Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
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저자는 기술 지원을 위해 오르솔리나 페티요에게 감사드립니다. 저자는 마리아로사리아 아레타 박사(CNR)에게 서지 지원에 감사드립니다. 저자들은 구스타보 다미아노 미타 박사가 EDC 세계에 소개해 준 것에 대해 감사를 표합니다. 저자들은 라이카 마이크로시스템스와 파스칼레 로마노의 도움에 감사를 표한다. 이 연구는 프로젝트 PON03PE_00110_1에 의해 지원되었다. "Sviluppo di nanotecnologie 오리엔타테 알라 리제네지오네 e 리코스트루지오네 티수탈, 임플란트톨로지아 e 감각학 오돈토이아트리아/오큘리스티카" 아크로니모 "소리소"; 커밋텐트: PO FESR 2014-2020 캄파니아; 프로젝트 PO FESR 캄파니아 2007-2013 "일 릴라시오 제어라토 디 몰레콜 바이오 -ATTIVE 나노 테놀로지 당 나노 테놀로지".

1. 음식 준비
<ol><li>
재고 유지 및 애벌레 성장을 위해 3 % 분말 효모, 10 % 자당, 9 % 미리 조리 된 옥수수 가루, 0.4 % 한천을 포함하는 옥수수 가루 배지를 사용하십시오.
	<ol>
<li>효모 30g을 수돗물 100 mL에 넣고 끓여서 15 분 동안 끓입니다.</li>
		<li>별도로, 미리 조리된 옥수수가루 90g, 설탕 100g, 한천 4g을 수돗물 900 mL에 잘 섞습니다.</li>
		<li>용액을 끓이고 불을 낮추고 5 분간 계속 저어줍?...

과일 플라이 D. 멜라노가스터는 DBP28,BPA, 4-NP, 4-tert-OP29,MP30,EP31 과 같은 환경 EDC의 잠재적 효과를 조사하기 위해 생체 내 모델 시스템으로 광범위하게 사용되고 있습니다. 32, DEHP33및 EE234. 몇 가지 이유가 연구의이 분야에서 모델로 그것의 사용을 주도 했다. ?...

인간의 활동은 유기체와 자연 생태계에 대한 심각한 문제를 나타내는 화학 물질의 엄청난 양의 환경에 방출되고있다1. 이러한 오염 물질 중 약 1,000 개의 다른 화학 물질이 내분비 시스템의 정상적인 균형을 바꿀 수 있다고 추정됩니다. 이 속성에 따르면, 그들은 내분비 파괴 화학 물질 (EDC)로 분류됩니다. 구체적으로, 내분비 학회에 의한 최근의 정의에 기초하여, EDC는 "호르몬 작용의 어떤 양상든지 방해할수 있는 외인성 화학물질, 또는 화학물질의 혼합물"2 . 지난 3 년 동안, EDC가 동물과 식물의 번식과 발달에영향을 미칠 수 있다는 과학적 증거가 증가하고있다 3,4,5,6,7, 8. 또한, EDC 노출은 암, 비만, 당뇨병, 갑상선 질환 및 행동 장애를 포함하는 일부 인간 질병의 증가 보급과 관련이있다9,10,11.
EDC의 일반적인 메커니즘
그들의 분자 속성 때문에, EDC는 호르몬 또는 호르몬 전구체 처럼 행동3,4,5,6, 7,8,9, 10,11,12. 이 의미에서, 그들은 호르몬의 수용 체에 바인딩 하 고 호르몬 활동을 모방 하 여 또는 내 인 성 호르몬 바인딩을 차단 하 여 내 분 비 시스템을 중단 수 있습니다. 첫 번째 경우에, 수용 체에 바인딩 후, 그들은 그것의 자연 호르몬 으로 그것을 활성화할 수 있습니다. 다른 경우에는 EDC를 수용체에 결합하면 자연 호르몬의 결합을 방지하므로 수용체가 차단되고 자연 호르몬이있는 경우에도 더 이상활성화 될 수 없습니다 3. 결과적으로, EDC는 항상성의 유지 보수, 재생산, 발달 및 / 또는 행동의 유지를 담당하는 내인성 호르몬의 합성, 분비, 수송, 신진 대사 또는 말초 작용과 같은 여러 과정에 영향을 미칠 수 있습니다. 유기체. 수용체 결합은 EDC에 대해 지금까지 설명된 유일한 작용 방법이 아니다. 그것은 지금 그(것)들이 또한 효소 통로에 있는 coactivators 또는 코어프레서를 모집하거나 유전자 발현을 통제하는 후성 유전학 마커를 수정해서 작동할 수 있다는 것을 명백합니다10,11,12,13 ,14, 현재 세대뿐만 아니라 올 세대의 건강에 대한 뿐만 아니라 결과와함께 8.
초파리 호르몬
선택된 EDC의 잠재적인 효력은 야생 동물 종및 내분비 기계장치가 합리적으로 잘 알려진 몇몇 모형 체계에서 넓게 공부되었습니다. 무척추 동물의 경우, 성장, 개발 및 번식에 영향을 미치는 내분비 시스템은 생물학적 연구 분야에서 광범위하게 사용, 경제적 중요성 및 여러 가지 이유로 곤충을 광범위하게 특징으로합니다. 마지막으로 해충 곤충의 호르몬 시스템을 구체적으로 방해 할 수있는 살충제의 개발.
특히, 곤충 중에서 과일 플라이 D. 멜라노가스터는 EDC의 잠재적 내분비 효과를 평가하는 매우 강력한 모델 시스템으로 입증되었습니다. D. 멜라노가스터에서,뿐만 아니라 척추 동물에서, 호르몬은 전체 수명 주기 에 걸쳐 중요 한 역할을. 이 유기체에는 스테로이드 호르몬 20-하이드록시엑디손(20E)15,16,세스키트르페노이드 청소년 호르몬(JH)17,및 뉴로펩타이드 및 펩티드/단백질을 포함하는 3가지 주요 호르몬 시스템이 있다. 호르몬18. 이 세 번째 그룹은 장수, 항상성, 신진 대사, 재생, 기억 및 운동 조절과 같은 다양한 생리 적 및 행동 과정에 명확하게 관여하는 여러 펩티드로 구성되어 있습니다. 20E는 에스트라디올과 같은 콜레스테롤 유래 스테로이드 호르몬에 상동성이며 JH는 레티노산과 몇 가지 유사점을 공유합니다. 둘 다 초파리19,20에서더 잘 알려진 호르몬이다. 그들의 균형은 몰팅과 변태를 조정하는 데 매우 중요하며, 재생, 수명 및 행동21과같은 여러 개발 후 프로세스를 제어하여 내분비 검사를 위한 다양한 가능성을 제공합니다. 초파리에 있는 중단. 또한, ecdysteroid 호르몬과 JHs는 곤충에 있는 발달과 생식 내분비 중재프로세스를 방해하기 위하여 개발된 소위 제 3 세대 살충제의 주요 표적입니다. 이러한 화학물질의 작용의 작용의 작용의 작용 또는 길항제 모드는 잘 알려져 있으며, 따라서 곤충의 성장, 번식 및 발달에 대한 잠재적 EDC의 영향을 평가하기 위한 기준으로서 작용할 수 있다22. 예를 들어, 메토프레네는 모기 및 기타 수생곤충(23,24)을조절하는 데 널리 사용되어 왔으며, JH 작용제로서 작용하고 20E-유도 유전자 전사 및 변태를 억압한다.
호르몬 이외에, 핵 수용체 (NR) 초등파의 슈퍼 패밀리는 또한 잘 알려져 있다; 그것은 호르몬 의존적인 발달 통로 통제에서 관련시킨 18의 진화적으로 보존한 전사 요인, 뿐만 아니라 재생산 및 생리학25로이루어져 있습니다. 이 호르몬 NR은 신경전달에 관여하는 사람들을 포함하여 모든 6개의 NR superfamily 특수형에 속합니다 26, 레티노산 NR을 위한 2개, 및 척추동물에서, EDC27의 1차 표적의 한을 나타내는 스테로이드 NR을 위한 그.
EDC 를 연구하기위한 모델 시스템으로 초파리
현재 분자 특성에 기초하여 전 세계의 여러 환경 기관은 내분비 계통을 다른 인공 화학 물질에 방해할 수 있는 잠재력을 기인하고 있습니다. EDC가 환경과 유기체에 대한 세계적이고 유비쿼터스적인 문제라는 점을 감안할 때, 이 분야의 연구의 전반적인 목표는 질병 부담을 줄이고 살아있는 유기체를 부작용으로부터 보호하는 것입니다. 화학 물질의 잠재적인 내 분 비 효과 대 한 이해를 심화 하기 위해, 생체 내에서 그것을 테스트 하는 데 필요한. 이를 위해, D. 멜라노가스터는 유효한 모델 시스템을 나타낸다. 현재까지, 과일 파리는 여러 환경 EDC의 효과를 평가하기 위해 생체 내 모델로 광범위하게 사용되어 왔다; 디부틸 프탈레이트(DBP)28,비스페놀 A(BPA), 4-논일페놀(4-NP), 4-테르트-옥틸페놀(4-tert-OP)29,메틸파라벤(MP)30,에틸파라벤(EP) 30, 에틸파라벤(EP)31, 32,비스-(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP)33,및 17-α-에티닐에스트라디올(EE2)34,척추동물 모델에서와 같이 대사 및 내분비 기능에 영향을 미친다. 몇 가지 이유가 연구의이 분야에서 모델로 그것의 사용을 주도 했다. 내분비 시스템에 대한 뛰어난 지식을 넘어, 더 많은 장점은 짧은 수명 주기, 저렴한 비용, 쉽게 관리 게놈, 연구의 오랜 역사, 여러 기술적 가능성 (FlyBase 웹 사이트, http://flybase.org/ 참조)를 포함한다. D. melanogaster는 또한 환경 요인에 대한 세대 간 효과 및 인구 반응을 쉽게 연구하기위한 강력한 모델을 제공8 높은 동물의 생체 내 연구와 관련된 윤리적 문제를 방지 할 수 있습니다. 또한, 과일 파리 예측 또는 인간의 건강에 대 한 이러한 화학 물질의 잠재적인 효과 제안에 도움이 Drosophila EDC 검사에 대 한 가능 할 수 있는 인간과 유전자 보존의 높은 학위를 공유. 인간의 건강 효과에 대한 이해를 확대하는 것 외에도, Drosophila는 생물 다양성 손실 및 환경 저하와 같은 환경에 대한 EDC 노출의 위험을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 과일 파리는 실험실에서 사용되는 추가 이점을 제공하며, 이 곳에서 잠재적으로 개발, 번식 및 수명에 영향을 미치는 요인이 테스트할 물질의 변형을 특성화하기 위해 통제할 수 있습니다.
이 점을 염두에 두고, 우리는 여성/불 임, 발달 타이밍 및 성인 수명과 같은 일부 Drosophila 호르몬 특성에 EDC 효과를 결정하기 위한 간단하고 강력한 피트니스 분석에 최적화했습니다. 이러한 어세이는 일부 EDC23,24,25,26,27에널리 사용되어 왔다. 특히, 우리는 합성 에스트로겐 EE2(34) 및 BPA 및 비스페놀 AF(BPA F)에 대한 노출의 효과를 평가하기 위해 다음 프로토콜을 사용하였다(미공개 데이터). 이러한 프로토콜은 D. melanogaster에있는 다중 EDC의 결합된 효력 뿐만 아니라, 한 번에 주어진 EDC의 효력을 조사하기 위하여 쉽게 수정될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

최근 몇 년 동안 모든 유기체와 환경이 내분비 장애 화학 물질 (EDC)으로 알려진 호르몬과 같은 화학 물질에 노출된다는 증거가 증가하고 있습니다. 이러한 화학 물질 내 분 비 시스템의 정상적인 균형을 변경 하 고 부작용으로 이어질 수 있습니다., 인간 인구에 호르몬 장애의 증가 뿐만 아니라 또는 방해 성장 및 야생 동물 종에서 감소 된 재생산. 일부 EDC의 경우, 문서화 된 건강 효과 및 그들의 사용에 제한이 있다. 그러나, 그들 대부분에 대 한, 여전히 이 의미에서 과학적 증거가 있다. 전체 유기체에서 화학 물질의 잠재적 인 내분비 효과를 확인하기 위해, 우리는 적절한 모델 시스템뿐만 아니라 과일 파리, Drosophila 멜라 노가스터에서테스트해야합니다. 여기에서 우리는 초파리에 있는 내분비 중단을 공부하기 위하여 생체 내비염에서 상세한 보고, fecundity/불임에 EDC 효력을, 발달 타이밍 및 비행의 수명을 해결하. 지난 몇 년 동안, 우리는 17-α-에티닐에스트라디올 (EE2), 비스페놀 A (BPA) 및 비스페놀 AF (BPA F)에 노출의 효력을 조사하기 위하여 이 Drosophila 생활 특선 특성을 이용했습니다. 전부, 이 asays는 모든 Drosophila 생활 단계를 커버하고 가능한 모든 호르몬 중재프로세스에 있는 내분비 중단을 평가하는 가능하게 했습니다. fecundity/fertility 및 발달 타이밍 측정은 각각 비행 생식 성과 및 발달 단계에 EDC 충격을 측정하는 데 유용했습니다. 마지막으로, 수명 분석성인에 만성 EDC 노출을 관련시키고 그들의 생존을 측정했습니다. 그러나, 이러한 생활 특성또한 신중 하 게 제어 했다 몇 가지 실험 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 그래서, 이 작품에서는, 우리는 이 검소의 적당한 결과를 위해 우리가 최적화한 일련의 절차를 건의합니다. 이 방법은 과학자가 어떤 EDC든지를 위한 내분비 중단을 설치하거나 Drosophila에 있는 다른 EDC의 혼합물을 위해, 효력에 책임 있는 내분비 기계장치를 확인하기 위하여, 추가 에세이가 필요할 수 있었습니다.

이 섹션에서는 위의 프로토콜의 주요 단계가 단순화된 체계의 형태로 보고됩니다. 파리가 불쾌한 화합물을 피하는 경향이 있다는 것을 감안할 때, 가장 먼저 해야 할 일은 선택한 EDC의 맛을 분석하는 것입니다. 이는 식품 착색제(예를 들어, 적색 식품 염료 제40호)(35)를 다양한 용량으로 또는 단독으로 선택된 EDC로 보충된 식품과 혼합함으로써 행해질 수 있다. 이러한 매체에 공급...

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Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

내분비 파괴 물질 (EDC)은 유기체와 자연 환경에 심각한 문제를 나타냅니다. 드로소필라 멜라노가스터는 생체 내에서 EDC 효과를 연구하는 이상적인 모델을 나타낸다. 여기에서, 우리는 Drosophila에 있는 내분비 중단을 조사하는 방법을 제시합니다, fecundity에 EDC 효력을, 비옥, 발달 타이밍 및 비행의 수명을 해결하.

초파리 멜라노가스터에서 내분비 장애를 테스트하는 방법

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila 멜라노가스터는 인체 건강과 자연 환경에 심각한 문제를 나타내는 내분비 파괴자와 같은 화학 물질의 잠재적 독성 및 내분비 효과를 생체 내에서 평가하는 강력한 모델입니다. EDC가 비행의 호르몬 수명 특성에 미치는 영향을 해결하는 데, 예를 들어, 이러한 변종, 다산, 발달 시간 및 수명. 그것은 생체 내 분비 장애를 조사하는 쉽고 저렴하며 빠른 방법입니다.Drosophila에 있는 다산, 발달 및 수명은 이 프로토콜의 성공적인 결과를 지키기 위하여 주의 깊게 통제되어야 하는 몇몇 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 파리 를 사육하고 처리하는 데 최대한의 주의가 필요합니다. 선택된 EDC의 맛을 분석하기 위해, 마취 후, 플라이 베드에서 식품 착색과 혼합된 옥수수밀 배지를 함유한 4개의 평행 바이알로 15마리의 어린 파리를 이송한다.대조군 바이알은 용매만을 포함하고, 다른 3개의 바이알은 선택된 EDC의 다른 용량으로 보충된다. 바이알을 가습된 인큐베이터에 1일 동안 천연 12시간 의 빛으로 보관하십시오. 파리를 다시 마취한 후, 고정된 파리를 백서로 옮기고 스테레오 현미경아래에 배치하여 관찰합니다.대조군에 대하여 각 처리군의 복부 착색을 비교합니다. 파리의 생식 성능을 분석하려면, 부모 바이알로 각 EDC에 대한 파리의 세 바이알을 준비, 8 여성과 4 개의 남성에 10 옥수수 가루 매체의 밀리리터EE2로 보충. 제어를 위해, 파리 의 여섯 바이알을 준비, 각각 8 여성과 4 개의 수컷에 옥수수 밀 중간 식품의 10 EE2 용매로 보충.후면은 섭씨 25도에서 인큐베이터로 날아갑니다. 그들의 발달 도중, 애벌레를 과밀하지 마십시오. 4 일 후, 부모를 제거하고 5 일 더 인큐베이터에 바이알을 반환에 에테르화를 통해 각 유리병을 반전.9일 늦은 오후에 각 유리병을 이더라이저 위에 뒤집어 새로 나타난 모든 파리를 바이알에서 제거하고 하룻밤 사이에 18도의 다른 인큐베이터에 바이알을 넣습니다. 10일 오전, 드로소필라 이산화탄소 작업장에 있는 이질처리된 파리가 중간크기로 떨어지는 것을 막기 위해 배양 유리병을 조심스럽게 반전시키고, 면 스토퍼와 바이알 벽 사이의 유리병에 바늘이 달린 고무 튜브를 삽입한다. 밸브를 열어 이산화탄소를 전달합니다.몇 초 안에, 현미경 아래 비행 침대로 파리를 전송합니다. 처녀 여성과 젊은 남성을 플라이 베드의 두 그룹으로 따로 모으게 하십시오. 작은 하위 그룹에서 파리의 각 그룹을 무작위로 세분화하고, 바이알 당 10 명의 여성 또는 20 명의 남성이 신선한 해당 옥수수 밀 매체로 채워져 있습니다.인큐베이션을 계속하고 각 EDC에 대해 30 명의 처녀 여성과 30 명의 남성을 수집하고 90 처녀 여성과 90 명의 남성을 통제하십시오. 이 파리들은 4일 후 로클로션 이 될 때까지 섭씨 25도에 보관할 수 있습니다. 그런 다음 2일마다 신선한 해당 매체가 포함된 새 바이알로 전송합니다.여성의 바이알에 애벌레가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 다음 치료를 위해 다른 순차 번호로 바이알을 라벨로 지정합니다. 마취 후, EE2 없이 신선한 옥수수 밀 토마토 매체를 포함하는 작은 유리병에 하나의 EE2 용매 처리 된 여성을 전송하고 전체에 걸쳐 제어를위한 하나의 EE2 용매 처리 남성을 추가합니다.EE2 용매 처리 된 여성 또는 EE2 처리 된 여성과 각 처리에 대해 EE2 용매 처리 된 남성과 EE2 처리 된 남성과 EE2 처리 된 남성과 쌍. 25도에서 20 개의 단일 십자가를 집. 각 짝짓기 쌍을 EDC 없이 매일 10일 동안 신선한 옥수수밀 토마토 미디엄 바이알로 옮기습니다.각 유리병을 매일 검사하여 달걀을 검사하고 불임 스프레드시트에 해당 수치를 보고합니다. 각 병병에서 새로 나타난 파리를 면밀히 확인하고 10 일 동안 성인 자손의 일일 수를 기록하십시오. 초기 짝짓기로부터 10일 후에 는 마지막 바이알 시리즈에서 부모를 제거합니다.백과 분석 프로토콜에서, 첫째, 각 처리 단에 대 한, 설정 10 젊은의 유리병을 설정, 건강 한 파리 는 2 일 미만, 각각 6 여성과 3 개의 남성 에 10 EDC 없이 옥수수 밀 음식의 밀리 리터에 남성. 24 시간 동안 음식에 파리를 후면하고 짝짓기를 허용합니다. 그런 다음 처리 군당 10개의 병렬 바이알을 다른 EDC 농도로 보충한 신선한 옥수수밀 식품 또는 EE2 용매만으로도 대조군을 위해 준비한다.메이트 된 파리를 이 새로운 바이알로 옮기. 다른 시리즈를 기록하기 위해 개발 스프레드시트를 만듭니다. 파리가 16시간 동안 알을 낳도록 허용하십시오.그런 다음 바이알에서 부모를 제거합니다. 3~4일 동안 25도의 바이알을 배양하거나, 방황하는 애벌레가 보일 때까지 배양합니다. 매일, 같은 강아지를 두 번 계산하지 않도록 유리병의 외부에 각 강아지에 의해 순서대로 숫자를 작성하여 각 유리병에 새로운 강아지의 수를 계산합니다.새로 등장한 강아지의 수를 3~4일 동안 신고하거나 더 이상 새끼 모양이 없을 때까지 보고한다. 9일부터 는 더 이상 성인이 나오지 않는 신흥 성인의 수를 매일 계산합니다. 개발 스프레드시트에 보고하고 원고에 따라 나머지 백과 분석 작업을 수행합니다.수명 프로토콜에서, 먼저 8 명의 여성과 4 명의 수컷으로 20 개의 바이알을 설치하고 각각 10 밀리리터의 옥수수 밀 로 가득 채우고 섭씨 25도에 보관하십시오. 4 일 후, 파리를 버리고 바이알을 인큐베이터에 다시 놓습니다. 9일 늦은 오후에 새로 나타난 파리를 바이알에서 제거하고 바이알을 인큐베이터로 되돌려 보입니다.16~24시간 후, 두 남녀 의 1일 된 성인 파리 250마리를 가벼운 이산화탄소 마취하에 4개의 그룹으로 나누고 성인 중형 식품을 함유한 250밀리리터 병으로 옮기고, 3개는 다른 EDC 농도로 보충되고, EE2 용매를 단독으로 사용하여 1마리를 섭취한다. 2~3일 동안 25도의 비행도유지하여 짝짓기를 할 수 있도록 하십시오. 그런 다음, 두 그룹으로 섹스로 파리의 각 집단을 정렬합니다.각 치료 조건 내에서, 남녀 모두에 대 한, 무작위로 바이알 당 20 개인의 밀도에 5 개의 병렬 바이알으로 각 그룹을 세분화. 죽은 파리의 수가 이전 전송에서 살아남은 파리 의 수에서 빼는 수명 스프레드시트를 준비하여 각 전송의 생존자 수를 자동으로 얻습니다. 3 일 후, 동시에 해당 음식을 포함하는 새로운 바이알에 마취없이 파리를 전송하고 죽음을 확인합니다.파리의 나이와 죽은 파리의 수를 기록합니다. 모든 파리가 죽을 때까지 3 일마다 전송을 반복합니다. 이 실험에서 수명 곡선은 각 EDC 농도 및 제어에 대해 경과된 일과 비교하여 누적 된 생존으로 플롯되었습니다.제어를 위해, 생존 곡선이 상대적으로 높은 유지긴 긴 초기 기간 후, 그것은 약 60 일 후 기하 급수적으로 감소했다. EDC 노출 후 처리된 파리의 생존 곡선이 크게 영향을 받았으며 36일 후에 극적인 감소를 보였습니다. 분석 중인 병렬 바이알이 매우 유사해야 하며, 그렇지 않으면 어떤 것을 버릴지 이해하기 어려울 것입니다.따라서, 우리는 큰 샘플 크기를 사용하여 좋은 실험 연습을 채택, 세심한주의를 기울이는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에 따라, 또한 선택된 내분비 중단기의 트랜스제너레이션 영향을 평가하고 다른 내분비 파괴자의 조합의 잠재적 인 첨가제 효과를 테스트할 수도 있다.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

연구

발생학

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

과일 비행을 양육<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 무균 및 무균 조건에서

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

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Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

녹고, 경작, 그리고 초파리 셀 라인 Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

초파리 멜라노가스터의 혈액-뇌 장벽 무결성에 대한 분석

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Drosophila melanogaster Third Instar 유충의 살아있는 뇌 이식 이미징

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

저자 스포트라이트: 비대칭 세포 분열 역학 조사: 초파리 유충 뇌 외식의 실시간 이미징을 위한 프로토콜 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...