Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
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著者は、技術サポートのためのオルソリナペティロに感謝します。著者らは、書誌のサポートのためにマリアロサリア・アレッタ博士(CNR)に感謝しています。著者らは、EDCの世界にそれらを紹介してくれたグスタボ・ダミアーノ・ミタ博士に感謝しています。著者らはライカ・マイクロシステムズとパスクアレ・ロマーノの支援に感謝している。この研究は、プロジェクトPON03PE_00110_1によってサポートされました。「スヴィルッポ・ディ・ナノテクノロジー・オリエンテート・アッラ・リジェネラツィオーネ・エ・リコストルツィオーネ・ティスタレ、オドントニアトリア/オキュリスティカのインプラントロジアeセンシスティカ」アクロニモ「SORRISO」;コミットメント: PO FESR 2014-2020 カンパニア;プロジェクトPO FESRカンパニア2007-2013 「IL RILASCIOコントロールラートディモレコールバイオ熱性ナノテクノロジロジーあたりナノテクノロジー」。

1. 食品の準備
<ol><li>
ストックメンテナンスおよび幼虫増殖のために、3%粉末酵母、10%ショ糖、9%のコーンミール、0.4%寒天、その後コーンミール培地(CM)を含むコーンミール培地を使用する。
	<ol>
<li>100mLの水道水に30gの酵母を入れ、沸騰させ、15分間沸騰させます。</li>
		<li>別に、調理済みコーンミール90g、砂糖100g、寒天4gを900mLの水道水に混ぜます。</li>
		<li>溶液を沸騰させ、火...

フルーツフライD.メラノガスターは、DBP28、BPA、4-NP、4-tert-OP29、MP30、EP31などの環境EDCの潜在的な影響を調査するインビボモデルシステムとして広く採用されています。32、DEHP33、および EE234.いくつかの理由は、研究のこの分野のモデルとしての使用を?...

人間の活動は、生物と自然生態系の深刻な問題を表す大量の化学物質を環境に放出しています1.これらの汚染物質のうち、約1,000種類の化学物質が内分泌系の正常なバランスを変える可能性があると推定されています。この特性によると、それらは内分泌破壊化学物質(EDC)として分類される。具体的には、内分泌学会による最近の定義に基づいて、EDCは「外因性化学物質、または化学物質の混合物であり、ホルモン作用のあらゆる側面を妨害する可能性がある」2.過去30年間にわたり、EDCが動物や植物の生殖と発達に影響を与える可能性があるという科学的証拠が増えてきた3、4、5、6、7、 8.また、EDC曝露は、癌、肥満、糖尿病、甲状腺疾患、および行動障害9、10、11を含む一部のヒト疾患の有病率の増加に関連している。
EDCの一般的なメカニズム
その分子特性のために、EDCはホルモンまたはホルモン前駆体3、4、5、6、7、8、9のように振る舞う10、11、12.この意味で, 彼らはホルモンの受容体に結合し、ホルモン活性を模倣することによって、または内因性ホルモンの結合をブロックすることによって内分泌系を破壊することができます。.最初のケースで, 受容体に結合した後, 彼らは、その自然なホルモンが行うようにそれを活性化することができます。.他のケースでは、受容体へのEDCの結合は、その天然ホルモンの結合を防ぐので、受容体はブロックされ、もはやその天然ホルモン3の存在下でも活性化されなくなる。その結果、EDCは、恒常性、生殖、発達、および/または行動の維持を担う内因性ホルモンの合成、分泌、輸送、代謝、または末梢作用などのいくつかのプロセスに影響を与える可能性があります。生物。受容体結合は、EDCのためにこれまでに説明した唯一の作用方法ではありません。酵素経路でコアクティベーターやコアプレッサを募集したり、遺伝子発現10、11、12、13を調節するエピジェネティックマーカーを改変したりすることで、彼らも行動できることが明らかになりました。 、14は、現在の世代のためだけでなく、8来る世代の健康のためにも影響を与えます。
ショウジョウバエホルモン
選択されたEDCの潜在的な効果は、野生生物種と内分泌機構が合理的によく知られているいくつかのモデルシステムの両方で広く研究されている。無脊椎動物の場合、成長、発達、生殖に影響を与える内分泌系は、生物学的研究の分野での広範な使用、その経済的重要性、およびいくつかの理由から昆虫に広く特徴付けられてきた。最後に、害虫のホルモン系に特異的に干渉することができる殺虫剤の開発。
特に、昆虫の中で、フルーツフライD.メラノガスターは、EDCの潜在的な内分泌効果を評価する非常に強力なモデルシステムであることが証明されています。D. メラノガスターでは、脊椎動物と同様に、ホルモンはライフサイクル全体を通じて重要な役割を果たします。この生物には、ステロイドホルモン20-ヒドロキシエキシダイソン(20E)15、16、セシテルペノイド若年ホルモン(JH)17、および神経ペプチドおよびペプチド/タンパク質を含む3つの主要なホルモン系があります。ホルモン18.この3番目のグループは、より最近発見されたいくつかのペプチドから成りますが、長寿、恒常性、代謝、生殖、記憶、およびロコモータ制御などの生理学的および行動過程の膨大な多様性に明らかに関与しています。20Eは、エストラジオールなどのコレステロール由来のステロイドホルモンと相同であり、JHはレチノイン酸といくつかの類似点を共有している。それらの両方は、ショウジョウバエ19、20のよく知られているホルモンです。そのバランスは、モルティングと変態を調整するだけでなく、再生、寿命、行動21などのいくつかの発達後プロセスを制御する上で重要であり、内分泌をテストするための異なる可能性を提供します。ショウジョウバエの破壊。また、エジステロイドホルモンおよびJHは、いわゆる第三世代殺虫剤の主な標的であり、昆虫における発達および生殖内分泌媒介プロセスを妨害するために開発される。これらの化学物質のアゴニストまたはアンタゴニストモードはよく知られており、したがって、昆虫の成長、生殖、および発達に及ぼす潜在的なEDCの影響を評価するための基準として役立つことができる22。例えば、蚊や他の水生昆虫23、24の制御に広く使用されているメトプレンは、JHアゴニストとして働き、20E誘発遺伝子転写および変態を抑制する。
ホルモンに加えて, ショウジョウバエの核受容体 (NR) スーパーファミリーもよく知られています。;それは、ホルモン依存性発達経路の制御に関与する18の進化的に保存された転写因子、ならびに生殖および生理学25から成っている。これらのホルモンNRは、神経伝達26に関与するもの、レチノイン酸NR用の2つ、および脊椎動物においてEDC27の主要な標的の1つを表すステロイドNR用のサブタイプを含む、6つのNRスーパーファミリーサブタイプすべてに属する。
EDCを研究するためのモデルシステムとしてのショウジョウバエ
現在、分子特性に基づいて、世界中のいくつかの環境機関は、異なる人工化学物質に内分泌系を妨害する可能性に起因しています。EDCが環境と生物にとって世界的かつユビキタスな問題であることを考えると、この分野の研究の全体的な目標は、病気の負担を軽減し、生物をその悪影響から保護することです。化学物質の潜在的な内分泌効果についての理解を深めるためには、生体内でそれをテストする必要があります。この目的のために、D.メラノガスターは有効なモデルシステムを表す。今日まで、フルーツフライは、いくつかの環境EDCの効果を評価するために、生体内モデルとして広く使用されてきました。ジブチルフタル酸エステル(DBP)28、ビスフェノールA(BPA)、4-ノニルフェノール(4-NP)、4-テルオクチルフェノール(4-テルト-OP)29、メチルパラベン(MP)30、エチルパラベン(EP)31などのいくつかのEDCへの暴露が報告されています。32、ビス-(2-エチルヘキシル)フタル酸エステル(DEHP)33、および17−α-エチニルエストラジオール(EE2)34は、脊椎動物モデルのように代謝および内分泌機能に影響を与える。いくつかの理由は、研究のこの分野でモデルとしての使用につながっています.内分泌系に関する優れた知識を超えて、その短いライフサイクル、低コスト、簡単に実行可能なゲノム、研究の長い歴史、およびいくつかの技術的な可能性が含まれます(FlyBaseのウェブサイト、http://flybase.org/参照)。D. メラノガスターはまた、環境要因8に対する世代間の影響と集団応答を容易に研究するための強力なモデルを提供し、高等動物の生体内研究に関連する倫理的な問題を回避する。さらに、フルーツフライは、ヒトと高度な遺伝子保全を共有しており、ショウジョウバエEDCアッセイがヒトの健康に対するこれらの化学物質の潜在的な影響を予測または示唆するのに役立つ可能性があります。ショウジョウバエは、人間の健康への影響に関する理解を深めるだけでなく、生物多様性の喪失や環境の劣化など、環境へのEDC曝露のリスクを評価するのに役立ちます。最後に、フルーツフライは、その開発、生殖、寿命に影響を与える可能性のある要因が、試験される物質に任意のバリエーションを帰属させるために制御下に保つことができる実験室で使用されるという付加的な利点を提供します。
この念頭に置いて、我々は、例えば、性欲/生殖能力、発達のタイミング、成人の寿命など、いくつかのショウジョウバエホルモン特性に対するEDC効果を決定するためのシンプルで堅牢なフィットネスアッセイを最適化しました。これらのアッセイは、一部のEDC23、24、25、26、27に広く使用されています。特に、合成エストロゲンEE234への曝露の影響を評価し、BPAおよびビスフェノールAF(BPA F)(未発表データ)への影響を評価するために、以下のプロトコルを使用した。これらのプロトコルは、一度に所定のEDCの効果、ならびにD.メラノガスターにおける複数のEDCの組み合わせ効果を調べるために容易に変更することができる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

近年、すべての生物と環境が内分泌破壊物質(EDC)として知られているホルモンのような化学物質にさらされているという証拠が増えています。これらの化学物質は、内分泌系の正常なバランスを変更し、副作用につながる可能性があります, だけでなく、人間の集団内のホルモン障害の増加や成長を妨げ、野生生物種の繁殖を減少.一部の EDC では、健康への影響と使用に関する制限が文書化されています。しかし、それらのほとんどのために、この意味ではまだ科学的証拠がありません。完全な生物における化学物質の潜在的な内分泌効果を検証するためには、適切なモデルシステム、ならびにフルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターでテストする必要があります。ここでは、ショウジョウバエにおける内分泌破壊を研究するために生体内プロトコルで詳細に報告し、ハエの胎児/生殖能力、発達時期、寿命に対するEDCの影響に対処する。ここ数年、これらのショウジョウバエの生命特性を用いて、17-α-エチニルエストラジオール(EE2)、ビスフェノールA(BPA)、ビスフェノールAF(BPA F)への曝露の影響を調べた。全体として、これらのアッセイは、すべてのショウジョウバエのライフステージをカバーし、すべてのホルモン媒介プロセスにおける内分泌破壊を評価することを可能にしました。胎児/不妊症および発達タイミングアッセイは、それぞれ、ハエの生殖性能および発達段階におけるEDCの影響を測定するのに有用であった。最後に、寿命アッセイは、成人への慢性EDC暴露を伴い、その生存者を測定した。しかし、これらの生命特性はまた、慎重に制御されなければならなかったいくつかの実験因子の影響を受ける可能性があります。したがって、この作業では、これらのアッセイの正しい結果に合わせて最適化した一連の手順を提案します。これらの方法は、科学者が任意のEDCまたはドロソフィラの異なるEDCの混合物のために内分泌破壊を確立することを可能にするが、効果を担当する内分泌機構を同定するためには、さらなるエッセイが必要になる可能性がある。

このセクションでは、上記のプロトコルの主要な手順を簡略化されたスキームの形式で報告します。ハエは不快な化合物を避ける傾向があることを考えると、最初に行うことは、選択されたEDCの味をアッセイすることです。これは、食品着色料(例えば、赤色食品染料第40号)35を様々な用量で、または溶媒単独で選択されたEDCを補充した食品と混合することによって行うこと?...

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Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

内分泌破壊物質(EDC)は、生物および自然環境にとって深刻な問題を表します。ショウジョウバエメラノガスターは、生体内のEDC効果を研究するための理想的なモデルを表します。ここでは、ショウジョウバエにおける内分泌破壊を調査する方法を紹介し、胎児、生殖能力、発達時期、ハエの寿命に対するEDCの影響に対処する。

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける内分泌破壊を試験する方法

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

ショウジョウバエメラノガスターは、人間の健康や自然環境に深刻な問題を示す内分泌破壊物質などの化学物質の潜在的な毒性および内分泌効果をインビボで評価する強力なモデルです。EDCがハエのホルモン生命特性(例えば、胎児性、生殖能力、発達時間、寿命)に及ぼす影響に対処する。これは、インビボで内分泌破壊を調査するための簡単で安価で迅速な方法です。ショウジョウバエの生殖能力、発達、寿命は、このプロトコルの成功した結果を確実にするために慎重に制御されなければならないいくつかの要因の影響を受ける可能性があります。そのため、ハエの飼育や取り扱いには最大限の注意が必要です。選択したEDCの味をアッセイするために、麻酔後、フライベッドから15匹の若いハエを、食品着色料と混合したコーンミール培地を含む4つの平行バイアルに移す。対照バイアルは、単独で溶媒を含み、他の3つのバイアルは、選択されたEDCの異なる用量で補充されます。天然の12時間の光で1日、加湿インキュベーターにバイアルを保管してください。ハエを再び麻酔した後、固定されたハエを白紙に移し、ステレオ顕微鏡の下に置いて観察します。対照群に対して各治療群の腹部着色を比較する。ハエの生殖性能をアッセイするには、EE2を補充したコーンミール培地の10ミリリットルに8人のメスと4人の男性を含む、親のバイアルとして各EDCのためのハエの3つのバイアルを準備する。コントロールのために、EE2溶媒を補充したコーンミール中食品の10ミリリットルに8匹のメスと4人の男性をそれぞれ8匹のハエのバイアルを準備します。リアは摂氏25度のインキュベーターで飛ぶ。彼らの開発中に、幼虫を過密にしないでください。4日後、エーテルを介して各バイアルを反転して両親を取り除き、バイアルを5日間インキュベーターに戻します。9日目の午後遅く、エータライザーの上に各バイアルを反転して、バイアルから新たに出現したすべてのハエを取り除き、バイアルを一晩摂氏18度の別のインキュベーターに入れます。10日目の朝、ショウジョウバエの二酸化炭素ワークステーションで、麻酔されたハエが媒体に落ちるのを防ぐために培養バイアルを慎重に反転させ、綿のストッパーとバイアルの壁の間のバイアルに針を持つゴムチューブを挿入します。バルブを開けて二酸化炭素を供給します。ほんの数秒で、ハエを顕微鏡でフライベッドに移します。処女女性と若い男性を別々にハエベッドの2つのグループに集めます。小さなサブグループのハエの各グループをランダムに細分化し、10匹のメスまたは20匹の雄が新鮮な対応するコーンミール培地で満たされたバイアルあたり。インキュベーションを続け、各EDCに対して30人の処女女性と30人の男性、そして90人の処女女性と90人の男性を集めてコントロールします。エローション後4日になるまで、これらのハエのグループを摂氏25度で収容してください。その後、2日ごとに新鮮な対応する媒体を含む新しいバイアルにそれらを転送します。メスのバイアルに幼虫がいないか確認してください。次に、バイアルに次の処置のための連続番号の異なるシリーズをラベル付けします。麻酔後、EE2溶媒処理メス1匹をEE2なしで新鮮なコーンミールトマト培地を含む小さなバイアルに移し、EE2溶媒処理された男性を1匹加えて制御します。EE2処理の男性とEE2溶媒処理雌またはEE2処理雌とEE2溶媒処理の男性を各処理に対して組み合わせる。25°Cで家20シングルクロス。各交配ペアを、その後の10日間、毎日EDCなしで新鮮なコーンミールトマト培地バイアルに移します。卵のために毎日各バイアルを視覚的に検査し、不妊治療スプレッドシートに自分の番号を報告します。各バイアルでは、新しく出現したハエを注意深くチェックし、10日間の成人子孫の毎日の数を記録します。最初の交配から10日後、バイアルの最後のシリーズから両親を取り除きます。エローションアッセイプロトコルでは、まず、各治療群に対して、生後2日以内に生後2日以内に生後2日以内に10個の若くて健康なハエのバイアルを設置し、それぞれEDCなしのコーンミール食品の10ミリリットルに6人の女性と3人の男性を設置する。ハエを24時間食べ物に乗せ、交尾できるようにします。次に、異なるEDC濃度またはEE2溶媒単独で補った新鮮なコーンミール食品のそれぞれを10ミリリットルで処理グループごとに別の10並列バイアルを調製し、コントロールします。交配ハエをこれらの新しいバイアルに移します。異なるシリーズを記録するために、開発用スプレッドシートを作成します。ハエが16時間卵を産むことを許可します。次に、バイアルから両親を取り除きます。バイアルを摂氏25度で3~4日間、または放浪の幼虫が見えるまでインキュベートする。毎日、バイアルの外側に各子犬の順序で番号を書くことによって、各バイアルの新しい子犬の数を数え、同じ子犬を2回数えないようにします。新たに出現した子犬の数を3〜4日間、またはこれ以上の子犬の形がなくなるまで報告する。9日目から、成人が出現しなくなるまで、毎日新興成人の数を数えます。開発スプレッドシートに報告し、原稿に従って残りのエクロスションアッセイを実行します。寿命プロトコルでは、最初に8人の女性と4人の男性で20バイアルを設置し、それぞれが10ミリリットルのコーンミール食品で満たされ、摂氏25度で収容します。4日後、ハエを捨て、バイアルをインキュベーターに戻します。9日目の午後遅く、バイアルから新しく出現したすべてのハエを取り除き、バイアルをインキュベーターに戻します。16〜24時間後、両性の250匹の1日齢の成体ハエを軽い二酸化炭素麻酔下で4つのグループに分け、成人培地食品を含む250ミリリットルのボトルに移し、3つは異なるEDC濃度で補い、1つはEE2溶媒だけで補う。ハエを2〜3日間摂氏25度に保ち、交尾できるようにします。その後、性別によってハエの各コホートを2つのグループに分類します。各治療条件内では、男女ともに、各グループを1バイアルあたり20個の密度でランダムに5つの平行バイアルに細分化する。死んだハエの数を以前の転送から生き残ったハエの数から差し引く寿命スプレッドシートを準備し、各転送で生存者の数が自動的に得られるようにします。3日後、麻酔なしでハエを対応する食物を含む新しいバイアルに同時に移し、死亡を確認する。ハエの年齢と死んだハエの数を記録します。すべてのハエが死ぬまで3日ごとに転送を繰り返します。この実験では、寿命曲線を、各EDC濃度および対照の累積生存期間と経過日数に対してプロットした。この対照については、生存曲線が比較的高いままであった長い初期期間の後、約60日後に指数関数的に低下した。EDC曝露後、治療されたハエの生存曲線は有意に影響を受け、36日後に劇的な減少を示した。分析の下で平行バイアルは非常に似ているべきである、そうでなければ、どちらを破棄するかを理解することは困難であることをお勧めします。したがって、我々は、大きなサンプルサイズを使用して、良い実験の練習を採用し、細心の注意を払ってお勧めします。このプロトコルに従って、選択された内分泌破壊物質の世代間の影響を評価するだけでなく、異なる内分泌破壊物質の組み合わせの潜在的な添加効果を試験することもできる。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

の血液細胞集団のアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

発生生物学

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

フルーツフライを飼育<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;無菌およびノトバイオート条件の下で

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

リンパ腺や血球中を調べるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

フルーツフライで免疫染色でステロイド合成器官とそのインタラクティブ臓器を可視化するためのプロトコル<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

ショウジョウバエメラノガスターにおける血液脳関門完全性に関するアッセイ

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

微小断層撮影による ショウジョウバエメラノガスター の動物全体イメージング

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Drosophila melanogaster Third Instar Larvaeのライブ脳外植片のイメージング

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

著者スポットライト:非対称細胞分裂ダイナミクスの調査:ショウジョウバエ幼虫の脳外植片のライブイメージングのためのプロトコル 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...