Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
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Gli autori ringraziano Orsolina Petillo per il supporto tecnico. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Mariarosaria Aletta (CNR) per il supporto bibliografico. Gli autori ringraziano il Dr. Gustavo Damiano Mita per averli introdotti nel mondo EDC. Gli autori ringraziano Leica Microsystems e Pasquale Romano per il loro aiuto. Questa ricerca è stata supportata dal progetto PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Zzie Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Progetto PO FESR Campania 2007-2013 "NANO PERTECNOLOGIE O SOLAVOLTAO VOLTA E MOLECOLE BIO-ATTIVE NANO".

1. Preparazione degli alimenti
<ol><li>
Per la manutenzione delle scorte e per la crescita larvale, utilizzare un mezzo di farina di mais contenente lievito in polvere del 3%, il 10 % di saccarosio, il 9 % di farina di mais precotta, lo 0,4% di agar, successivamente chiamato Cornmeal medium (CM).
	<ol>
<li>Mettere 30 g di lievito in 100 mL di acqua di rubinetto, portarla a ebollizione e far bollire per 15 min.</li>
		<li>Separatamente, mescolare bene 90 g di farina di mais precotta, 100 g di zucchero e...

Il fly d. melanogaster è stato ampiamente impiegato come sistema modello in vivo per studiare i potenziali effetti di EDC ambientali come DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33ed EE234. Diverse ragioni hanno portato il suo utilizzo come modello in questo campo di ricerca. A parte i suoi indiscussi vantaggi come sistema ...

Le attività umane hanno rilasciato nell'ambiente una massiccia quantità di sostanze chimiche, che rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ecosistemi naturali1. Di questi inquinanti, si stima che circa 1.000 sostanze chimiche diverse possano alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini; in base a questa proprietà, sono classificati come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). In particolare, sulla base di una recente definizione della Società Endocrina, i CED sono "una sostanza chimica esogena, o miscela di sostanze chimiche, che può interferire con qualsiasi aspetto dell'azione ormonale"2. Negli ultimi tre decenni, ci sono state sempre più prove scientifiche che i CED possono influenzare la riproduzione e lo sviluppo di animali e piante3,4,5,6,7, 8. Ulteriormente, l'esposizione alla CED è stata correlata alla crescente prevalenza di alcune malattie umane, tra cui il cancro, l'obesità, il diabete, le malattie della tiroide e i disturbi comportamentali9,10,11.
Meccanismi generali di EdC
A causa delle loro proprietà molecolari, gli EDC si comportano come ormoni o precursori ormonali3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. In questo senso, possono legarsi al recettore di un ormone e interrompere i sistemi endocrini sia imitando l'attività ormonale o bloccando l'attacco di ormoni endogeni. Nel primo caso, dopo il legame al recettore, possono attivarlo come farebbe il suo ormone naturale. Nell'altro caso, il legame della CED al recettore impedisce il legame del suo ormone naturale, quindi il recettore è bloccato e non può più essere attivato, anche in presenza del suo ormone naturale3. Di conseguenza, gli EDC possono influenzare diversi processi, come la sintesi, la secrezione, il trasporto, il metabolismo o l'azione periferica di ormoni endogeni che sono responsabili del mantenimento dell'omeostasi, della riproduzione, dello sviluppo e/o del comportamento l'organismo. L'associazione del recettore non è l'unico modo di agire descritto finora per gli EDC. Ora è chiaro che possono anche agire reclutando coattivatori o corepressor in percorsi enzimatici o modificando marcatori epigenetici che deregolamentano l'espressione genica10,11,12,13 ,14, con conseguenze non solo per la generazione attuale ma anche per la salute delle generazioni a venire8.
Ormoni della drosofilia
I potenziali effetti di EDC selezionati sono stati studiati ampiamente, sia nelle specie selvatiche che in diversi sistemi modello in cui i meccanismi endocrini sono ragionevolmente ben noti. Per gli invertebrati, i sistemi endocrini che influenzano la crescita, lo sviluppo e la riproduzione sono stati ampiamente caratterizzati negli insetti per diversi motivi, coinvolgendo il loro ampio uso nel campo della ricerca biologica, la loro importanza economica e infine lo sviluppo di insetticidi in grado di interferire specificamente con il sistema ormonale degli insetti parassiti.
In particolare, tra gli insetti, il viafrutto della frutta D. melanogaster si è dimostrato un sistema modello molto potente per valutare i potenziali effetti endocrini degli EDC. In D. melanogaster, così come nei vertebrati, gli ormoni svolgono un ruolo importante durante l'intero ciclo di vita. In questo organismo, ci sono tre principali sistemi ormonali, che coinvolgono l'ormone steroide 20-idrossiecdysone (20E)15,16, l'ormone giovanile sesprorpenoide (JH)17, e i neuropeptidi e peptidi/ proteine ormoni18. Questo terzo gruppo è costituito da diversi peptidi scoperti più di recente ma chiaramente coinvolti in una grande varietà di processi fisiologici e comportamentali, come longevità, omeostasi, metabolismo, riproduzione, memoria e controllo locomotore. 20E è omologa agli ormoni steroidei derivati dal colesterolo come estradiolo, mentre JH condivide alcune somiglianze con acido retinoico; entrambi sono gli ormoni più noti in Drosophila19,20. Il loro equilibrio è fondamentale nel coordinare la fiscie e la metamorfosi, nonché nel controllo di diversi processi post-sviluppo, come la riproduzione, la durata della vita e il comportamento21,offrendo così diverse possibilità di testare l'endocrino perturbazione nella Drosophila. Inoltre, gli ormoni ecriosteroidi e JH sono i principali bersagli dei cosiddetti insetticidi di terza generazione, sviluppati per interferire con i processi mediati endocrini dello sviluppo e riproduttivi negli insetti. La modalità d'azione agonista o antagonista di queste sostanze chimiche è ben nota, e quindi possono servire come standard di riferimento per valutare gli effetti dei potenziali EDC sulla crescita, la riproduzione e lo sviluppo degli insetti22. Ad esempio, il methoprene, che è stato ampiamente utilizzato nel controllo di zanzare e altri insetti acquatici23,24, funziona come un agonista JH e reprime la trascrizione genica e la metamorfosi indotta da 20E.
Oltre agli ormoni, la superfamiglia del recettore nucleare (NR) nella Drosophila è anche ben nota; è costituito da 18 fattori di trascrizione evolutivamente conservati coinvolti nel controllo dei percorsi evolutivi dipendenti dall'ormone, così come la riproduzione e la fisiologia25. Questi NR ormone appartengono a tutti i sei sottotipi di superfamiglia NR, compresi quelli coinvolti nella neurotrasmissione26, due per gli acido retinoico NRs, e quelli per gli steroidi NRs che, nei vertebrati, rappresentano uno degli obiettivi primari di EDC27.
La Drosophila come sistema modello per studiare gli EDC
Attualmente, sulla base di proprietà molecolari, diverse agenzie ambientali in tutto il mondo stanno attribuendo il potenziale di interferire con i sistemi endocrini a diverse sostanze chimiche artificiali. Dato che i CED sono un problema globale e onnipresente per l'ambiente e per gli organismi, l'obiettivo generale della ricerca in questo campo è ridurre il loro onere della malattia, nonché proteggere gli organismi viventi dai loro effetti negativi. Al fine di approfondire la comprensione circa i potenziali effetti endocrini di una sostanza chimica, è necessario testarlo in vivo. A tal fine, D. melanogaster rappresenta un sistema di modelli valido. Ad oggi, la mosca della frutta è stata ampiamente utilizzata come modello in vivo per valutare gli effetti di diversi EDC ambientali; è stato riferito che l'esposizione a diversi EDC, come lo ftalato diaill (DBP)28, il bisfenolo A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, metilparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31 32, bis-(2-ethylhexyl) ftalato (DEHP)33, e 17-ethinylestradiol (EE2)34, influenza il metabolismo e le funzioni endocrine come nei modelli vertebrati. Diverse ragioni hanno portato al suo utilizzo come modello in questo campo di ricerca. Al di là di un'ottima conoscenza dei suoi sistemi endocrini, ulteriori vantaggi includono il suo breve ciclo di vita, il basso costo, il genoma facilmente manipolabile, una lunga storia di ricerca e diverse possibilità tecniche (vedi il sito web FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster fornisce anche un potente modello per studiare facilmente gli effetti transgenerazionali e le risposte della popolazione ai fattori ambientali8 ed evita le questioni etiche rilevanti per gli studi in vivo su animali superiori. Inoltre, la mosca della frutta condivide un alto grado di conservazione genica con gli esseri umani che potrebbe consentire ai saggi della Dnosophila EDC di aiutare a prevedere o suggerire potenziali effetti di queste sostanze chimiche per la salute umana. Oltre ad ampliare la comprensione degli effetti sulla salute umana, la Drosophila può contribuire a valutare i rischi di esposizione della CED all'ambiente, come la perdita di biodiversità e il degrado ambientale. Infine, la mosca della frutta offre il vantaggio aggiuntivo di essere utilizzata nei laboratori, dove i fattori che potenzialmente influenzano il suo sviluppo, la riproduzione e la durata della vita possono essere tenuti sotto controllo al fine di attribuire qualsiasi variazione alla sostanza da testare.
Con questo in mente, abbiamo ottimizzato semplici e robusti saggi di fitness per determinare gli effetti EDC su alcuni tratti ormonali della Drosophila, come la fecondità/fertilità, i tempi di sviluppo e la durata della vita adulta. Questi saggi sono stati ampiamente utilizzati per alcuni EDC23,24,25,26,27. In particolare, abbiamo utilizzato i seguenti protocolli per valutare gli effetti dell'esposizione all'estrogeno sintetico EE234 e al BPA e al bisfenolo AF (BPA F) (dati inediti). Questi protocolli possono essere facilmente modificati per studiare gli effetti di un dato EDC alla volta, così come gli effetti combinati di più EDC in D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

Negli ultimi anni ci sono state sempre più prove che tutti gli organismi e l'ambiente sono esposti a sostanze chimiche ormonali-come, noto come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). Queste sostanze chimiche possono alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini e portare a effetti negativi, nonché un numero crescente di disturbi ormonali nella popolazione umana o una crescita disturbata e una minore riproduzione nelle specie selvatiche. Per alcuni EDC, ci sono documentati effetti sulla salute e restrizioni sul loro uso. Tuttavia, per la maggior parte di loro, non c'è ancora alcuna prova scientifica in questo senso. Al fine di verificare potenziali effetti endocrini di una sostanza chimica nel tutto l'organismo, abbiamo bisogno di testarlo in sistemi modello appropriati, così come nel filo della frutta, Drosophila melanogaster. Qui riportiamo protocolli dettagliati in vivo per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità/fertilità, sui tempi di sviluppo e sulla durata della vita della mosca. Negli ultimi anni, abbiamo usato questi tratti della vita della Drosophila per studiare gli effetti dell'esposizione al 17-e-ethinylestradiol (EE2), al bisfenolo A (BPA) e al bisfenolo AF (BPA F). Complessivamente, questi saggi hanno coperto tutte le fasi della vita della Drosophila e hanno permesso di valutare la perturbazione endocrina in tutti i processi mediati dall'ormone. I saggi di fedia/fertilità e tempistica dello sviluppo sono stati utili per misurare l'impatto della CED sulle prestazioni riproduttive delle mosche e sugli stadi dello sviluppo, rispettivamente. Infine, il saggio della durata della vita ha coinvolto esposizioni croniche di EDC agli adulti e ha misurato la loro sopravvivenza. Tuttavia, questi tratti di vita possono anche essere influenzati da diversi fattori sperimentali che dovevano essere attentamente controllati. Quindi, in questo lavoro, suggeriamo una serie di procedure che abbiamo ottimizzato per il giusto risultato di questi saggi. Questi metodi consentono agli scienziati di stabilire interruzioni endocrine per qualsiasi EDC o per una miscela di diversi EDC in Drosophila, anche se per identificare il meccanismo endocrino responsabile dell'effetto, potrebbero essere necessari ulteriori saggi.

In questa sezione, i passaggi chiave dei protocolli di cui sopra sono riportati sotto forma di schemi semplificati. Dato che le mosche tendono ad evitare composti sgradevoli, la prima cosa da fare è quello di testare il gusto della CED selezionata. Questo può essere fatto mescolando una colorazione alimentare (ad esempio, colorante alimentare rosso n. 40)35 con il cibo integrato con l'EDC selezionato a varie dosi o con il solvente da solo. Le mosche alimentate su questi mezzi di comunicazione so...

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Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Le sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC) rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ambienti naturali. La Drosophila melanogaster rappresenta un modello ideale per studiare gli effetti della CED in vivo. Qui, presentiamo metodi per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità, la fertilità, i tempi di sviluppo e la durata della vita della mosca.

Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster è un modello potente per valutare in vivo i potenziali effetti tossici ed endocrini delle sostanze chimiche, come gli interferenti endocrini, che rappresentano un grave problema per la salute umana e gli ambienti naturali. Affrontare l'effetto degli EDC sui tratti ormonali della vita della mosca, come la fecondità, la fertilità, il tempo di sviluppo e la durata della vita. È un modo semplice, economico e veloce per indagare sull'alterazione endocrina in vivo.La fertilità, lo sviluppo e la durata della vita in Drosophila possono essere influenzati da diversi fattori che devono essere attentamente controllati per garantire il risultato positivo di questo protocollo. Pertanto, è richiesta la massima attenzione nell'allevamento e nella movimentazione delle mosche. Per saggiare il gusto dell'EDC selezionato, dopo l'anestesia, trasferire 15 giovani mosche dal letto di mosca a quattro fiale parallele contenenti mezzo farina di mais mescolato con una colorazione alimentare.La fiala di controllo contiene il solo solvente e le altre tre fiale sono integrate con diverse dosi degli EDC selezionati. Conservare le fiale in un'incubatrice umidificata per un giorno con una luce naturale di 12 ore. Dopo aver anestetizzato di nuovo le mosche, trasferisci le mosche immobilizzate su un foglio bianco e posizionalo sotto un microscopio stereo da osservare.Confrontare la colorazione addominale di ogni gruppo di trattamento rispetto al gruppo di controllo. Per saggiare le prestazioni riproduttive delle mosche, preparare tre fiale di mosche per ogni EDC come fiale parentali, con otto femmine e quattro maschi in 10 millilitri di mezzo farina di mais integrati con EE2. Per il controllo, preparare sei fiale di mosche, ognuna con otto femmine e quattro maschi in 10 millilitri di cibo medio farina di mais integrato con solvente EE2.La parte posteriore vola in un'incubatrice a 25 gradi Celsius. Durante il loro sviluppo, evitare il sovraffollamento delle larve. Dopo quattro giorni, inverti ogni flaconcino su un etere per rimuovere i genitori e restituire le fiale all'incubatrice per altri cinque giorni.Nel tardo pomeriggio del nove giorno, inverti ogni fiala su un etherizer per rimuovere tutte le mosche appena emerse dalle fiale e metti le fiale in un altro incubatore a 18 gradi Celsius durante la notte. La mattina del giorno 10, su una stazione di lavoro di anidride carbonica Drosophila, invertire attentamente la fiala di coltura per evitare che le mosche anestetizzate cadano su medie e inserire un tubo di gomma con un ago nel flaconcino tra il tappo di cotone e la parete del flaconcino. Aprire la valvola per fornire anidride carbonica.In pochi secondi, trasferisci le mosche su un letto a mosca al microscopio. Raccogli separatamente femmine vergini e giovani maschi in due gruppi sul letto di mosca. Suddividere casualmente ogni gruppo di mosche in piccoli sottogruppi, con 10 femmine o 20 maschi per fiala riempiti con mezzo di farina di mais corrispondente fresco.Continua l'incubazione e raccogli 30 femmine vergini e 30 maschi per ogni EDC, e 90 femmine vergini e 90 maschi per il controllo. Ospita questi gruppi di mosche a 25 gradi Celsius fino a quando non hanno un'età di quattro giorni dopo l'esclusione. Quindi trasferirli in nuove fiale contenenti mezzo fresco corrispondente ogni due giorni.Controlla che non ci siano larve nelle fiale delle femmine. Quindi etichettare fiale con una diversa serie di numeri sequenziali per il seguente trattamento. Dopo l'anestesia, trasferire una femmina trattata con solvente EE2 in una piccola fiala contenente mezzo di pomodoro fresco di farina di mais senza EE2 e aggiungere un maschio trattato con solvente EE2 per il controllo.Abbina un maschio trattato con EE2 a una femmina trattata con solvente EE2 o una femmina trattata con EE2 con un maschio trattato con solvente EE2 per ogni trattamento. Casa 20 croci singole a 25 gradi Celsius. Trasferire ogni coppia di accoppiamento su fiale medie di pomodoro di farina di mais fresco senza EDC ogni giorno per i successivi 10 giorni.Ispezionare visivamente ogni fiala ogni giorno per le uova e segnalare il loro numero sul foglio di calcolo della fertilità. In ogni fiala, controlla attentamente le mosche appena emerse e registra il numero giornaliero di progenie adulte nel periodo di 10 giorni. Dopo 10 giorni dall'accoppiamento iniziale, rimuovere i genitori dall'ultima serie di fiale.Nei protocolli di dosaggio dell'eclosion, in primo luogo, per ogni gruppo di trattamento, impostare 10 fiale di mosche giovani e sane di meno di due giorni, ognuna con sei femmine e tre maschi in 10 millilitri di cibo di farina di mais senza EDC. Alleva le mosche sul cibo per 24 ore e consenti loro di accoppiarsi. Quindi preparare altri 10 flaconcini paralleli per gruppo di trattamento con 10 millilitri ciascuno di alimenti freschi di farina di mais integrati con diverse concentrazioni di EDC o il solo solvente EE2 per il controllo.Trasferisci le mosche accoppiate a queste nuove fiale. Creare un foglio di calcolo di sviluppo per registrare le diverse serie. Consentire alle mosche di deporre le uova per 16 ore.Quindi, rimuovere i genitori dalle fiale. Incubare le fiale a 25 gradi Celsius per tre o quattro giorni o fino a quando le larve errante sono visibili. Ogni giorno, conta il numero di nuove pupe in ogni fiala scrivendo un numero in sequenza da ogni pupa all'esterno della fiala per evitare di contare la stessa pupa due volte.Segnala il numero di pupe appena emerse per tre o quattro giorni, o fino a quando non si formano più pupe. A partire dal nonno giorno, conta il numero di adulti emergenti ogni giorno, fino a quando non emergono più adulti. Segnalalo sul foglio di calcolo dello sviluppo ed esegui il resto del saggio di eclosion secondo il manoscritto.Nel protocollo lifespan, prima impostare 20 fiale con otto femmine e quattro maschi, ognuno riempito con 10 millilitri di cibo farina di mais e ospitarli a 25 gradi Celsius. Dopo quattro giorni, scartare le mosche e riposizionare le fiale nell'incubatrice. Nel tardo pomeriggio della nona giornata, rimuovere tutte le mosche appena emerse dalle fiale e riportare le fiale all'incubatrice.Dopo 16-24 ore, dividi le mosche adulte di un giorno di entrambi i sessi in quattro gruppi sotto l'anestesia leggera di anidride carbonica e trasferiscile in bottiglie da 250 millilitri contenenti cibo medio adulto, tre integrate con diverse concentrazioni di EDC e una con il solo solvente EE2. Mantenere le mosche a 25 gradi Celsius per due o tre giorni per consentire loro di accoppiarsi. Quindi, ordina ogni coorte di mosche per sesso in due gruppi.All'interno di ogni condizione di trattamento, per entrambi i sessi, suddividere casualmente ogni gruppo in cinque flaconcini paralleli ad una densità di 20 individui per flaconcino. Preparare un foglio di calcolo della durata della vita in cui il numero di mosche morte viene sottratto dal numero di mosche sopravvissute dal trasferimento precedente, in modo che il numero di sopravvissuti ad ogni trasferimento sia automaticamente ottenuto. Dopo tre giorni, trasferisci le mosche senza anestesia in nuove fiale contenenti il cibo corrispondente allo stesso tempo e controlla la morte.Registra l'età delle mosche e il numero di mosche morte. Ripeti il trasferimento ogni tre giorni fino a quando tutte le mosche muoiono. In questo esperimento, le curve di durata della vita sono state tracciate come la survivorship cumulativa rispetto ai giorni trascorsi per ogni concentrazione EDC e il controllo.Per il controllo, dopo un lungo periodo iniziale in cui la curva di superstiti è rimasta relativamente alta, è diminuita esponenzialmente dopo circa 60 giorni. A seguito dell'esposizione all'EDC, la curva di sopravvissutità delle mosche trattate è stata influenzata in modo significativo e ha mostrato un drastico declino dopo 36 giorni. Si consiglia di notare che le fiale parallele in fase di analisi dovrebbero essere molto simili, altrimenti sarà difficile capire quale scartare.Pertanto, suggeriamo di prestare molta attenzione, adottando una buona pratica sperimentale, utilizzando una grande dimensione del campione. Seguendo questi protocolli, è anche possibile valutare l'impatto transgenerazionale di un interferente endocrino selezionato e testare i potenziali effetti additivi di una combinazione di diversi interferenti endocrini.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

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Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Ricerca

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