Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Gli autori ringraziano Orsolina Petillo per il supporto tecnico. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Mariarosaria Aletta (CNR) per il supporto bibliografico. Gli autori ringraziano il Dr. Gustavo Damiano Mita per averli introdotti nel mondo EDC. Gli autori ringraziano Leica Microsystems e Pasquale Romano per il loro aiuto. Questa ricerca è stata supportata dal progetto PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Zzie Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Progetto PO FESR Campania 2007-2013 "NANO PERTECNOLOGIE O SOLAVOLTAO VOLTA E MOLECOLE BIO-ATTIVE NANO".

1. Preparazione degli alimenti
<ol><li>
Per la manutenzione delle scorte e per la crescita larvale, utilizzare un mezzo di farina di mais contenente lievito in polvere del 3%, il 10 % di saccarosio, il 9 % di farina di mais precotta, lo 0,4% di agar, successivamente chiamato Cornmeal medium (CM).
	<ol>
<li>Mettere 30 g di lievito in 100 mL di acqua di rubinetto, portarla a ebollizione e far bollire per 15 min.</li>
		<li>Separatamente, mescolare bene 90 g di farina di mais precotta, 100 g di zucchero e...

Il fly d. melanogaster è stato ampiamente impiegato come sistema modello in vivo per studiare i potenziali effetti di EDC ambientali come DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33ed EE234. Diverse ragioni hanno portato il suo utilizzo come modello in questo campo di ricerca. A parte i suoi indiscussi vantaggi come sistema ...

Le attività umane hanno rilasciato nell'ambiente una massiccia quantità di sostanze chimiche, che rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ecosistemi naturali1. Di questi inquinanti, si stima che circa 1.000 sostanze chimiche diverse possano alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini; in base a questa proprietà, sono classificati come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). In particolare, sulla base di una recente definizione della Società Endocrina, i CED sono "una sostanza chimica esogena, o miscela di sostanze chimiche, che può interferire con qualsiasi aspetto dell'azione ormonale"2. Negli ultimi tre decenni, ci sono state sempre più prove scientifiche che i CED possono influenzare la riproduzione e lo sviluppo di animali e piante3,4,5,6,7, 8. Ulteriormente, l'esposizione alla CED è stata correlata alla crescente prevalenza di alcune malattie umane, tra cui il cancro, l'obesità, il diabete, le malattie della tiroide e i disturbi comportamentali9,10,11.
Meccanismi generali di EdC
A causa delle loro proprietà molecolari, gli EDC si comportano come ormoni o precursori ormonali3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. In questo senso, possono legarsi al recettore di un ormone e interrompere i sistemi endocrini sia imitando l'attività ormonale o bloccando l'attacco di ormoni endogeni. Nel primo caso, dopo il legame al recettore, possono attivarlo come farebbe il suo ormone naturale. Nell'altro caso, il legame della CED al recettore impedisce il legame del suo ormone naturale, quindi il recettore è bloccato e non può più essere attivato, anche in presenza del suo ormone naturale3. Di conseguenza, gli EDC possono influenzare diversi processi, come la sintesi, la secrezione, il trasporto, il metabolismo o l'azione periferica di ormoni endogeni che sono responsabili del mantenimento dell'omeostasi, della riproduzione, dello sviluppo e/o del comportamento l'organismo. L'associazione del recettore non è l'unico modo di agire descritto finora per gli EDC. Ora è chiaro che possono anche agire reclutando coattivatori o corepressor in percorsi enzimatici o modificando marcatori epigenetici che deregolamentano l'espressione genica10,11,12,13 ,14, con conseguenze non solo per la generazione attuale ma anche per la salute delle generazioni a venire8.
Ormoni della drosofilia
I potenziali effetti di EDC selezionati sono stati studiati ampiamente, sia nelle specie selvatiche che in diversi sistemi modello in cui i meccanismi endocrini sono ragionevolmente ben noti. Per gli invertebrati, i sistemi endocrini che influenzano la crescita, lo sviluppo e la riproduzione sono stati ampiamente caratterizzati negli insetti per diversi motivi, coinvolgendo il loro ampio uso nel campo della ricerca biologica, la loro importanza economica e infine lo sviluppo di insetticidi in grado di interferire specificamente con il sistema ormonale degli insetti parassiti.
In particolare, tra gli insetti, il viafrutto della frutta D. melanogaster si è dimostrato un sistema modello molto potente per valutare i potenziali effetti endocrini degli EDC. In D. melanogaster, così come nei vertebrati, gli ormoni svolgono un ruolo importante durante l'intero ciclo di vita. In questo organismo, ci sono tre principali sistemi ormonali, che coinvolgono l'ormone steroide 20-idrossiecdysone (20E)15,16, l'ormone giovanile sesprorpenoide (JH)17, e i neuropeptidi e peptidi/ proteine ormoni18. Questo terzo gruppo è costituito da diversi peptidi scoperti più di recente ma chiaramente coinvolti in una grande varietà di processi fisiologici e comportamentali, come longevità, omeostasi, metabolismo, riproduzione, memoria e controllo locomotore. 20E è omologa agli ormoni steroidei derivati dal colesterolo come estradiolo, mentre JH condivide alcune somiglianze con acido retinoico; entrambi sono gli ormoni più noti in Drosophila19,20. Il loro equilibrio è fondamentale nel coordinare la fiscie e la metamorfosi, nonché nel controllo di diversi processi post-sviluppo, come la riproduzione, la durata della vita e il comportamento21,offrendo così diverse possibilità di testare l'endocrino perturbazione nella Drosophila. Inoltre, gli ormoni ecriosteroidi e JH sono i principali bersagli dei cosiddetti insetticidi di terza generazione, sviluppati per interferire con i processi mediati endocrini dello sviluppo e riproduttivi negli insetti. La modalità d'azione agonista o antagonista di queste sostanze chimiche è ben nota, e quindi possono servire come standard di riferimento per valutare gli effetti dei potenziali EDC sulla crescita, la riproduzione e lo sviluppo degli insetti22. Ad esempio, il methoprene, che è stato ampiamente utilizzato nel controllo di zanzare e altri insetti acquatici23,24, funziona come un agonista JH e reprime la trascrizione genica e la metamorfosi indotta da 20E.
Oltre agli ormoni, la superfamiglia del recettore nucleare (NR) nella Drosophila è anche ben nota; è costituito da 18 fattori di trascrizione evolutivamente conservati coinvolti nel controllo dei percorsi evolutivi dipendenti dall'ormone, così come la riproduzione e la fisiologia25. Questi NR ormone appartengono a tutti i sei sottotipi di superfamiglia NR, compresi quelli coinvolti nella neurotrasmissione26, due per gli acido retinoico NRs, e quelli per gli steroidi NRs che, nei vertebrati, rappresentano uno degli obiettivi primari di EDC27.
La Drosophila come sistema modello per studiare gli EDC
Attualmente, sulla base di proprietà molecolari, diverse agenzie ambientali in tutto il mondo stanno attribuendo il potenziale di interferire con i sistemi endocrini a diverse sostanze chimiche artificiali. Dato che i CED sono un problema globale e onnipresente per l'ambiente e per gli organismi, l'obiettivo generale della ricerca in questo campo è ridurre il loro onere della malattia, nonché proteggere gli organismi viventi dai loro effetti negativi. Al fine di approfondire la comprensione circa i potenziali effetti endocrini di una sostanza chimica, è necessario testarlo in vivo. A tal fine, D. melanogaster rappresenta un sistema di modelli valido. Ad oggi, la mosca della frutta è stata ampiamente utilizzata come modello in vivo per valutare gli effetti di diversi EDC ambientali; è stato riferito che l'esposizione a diversi EDC, come lo ftalato diaill (DBP)28, il bisfenolo A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, metilparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31 32, bis-(2-ethylhexyl) ftalato (DEHP)33, e 17-ethinylestradiol (EE2)34, influenza il metabolismo e le funzioni endocrine come nei modelli vertebrati. Diverse ragioni hanno portato al suo utilizzo come modello in questo campo di ricerca. Al di là di un'ottima conoscenza dei suoi sistemi endocrini, ulteriori vantaggi includono il suo breve ciclo di vita, il basso costo, il genoma facilmente manipolabile, una lunga storia di ricerca e diverse possibilità tecniche (vedi il sito web FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster fornisce anche un potente modello per studiare facilmente gli effetti transgenerazionali e le risposte della popolazione ai fattori ambientali8 ed evita le questioni etiche rilevanti per gli studi in vivo su animali superiori. Inoltre, la mosca della frutta condivide un alto grado di conservazione genica con gli esseri umani che potrebbe consentire ai saggi della Dnosophila EDC di aiutare a prevedere o suggerire potenziali effetti di queste sostanze chimiche per la salute umana. Oltre ad ampliare la comprensione degli effetti sulla salute umana, la Drosophila può contribuire a valutare i rischi di esposizione della CED all'ambiente, come la perdita di biodiversità e il degrado ambientale. Infine, la mosca della frutta offre il vantaggio aggiuntivo di essere utilizzata nei laboratori, dove i fattori che potenzialmente influenzano il suo sviluppo, la riproduzione e la durata della vita possono essere tenuti sotto controllo al fine di attribuire qualsiasi variazione alla sostanza da testare.
Con questo in mente, abbiamo ottimizzato semplici e robusti saggi di fitness per determinare gli effetti EDC su alcuni tratti ormonali della Drosophila, come la fecondità/fertilità, i tempi di sviluppo e la durata della vita adulta. Questi saggi sono stati ampiamente utilizzati per alcuni EDC23,24,25,26,27. In particolare, abbiamo utilizzato i seguenti protocolli per valutare gli effetti dell'esposizione all'estrogeno sintetico EE234 e al BPA e al bisfenolo AF (BPA F) (dati inediti). Questi protocolli possono essere facilmente modificati per studiare gli effetti di un dato EDC alla volta, così come gli effetti combinati di più EDC in D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

Negli ultimi anni ci sono state sempre più prove che tutti gli organismi e l'ambiente sono esposti a sostanze chimiche ormonali-come, noto come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). Queste sostanze chimiche possono alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini e portare a effetti negativi, nonché un numero crescente di disturbi ormonali nella popolazione umana o una crescita disturbata e una minore riproduzione nelle specie selvatiche. Per alcuni EDC, ci sono documentati effetti sulla salute e restrizioni sul loro uso. Tuttavia, per la maggior parte di loro, non c'è ancora alcuna prova scientifica in questo senso. Al fine di verificare potenziali effetti endocrini di una sostanza chimica nel tutto l'organismo, abbiamo bisogno di testarlo in sistemi modello appropriati, così come nel filo della frutta, Drosophila melanogaster. Qui riportiamo protocolli dettagliati in vivo per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità/fertilità, sui tempi di sviluppo e sulla durata della vita della mosca. Negli ultimi anni, abbiamo usato questi tratti della vita della Drosophila per studiare gli effetti dell'esposizione al 17-e-ethinylestradiol (EE2), al bisfenolo A (BPA) e al bisfenolo AF (BPA F). Complessivamente, questi saggi hanno coperto tutte le fasi della vita della Drosophila e hanno permesso di valutare la perturbazione endocrina in tutti i processi mediati dall'ormone. I saggi di fedia/fertilità e tempistica dello sviluppo sono stati utili per misurare l'impatto della CED sulle prestazioni riproduttive delle mosche e sugli stadi dello sviluppo, rispettivamente. Infine, il saggio della durata della vita ha coinvolto esposizioni croniche di EDC agli adulti e ha misurato la loro sopravvivenza. Tuttavia, questi tratti di vita possono anche essere influenzati da diversi fattori sperimentali che dovevano essere attentamente controllati. Quindi, in questo lavoro, suggeriamo una serie di procedure che abbiamo ottimizzato per il giusto risultato di questi saggi. Questi metodi consentono agli scienziati di stabilire interruzioni endocrine per qualsiasi EDC o per una miscela di diversi EDC in Drosophila, anche se per identificare il meccanismo endocrino responsabile dell'effetto, potrebbero essere necessari ulteriori saggi.

In questa sezione, i passaggi chiave dei protocolli di cui sopra sono riportati sotto forma di schemi semplificati. Dato che le mosche tendono ad evitare composti sgradevoli, la prima cosa da fare è quello di testare il gusto della CED selezionata. Questo può essere fatto mescolando una colorazione alimentare (ad esempio, colorante alimentare rosso n. 40)35 con il cibo integrato con l'EDC selezionato a varie dosi o con il solvente da solo. Le mosche alimentate su questi mezzi di comunicazione so...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Le sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC) rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ambienti naturali. La Drosophila melanogaster rappresenta un modello ideale per studiare gli effetti della CED in vivo. Qui, presentiamo metodi per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità, la fertilità, i tempi di sviluppo e la durata della vita della mosca.

Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster è un modello potente per valutare in vivo i potenziali effetti tossici ed endocrini delle sostanze chimiche, come gli interferenti endocrini, che rappresentano un grave problema per la salute umana e gli ambienti naturali. Affrontare l'effetto degli EDC sui tratti ormonali della vita della mosca, come la fecondità, la fertilità, il tempo di sviluppo e la durata della vita. È un modo semplice, economico e veloce per indagare sull'alterazione endocrina in vivo.La fertilità, lo sviluppo e la durata della vita in Drosophila possono essere influenzati da diversi fattori che devono essere attentamente controllati per garantire il risultato positivo di questo protocollo. Pertanto, è richiesta la massima attenzione nell'allevamento e nella movimentazione delle mosche. Per saggiare il gusto dell'EDC selezionato, dopo l'anestesia, trasferire 15 giovani mosche dal letto di mosca a quattro fiale parallele contenenti mezzo farina di mais mescolato con una colorazione alimentare.La fiala di controllo contiene il solo solvente e le altre tre fiale sono integrate con diverse dosi degli EDC selezionati. Conservare le fiale in un'incubatrice umidificata per un giorno con una luce naturale di 12 ore. Dopo aver anestetizzato di nuovo le mosche, trasferisci le mosche immobilizzate su un foglio bianco e posizionalo sotto un microscopio stereo da osservare.Confrontare la colorazione addominale di ogni gruppo di trattamento rispetto al gruppo di controllo. Per saggiare le prestazioni riproduttive delle mosche, preparare tre fiale di mosche per ogni EDC come fiale parentali, con otto femmine e quattro maschi in 10 millilitri di mezzo farina di mais integrati con EE2. Per il controllo, preparare sei fiale di mosche, ognuna con otto femmine e quattro maschi in 10 millilitri di cibo medio farina di mais integrato con solvente EE2.La parte posteriore vola in un'incubatrice a 25 gradi Celsius. Durante il loro sviluppo, evitare il sovraffollamento delle larve. Dopo quattro giorni, inverti ogni flaconcino su un etere per rimuovere i genitori e restituire le fiale all'incubatrice per altri cinque giorni.Nel tardo pomeriggio del nove giorno, inverti ogni fiala su un etherizer per rimuovere tutte le mosche appena emerse dalle fiale e metti le fiale in un altro incubatore a 18 gradi Celsius durante la notte. La mattina del giorno 10, su una stazione di lavoro di anidride carbonica Drosophila, invertire attentamente la fiala di coltura per evitare che le mosche anestetizzate cadano su medie e inserire un tubo di gomma con un ago nel flaconcino tra il tappo di cotone e la parete del flaconcino. Aprire la valvola per fornire anidride carbonica.In pochi secondi, trasferisci le mosche su un letto a mosca al microscopio. Raccogli separatamente femmine vergini e giovani maschi in due gruppi sul letto di mosca. Suddividere casualmente ogni gruppo di mosche in piccoli sottogruppi, con 10 femmine o 20 maschi per fiala riempiti con mezzo di farina di mais corrispondente fresco.Continua l'incubazione e raccogli 30 femmine vergini e 30 maschi per ogni EDC, e 90 femmine vergini e 90 maschi per il controllo. Ospita questi gruppi di mosche a 25 gradi Celsius fino a quando non hanno un'età di quattro giorni dopo l'esclusione. Quindi trasferirli in nuove fiale contenenti mezzo fresco corrispondente ogni due giorni.Controlla che non ci siano larve nelle fiale delle femmine. Quindi etichettare fiale con una diversa serie di numeri sequenziali per il seguente trattamento. Dopo l'anestesia, trasferire una femmina trattata con solvente EE2 in una piccola fiala contenente mezzo di pomodoro fresco di farina di mais senza EE2 e aggiungere un maschio trattato con solvente EE2 per il controllo.Abbina un maschio trattato con EE2 a una femmina trattata con solvente EE2 o una femmina trattata con EE2 con un maschio trattato con solvente EE2 per ogni trattamento. Casa 20 croci singole a 25 gradi Celsius. Trasferire ogni coppia di accoppiamento su fiale medie di pomodoro di farina di mais fresco senza EDC ogni giorno per i successivi 10 giorni.Ispezionare visivamente ogni fiala ogni giorno per le uova e segnalare il loro numero sul foglio di calcolo della fertilità. In ogni fiala, controlla attentamente le mosche appena emerse e registra il numero giornaliero di progenie adulte nel periodo di 10 giorni. Dopo 10 giorni dall'accoppiamento iniziale, rimuovere i genitori dall'ultima serie di fiale.Nei protocolli di dosaggio dell'eclosion, in primo luogo, per ogni gruppo di trattamento, impostare 10 fiale di mosche giovani e sane di meno di due giorni, ognuna con sei femmine e tre maschi in 10 millilitri di cibo di farina di mais senza EDC. Alleva le mosche sul cibo per 24 ore e consenti loro di accoppiarsi. Quindi preparare altri 10 flaconcini paralleli per gruppo di trattamento con 10 millilitri ciascuno di alimenti freschi di farina di mais integrati con diverse concentrazioni di EDC o il solo solvente EE2 per il controllo.Trasferisci le mosche accoppiate a queste nuove fiale. Creare un foglio di calcolo di sviluppo per registrare le diverse serie. Consentire alle mosche di deporre le uova per 16 ore.Quindi, rimuovere i genitori dalle fiale. Incubare le fiale a 25 gradi Celsius per tre o quattro giorni o fino a quando le larve errante sono visibili. Ogni giorno, conta il numero di nuove pupe in ogni fiala scrivendo un numero in sequenza da ogni pupa all'esterno della fiala per evitare di contare la stessa pupa due volte.Segnala il numero di pupe appena emerse per tre o quattro giorni, o fino a quando non si formano più pupe. A partire dal nonno giorno, conta il numero di adulti emergenti ogni giorno, fino a quando non emergono più adulti. Segnalalo sul foglio di calcolo dello sviluppo ed esegui il resto del saggio di eclosion secondo il manoscritto.Nel protocollo lifespan, prima impostare 20 fiale con otto femmine e quattro maschi, ognuno riempito con 10 millilitri di cibo farina di mais e ospitarli a 25 gradi Celsius. Dopo quattro giorni, scartare le mosche e riposizionare le fiale nell'incubatrice. Nel tardo pomeriggio della nona giornata, rimuovere tutte le mosche appena emerse dalle fiale e riportare le fiale all'incubatrice.Dopo 16-24 ore, dividi le mosche adulte di un giorno di entrambi i sessi in quattro gruppi sotto l'anestesia leggera di anidride carbonica e trasferiscile in bottiglie da 250 millilitri contenenti cibo medio adulto, tre integrate con diverse concentrazioni di EDC e una con il solo solvente EE2. Mantenere le mosche a 25 gradi Celsius per due o tre giorni per consentire loro di accoppiarsi. Quindi, ordina ogni coorte di mosche per sesso in due gruppi.All'interno di ogni condizione di trattamento, per entrambi i sessi, suddividere casualmente ogni gruppo in cinque flaconcini paralleli ad una densità di 20 individui per flaconcino. Preparare un foglio di calcolo della durata della vita in cui il numero di mosche morte viene sottratto dal numero di mosche sopravvissute dal trasferimento precedente, in modo che il numero di sopravvissuti ad ogni trasferimento sia automaticamente ottenuto. Dopo tre giorni, trasferisci le mosche senza anestesia in nuove fiale contenenti il cibo corrispondente allo stesso tempo e controlla la morte.Registra l'età delle mosche e il numero di mosche morte. Ripeti il trasferimento ogni tre giorni fino a quando tutte le mosche muoiono. In questo esperimento, le curve di durata della vita sono state tracciate come la survivorship cumulativa rispetto ai giorni trascorsi per ogni concentrazione EDC e il controllo.Per il controllo, dopo un lungo periodo iniziale in cui la curva di superstiti è rimasta relativamente alta, è diminuita esponenzialmente dopo circa 60 giorni. A seguito dell'esposizione all'EDC, la curva di sopravvissutità delle mosche trattate è stata influenzata in modo significativo e ha mostrato un drastico declino dopo 36 giorni. Si consiglia di notare che le fiale parallele in fase di analisi dovrebbero essere molto simili, altrimenti sarà difficile capire quale scartare.Pertanto, suggeriamo di prestare molta attenzione, adottando una buona pratica sperimentale, utilizzando una grande dimensione del campione. Seguendo questi protocolli, è anche possibile valutare l'impatto transgenerazionale di un interferente endocrino selezionato e testare i potenziali effetti additivi di una combinazione di diversi interferenti endocrini.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Allevamento la mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sotto axeniche e Gnotobiotic Condizioni

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

I metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Imaging di animali interi di Drosophila melanogaster utilizzando la tomografia microincisa

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Imaging di espianti cerebrali vivi da larve di Drosophila melanogaster terzo stadio

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autore in primo piano: Indagine sulle dinamiche di divisione cellulare asimmetrica: un protocollo per l'imaging dal vivo di espianti di cervello larvale di Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imaging delle cellule vive di Drosophila melanogaster Terzo stadio Larvale Cervelli

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...