבוקונים באינקובטור אחר ב 18 מעלות צלזיוס לילה. בבוקר יום 10, בתחנת עבודה של דרוסופילה פחמן דו חמצני, בזהירות להפוך את בקבוקון התרבות כדי למנוע זבובים הרדמה ליפול על בינוני ולהכניס צינור גומי עם מחט לתוך הבקבוקון בין פקק הכותנה וקיר הבקבוקון. פתח את השסתום כדי לספק פחמן דו חמצני.תוך שניות ספורות, העבר את הזבובים למיטת זבוב מתחת למיקרוסקופ. לאסוף נקבות בתולות זכרים צעירים בנפרד לשתי קבוצות על מיטת הזבוב. באופן אקראי subdivide כל קבוצה של זבובים בקבוצות משנה קטנות, עם 10 נקבות או 20 זכרים לכל בקבוקון מלא בינוני קמח תירס מתאים טרי.המשך הדגירה ולאסוף 30 נקבות בתולות ו 30 זכרים עבור כל EDC, ו 90 נקבות בתולה ו 90 זכרים לשליטה. שכן קבוצות אלה של זבובים ב 25 מעלות צלזיוס עד שהם גיל ארבעה ימים לאחר eclosion. ואז להעביר אותם בקבוקונים חדשים המכילים מדיום מתאים טרי כל יומיים.בדוק שאין זחלים בבקבוקונים של נקבות. לאחר מכן תייג בקבוקונים עם סדרה שונה של מספרים רציפים לטיפול הבא. לאחר הרדמה, להעביר נקבה אחת EE2 ממיס מטופל לתוך בקבוקון קטן המכיל עגבניות קמח טרי מדיום ללא EE2 ולהוסיף אחד EE2 ממיס מטופלים זכר עבור הפקד על פני.התאם זכר שטופל ב-EE2 עם נקבה שטופלה בממס EE2 או נקבה שטופלה ב-EE2 עם זכר שטופל בממס EE2 לכל טיפול. בית 20 צלבים בודדים ב-25 מעלות צלזיוס. מעבירים כל זוג הזדווגות לבקבוקונים בינוניים של עגבניות קמח תירס טריות ללא EDC כל יום במשך 10 הימים הבאים.ויזואלית לבדוק כל בקבוקון כל יום עבור הביצים ולדווח על מספרם על גיליון אלקטרוני פוריות. בכל בקבוקון, בדוק מקרוב אם יש זבובים שזה עתה הופיעו ורשם את המספר היומי של צאצאים בוגרים במהלך 10 הימים. לאחר 10 ימים מההזדווגות הראשונית, יש להסיר את ההורים מסדרת הבקבוקונים האחרונה.בפרוטוקולים של אקלוזה, ראשית, עבור כל קבוצת טיפול, הקימו 10 בקבוקונים של זבובים צעירים ובריאים בני פחות מיומיים, כל אחד עם שש נקבות ושלושה זכרים ב -10 מיליליטר של מזון קמח תירס ללא EDC. לגדל את הזבובים על מזון במשך 24 שעות ולאפשר להם להזדווג. לאחר מכן להכין עוד 10 בקבוקונים מקבילים לכל קבוצת טיפול עם 10 מיליליטר כל מזון קמח תירס טרי בתוספת ריכוזי EDC שונים או ממס EE2 לבד לבקרה.העבר את הזבובים ההמומים לבקבוקונים החדשים האלה. הפוך גיליון אלקטרוני התפתחותי כדי להקליט את הסדרות השונות. אפשר לזבובים להטיל ביצים במשך 16 שעות.לאחר מכן, להסיר את ההורים מן הבקבוקונים. דגירה הבקבוקונים ב 25 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים, או עד זחלים נודדים גלויים. בכל יום, לספור את מספר הגלימות החדשות בכל בקבוקון על ידי כתיבת מספר ברצף על ידי כל גולם בצד החיצוני של הבקבוקון, כדי למנוע לספור את אותו גלמה פעמיים.דווח על מספר הגלם החדש שהתגלה במשך שלושה עד ארבעה ימים, או עד שלא יהיה עוד צורת גלם. החל מהיום התשיעי, לספור את מספר המבוגרים המתעוררים מדי יום, עד לא יותר מבוגרים להגיח. דווח על כך בגיליון האלקטרוני ההתפתחותי ובצע את שאר בדיקת האקלוזה על פי כתב היד.בפרוטוקול תוחלת החיים, הקימו תחילה 20 בקבוקונים עם שמונה נקבות וארבעה זכרים, שכל אחד מהם מלא ב-10 מיליליטר של מזון קמח תירס ושכן אותם ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר ארבעה ימים, השליכו את הזבובים והחזרו את הבקבוקונים לאנקובטור. בשעות אחר הצהריים המאוחרות של היום התשיעי, הסירו את כל הזבובים החדשים שיצאו מהבקבוקונים והחזירו את הבקבוקונים לאנקובטור.לאחר 16 עד 24 שעות, מחלקים 250 זבובים בוגרים בני יום אחד משני המינים לארבע קבוצות תחת הרדמה קלה של פחמן דו חמצני ומעבירים אותם לבקבוקים של 250 מיליליטר המכילים מזון בינוני למבוגרים, שלושה בתוספת ריכוזי EDC שונים ואחד עם ממס EE2 בלבד. לשמור על הזבובים ב 25 מעלות צלזיוס במשך יומיים עד שלושה ימים כדי לאפשר להם להזדווג. לאחר מכן, מיין כל קבוצה של זבובים לפי מין לשתי קבוצות.בתוך כל מצב טיפול, עבור שני המינים, באופן אקראי subdivide כל קבוצה לחמישה בקבוקונים מקבילים בצפיפות של 20 אנשים לכל בקבוקון. הכינו גיליון אלקטרוני של תוחלת חיים שבו מספר הזבובים המתים מנוטרל ממספר הזבובים ששרדו מההעברה הקודמת, כך שמספר הניצולים בכל העברה מתקבל באופן אוטומטי. לאחר שלושה ימים, להעביר את הזבובים ללא הרדמה בקבוקונים חדשים המכילים את המזון המתאים באותו זמן ולבדוק את המוות.רשום את גיל הזבובים ואת מספר הזבובים המתים. חזור על ההעברה כל שלושה ימים עד שכל הזבובים ימותו. בניסוי זה, עקומות תוחלת החיים התווה כמו הישרדות מצטברת לעומת הימים שחלפו עבור כל ריכוז EDC ואת השליטה.עבור הבקרה, לאחר תקופה ראשונית ארוכה שבה עקומת הניצולים נותרה גבוהה יחסית, היא ירדה באופן אקספוננציאלי לאחר כ-60 יום. בעקבות חשיפת EDC, עקומת הניצול של הזבובים המטופלים הושפעה באופן משמעותי והראתה ירידה דרמטית לאחר 36 ימים. מומלץ על כך בקבוקונים מקבילים תחת ניתוח צריך להיות דומה מאוד, אחרת זה יהיה קשה להבין איזה להשליך.לכן, אנו ממליצים לנהוג בזהירות רבה, לאמץ תרגול ניסיוני טוב, באמצעות גודל מדגם גדול. בעקבות פרוטוקולים אלה, ניתן גם להעריך את ההשפעה הטרנסג'נדרית של משבש אנדוקריני נבחר, כמו גם לבדוק את ההשפעות התוסף הפוטנציאלי של שילוב של משבשים אנדוקריניים שונים.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

גידול זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתנאי Axenic ו Gnotobiotic

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

הדמיה צמחי מוח חיים מזחלי Drosophila melanogaster זחלי Instar שלישי

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

מחבר Spotlight: Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila larval brain explants 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...