Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Forfatterne takker Orsolina Petillo for teknisk støtte. Forfatterne takker Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) for bibliografisk støtte. Forfatterne takker Dr. Gustavo Damiano Mita for å innføre dem til EDC verden. Forfatterne takker Leica Microsystems og Pasquale Romano for deres assistanse. Denne forskningen ble støttet av Project PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie orientere Alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica i Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Prosjekt PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

1. matlaging
<ol><li>
For lager vedlikehold og for larvestadiet vekst, bruk et cornmeal medium som inneholder 3% pulverisert gjær, 10% sukrose, 9% precooked cornmeal, 0,4% agar, deretter kalt cornmeal medium (CM).
	<ol>
<li>Sett 30 g gjær i 100 mL vann fra springen, bringe den til en byll og la det koke i 15 min.</li>
		<li>Separat, bland godt 90 g precooked cornmeal, 100 g sukker, og 4 g av agar inn 900 mL vann fra springen.</li>
		<li>Bring løsningen til en byll, Senk varmen og stek i 5 minutter s...

Frukten fly D. melanogaster har vært utstrakt ansatt som et in vivo-modell system for å undersøke de potensielle virkningene av miljø EDCS som DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31, 32, DEHP33og EE234. Flere grunner har ledet sin bruk som en modell på dette forskningsområdet. Bortsett fra dens ubestridte fordeler som et model...

Menneskelige aktiviteter har blitt sluppet ut i miljøet en massiv mengde kjemikalier, som representerer et alvorlig problem for organismer og for naturlige økosystemer1. Av disse forurensende stoffer, er det anslått at om 1 000 forskjellige kjemikalier kan endre den normale balansen av endokrine systemer; henhold til denne eiendommen, er de klassifisert som endokrine forstyrre kjemikalier (EDCs). Nærmere bestemt, basert på en nylig definisjon av det endokrine samfunn, EDCs er "en eksogene kjemisk, eller blanding av kjemikalier, som kan forstyrre noen aspekter av hormon handling"2. I løpet av de siste tre ti årene har det vært økende vitenskapelige bevis for at EDCs kan påvirke reproduksjon og utvikling av dyr og planter3,4,5,6,7, 8i den. Videre har EDC eksponering vært knyttet til den økende utbredelsen av noen menneskelige sykdommer, inkludert kreft, fedme, diabetes, skjoldbrusk sykdommer, og atferdsforstyrrelser9,10,11.
Generelle mekanismer for EDC
På grunn av deres molekylære egenskaper, EDCs oppfører seg som hormoner eller hormon preK UrsOrer3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. I denne forstand, de kan binde til et hormon reseptor og forstyrre endokrine systemer enten ved å etterligne hormon aktivitet eller ved å blokkere endogene hormoner bindende. I det første tilfellet, etter binding til reseptoren, de kan aktivere det som sin naturlige hormonet ville gjøre. I det andre tilfellet, binding av EDC til reseptoren hindrer bindingen av sin naturlige hormon, slik at reseptoren er blokkert og kan ikke lenger aktiveres, selv i nærvær av sin naturlige hormon3. Som en konsekvens, EDCs kan påvirke flere prosesser, for eksempel syntese, sekresjon, transport, metabolisme, eller perifere handling av endogene hormoner som er ansvarlig for vedlikehold av homeostase, reproduksjon, utvikling, og/eller atferd av organismen. Reseptor binding er ikke den eneste handlingsmåten som beskrives så langt for EDCs. Det er nå klart at de kan også fungere ved å rekruttere coactivators eller corepressors i enzymatisk trasé eller ved å endre epigenetic markører deregulating genuttrykk10,11,12,13 ,14, med konsekvenser ikke bare for den nåværende generasjonen, men også for helsen til generasjoner framover8.
Drosophila hormoner
Den potensielle effekten av utvalgte EDCs har blitt studert mye, både i dyrearter og i flere modellsystemer der endokrine mekanismer er rimelig godt kjent. For virvelløse dyr, endokrine systemer som påvirker vekst, utvikling og reproduksjon har vært omfattende preget i insekter av flere grunner, som involverer deres omfattende bruk innen biologisk forskning, deres økonomiske betydning, og endelig utvikling av insektmidler i stand til å forstyrre spesielt med hormon systemet av pest insekter.
Spesielt blant insekter, frukten fly D. melanogaster har vist seg å være en svært kraftig modell system for å evaluere den potensielle endokrine effekten av EDCs. I D. melanogaster, så vel som i virveldyr, hormoner spille en viktig rolle gjennom hele livssyklusen. I denne organismen, det er tre viktigste hormonelle systemer, som involverer steroid hormonet 20-hydroxyecdysone (20e)15,16, sesquiterpenoid juvenile Hormone (JH)17, og nevropeptider og peptid/protein hormoner18. Denne tredje gruppen består av flere peptider oppdaget mer nylig, men tydelig involvert i et stort utvalg av fysiologiske og atferdsmessige prosesser, slik som lang levetid, homeostase, metabolisme, reproduksjon, minne og Locomotor kontroll. 20E er homologe til kolesterol-avledet steroid hormoner som østradiol, mens JH aksjer noen likheter med retinoic syre; begge er de bedre kjente hormonene i Drosophila19,20. Deres balanse er viktig å koordinere molting og forvandling, samt i å kontrollere flere postdevelopmental prosesser, slik som reproduksjon, levetid, og atferd21, og dermed tilbyr ulike muligheter for testing endokrine forstyrrelser i Drosophila. Videre, ecdysteroid hormoner og JHs er de viktigste målene for den såkalte tredje generasjons insektmidler, utviklet for å forstyrre utviklingsmessige og reproduktive endokrine-mediert prosesser i insekter. Den Agonistiske eller motstander modus av handlingen av disse kjemikaliene er godt kjent, og dermed kan de tjene som referanse standarder for å evaluere effekten av potensielle EDCs på vekst, reproduksjon, og utvikling av insekter22. For eksempel, methoprene, som har vært mye brukt i kontrollerende mygg og andre akvatiske insekter23,24, fungerer som en JH Agonistiske og fortrenger 20e-indusert genet transkripsjon og forvandling.
I tillegg til hormoner, den kjernefysiske reseptor (NR) overfamilie i Drosophila er også godt kjent; Det består av 18 evolutionarily bevart transkripsjon faktorer involvert i kontrollerende hormon avhengig utviklingsmessige trasé, samt reproduksjon og fysiologi25. Disse hormon NRs tilhører alle seks NR overfamilie under typer, inkludert de som er involvert i neurotransmission26, to for retinoic acid NRS, og de for steroid NRS som, i virveldyr, representerer en av de primære målene for EDCs27.
Drosophila som et modell system for å studere EDCs
For tiden, på grunnlag av molekylære egenskaper, flere miljø etater rundt om i verden er tildele potensialet til å forstyrre de endokrine systemer til ulike menneskeskapte kjemikalier. Gitt at EDCs er et globalt og allestedsnærværende problem for miljøet og for organismer, er det overordnede målet for forskningen på dette feltet for å redusere deres sykdoms byrde, samt å beskytte levende organismer fra deres bivirkninger. For å utdype forståelsen om de potensielle endokrine virkningene av en kjemisk, er det nødvendig å teste den in vivo. For dette formål representerer D. melanogaster et gyldig modell system. Hittil har frukten fly blitt mye brukt som in vivo-modell for å evaluere virkningene av flere miljømessige EDCs; Det har blitt rapportert at eksponering for flere EDCs, for eksempel dibutyl ftalat (DBP)28, bisfenol A (BPA), 4-nonylfenol (4-np), 4-tert-octylphenol (4-TERT-op)29, metylparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31, 32, BIS-(2-etylheksyl) FTALAT (DEHP)33, og 17-α-etinyløstradiol (EE2)34, påvirkninger metabolisme og endokrine funksjoner som i virveldyr modeller. Flere grunner har ført til sin bruk som en modell på dette forskningsområdet. Utover en god kjennskap til sine endokrine systemer, ytterligere fordeler inkluderer sin korte livssyklus, lave kostnader, lett manipulable Genova, en lang historie med forskning, og flere tekniske muligheter (se FlyBase nettsted, http://flybase.org/). D. melanogaster gir også en kraftig modell for enkelt å studere transgenerational effekter og befolknings reaksjoner på miljøfaktorer8 og unngår etiske problemstillinger som er relevante for in vivo-studier hos høyere dyr. I tillegg har frukten fly aksjer en høy grad av gen bevaring med mennesker som kan gjøre det mulig for Drosophila EDC analyser for å hjelpe med å forutsi eller foreslå potensielle virkningene av disse kjemikaliene for menneskers helse. Foruten å utvide forståelsen om menneskers helseeffekter, kan Drosophila bidra til å vurdere risikoen for EDC eksponering for miljøet, slik som tap av biologisk mangfold og miljøødeleggelser. Til slutt tilbyr frukten fly den ekstra fordelen av å være brukt i laboratorier, hvor de faktorer som potensielt påvirker sin utvikling, reproduksjon, og levetid kan holdes under kontroll for å tillegge enhver variasjon til stoffet som skal testes.
Med dette i bakhodet, har vi optimalisert enkle og robuste fitness analyser for å bestemme EDC effekter på noen Drosophila hormonelle egenskaper, slik som fekunditet/fruktbarhet, utviklingsmessige timing, og voksen levetid. Disse analysene har blitt mye brukt i noen EDCs23, 24,25,26,27. Spesielt har vi brukt følgende protokoller for å evaluere effekten av eksponeringen til syntetisk østrogen EE234 og til BPA og til bisfenol AF (BPA F) (upubliserte data). Disse protokollene kan lett endres for å undersøke virkningene av en gitt EDC om gangen, samt den kombinerte effekten av flere EDCs i D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

I de senere årene har det vært økende bevis for at alle organismer og miljøet er eksponert for hormon-lignende kjemikalier, kjent som endokrine disruptor kjemikalier (EDCs). Disse kjemikaliene kan endre den normale balansen av endokrine systemer og føre til bivirkninger, samt et økende antall hormonelle lidelser i den menneskelige befolkning eller forstyrret vekst og redusert reproduksjon i dyrelivet arter. For noen EDCs, det er dokumentert helseeffekter og restriksjoner på bruken. Men for de fleste av dem, er det fortsatt ingen vitenskapelige bevis i denne forstand. For å verifisere potensielle endokrine effekter av en kjemisk i hele organismen, må vi teste den i riktig modellsystemer, så vel som i frukten fly, Drosophila melanogaster. Her rapporterer vi detaljert in vivo protokoller for å studere endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressering EDC effekter på fekunditet/fruktbarhet, utviklingsmessige timing, og levetid på fly. I de siste årene, brukte vi disse Drosophila liv egenskaper for å undersøke virkningene av eksponering for 17-α-etinyløstradiol (EE2), bisfenol A (BPA), og bisfenol AF (BPA F). Tilsammen, disse analysene dekket alle Drosophila liv stadier og gjorde det mulig å evaluere endokrine forstyrrelser i alle hormon-mediert prosesser. Fekunditet/fruktbarhet og utviklingsmessige timing analysene var nyttige for å måle EDC innvirkning på fly reproduktiv ytelse og på utviklingsmessige stadier, henholdsvis. Til slutt, levetid analysen involvert kroniske EDC eksponeringer til voksne og målte deres survivorship. Men disse livet egenskaper kan også være påvirket av flere eksperimentelle faktorer som måtte være nøye kontrollert. Så, i dette arbeidet, foreslår vi en rekke prosedyrer vi har optimalisert for riktig utfall av disse analysene. Disse metodene tillater forskere å etablere endokrine avbrudd for noen EDC eller for en blanding av ulike EDCs i Drosophila, men å identifisere den endokrine mekanismen ansvarlig for effekten, ytterligere essays kan være nødvendig.

I denne delen er viktige trinn i protokollene ovenfor rapportert i form av forenklede ordninger. Gitt at fluer har en tendens til å unngå usmakelig forbindelser, den første tingen å gjøre er å analysen smaken av den valgte EDC. Dette kan gjøres ved å blande en konditorfarge (for eksempel rød mat Dye nr. 40)35 med maten supplert med den valgte EDC på ulike doser eller med løsemiddel alene. Fluer matet på disse mediene er undersøkt under en stereomikroskopet og matinntaket er anslått a...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endokrine disruptor kjemikalier (EDCs) representerer et alvorlig problem for organismer og for naturlige miljøer. Drosophila melanogaster representerer en ideell modell for å studere EDC effekter in vivo. Her presenterer vi metoder for å undersøke endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressering EDC effekter på fekunditet, fruktbarhet, utviklingsmessige timing, og levetid på fly.

Metoder for å teste endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster er en kraftig modell for å evaluere in vivo de potensielle giftige og endokrine effektene av kjemikalier, som endokrine disruptors, som representerer et alvorlig problem for menneskers helse og naturlige miljøer. Adressering effekten av EDCs på hormonelle livstrekk av fly, som fecundity, fruktbarhet, utviklingstid, og levetiden. Det er en enkel, billig og rask måte å undersøke endokrine forstyrrelser in vivo.Fruktbarheten, utviklingen og levetiden i Drosophila kan påvirkes av flere faktorer som må kontrolleres nøye for å sikre det vellykkede resultatet av denne protokollen. Derfor er det nødvendig med maksimal oppmerksomhet i oppdrett og håndtering av fluer. For å analysere smaken av den valgte EDC, etter bedøvelse, overfør 15 unge fluer fra flysengen til fire parallelle hetteglass som inneholder maismel medium blandet med en matfaring.Kontroll hetteglasset inneholder oppløsningsvæsken alene, og de tre andre hetteglassene suppleres med ulike doser av de valgte EDCene. Oppbevar hetteglassene i en fuktet inkubator i en dag med et naturlig 12-timers lys. Etter å ha bedøvet fluene igjen, overfør de immobiliserte fluene til et hvitt papir, og legg den under et stereomikroskop for å observere.Sammenlign bukfargen til hver behandlingsgruppe med hensyn til kontrollgruppen. For å analysere fluenes reproduktive ytelse, lag tre hetteglass med fluer for hver EDC som foreldrehettekjøtt, med åtte kvinner og fire menn i 10 milliliter maismel medium supplert med EE2. For kontrollen, lag seks hetteglass med fluer, hver med åtte kvinner og fire menn i 10 milliliter maismel medium mat supplert med EE2 løsemiddel.Bak flyr i en inkubator ved 25 grader Celsius. Under utviklingen, unngå overbefolkning av larver. Etter fire dager inverterer hvert hetteglass over en eterizer for å fjerne foreldrene og returnere hetteglassene til inkubatoren i fem dager til.Sent på ettermiddagen på dag ni, inverter hvert hetteglass over en eterizer for å fjerne alle nyoppståtte fluer fra hetteglassene og legg hetteglassene i en annen inkubator ved 18 grader Celsius over natten. Om morgenen på dag 10, på en Drosophila karbondioksidarbeidsstasjon, snu forsiktig kulturhettealet for å forhindre at bedøvede fluer faller på middels og setter inn et gummirør med en nål inn i hetteglasset mellom bomullsproppen og hetteglassveggen. Åpne ventilen for å levere karbondioksid.I løpet av sekunder, overfør fluene til en flyseng under et mikroskop. Samle jomfrukvinner og unge menn separat i to grupper på flysengen. Del tilfeldig hver gruppe fluer i små undergrupper, med 10 kvinner eller 20 menn per hetteglass fylt med ferskt tilsvarende maismelmedium.Fortsett inkubasjon og samle 30 jomfrukvinner og 30 menn for hver EDC, og 90 jomfru kvinner og 90 menn for kontroll. Hus disse gruppene av fluer på 25 grader Celsius til de er i alderen fire dager etter eclosion. Deretter overfører du dem til nye hetteglass som inneholder ferskt tilsvarende medium annenhver dag.Sjekk at det ikke er larver i hetteglassene til kvinner. Deretter etikett hetteglass med en annen serie av sekvensielle tall for følgende behandling. Etter bedøvelse overfører du en EE2-behandlet kvinne til et lite hetteglass som inneholder ferskt maismeltomatmedium uten EE2 og legger til en EE2-løsningsmiddelbehandlet mann for kontrollen på tvers.Par en EE2-behandlet mann med EE2-behandlet kvinne eller EE2-behandlet kvinne med EE2-behandlet mann til hver behandling. Hus 20 enkelt kors på 25 grader Celsius. Overfør hvert parringspar til friske maismeltotomede hetteglass uten EDC hver dag de påfølgende 10 dagene.Inspiser hvert hetteglass visuelt hver dag for eggene og rapporter deres nummer på fruktbarhetsregnearket. I hvert hetteglass, sjekk nøye for nyoppståtte fluer og registrer det daglige antallet voksne avkom i løpet av 10-dagers perioden. Etter 10 dager fra den første parring, fjern foreldrene fra den siste serien av hetteglass.I eclosion analyseprotokoller, først, for hver behandlingsgruppe, satt opp 10 hetteglass med unge, sunne fluer mindre enn to dager gammel, hver med seks kvinner og tre menn i 10 milliliter maismel mat uten EDC. Bak fluene på mat i 24 timer og la dem parre seg. Deretter forberede ytterligere 10 parallelle hetteglass per behandlingsgruppe med 10 milliliter hver av fersk maismel mat supplert med ulike EDC konsentrasjoner eller EE2 løsemiddel alene for kontroll.Overfør de parret fluene til disse nye hetteglassene. Lag et utviklingsregneark for å registrere de ulike seriene. La fluene legge egg i 16 timer.Fjern deretter foreldrene fra hetteglassene. Inkuber hetteglassene ved 25 grader Celsius i tre til fire dager, eller til vandrende larver er synlige. Hver dag teller du antall nye pupper i hvert hetteglass ved å skrive et nummer i rekkefølge av hver pupa på utsiden av hetteglasset for å unngå å telle samme pupper to ganger.Rapporter antall nyoppståtte pupper i tre til fire dager, eller til ikke mer pupae form. Fra dag ni teller antall nye voksne daglig, til det ikke kommer flere voksne. Rapporter det om utviklingsregnearket og utfør resten av eclosion-analysen i henhold til manuskriptet.I levetidsprotokollen satte du først opp 20 hetteglass med åtte kvinner og fire menn, hver fylt med 10 milliliter maismelmat og huser dem ved 25 grader Celsius. Etter fire dager, kast fluene og legg hetteglassene tilbake i inkubatoren. Sent på ettermiddagen på dag ni fjerner du alle nyoppståtte fluer fra hetteglassene og returnerer hetteglassene til inkubatoren.Etter 16 til 24 timer, del 250 endags gamle voksne fluer av begge kjønn i fire grupper under lett karbondioksidbedøvelse og overfør dem til 250-milliliter flasker som inneholder voksen middels mat, tre supplert med forskjellige EDC-konsentrasjoner og en med EE2-løsningsmidlet alene. Opprettholde fluene på 25 grader Celsius i to til tre dager for å tillate dem å parre seg. Deretter sorterer hver kohort av fluer etter sex i to grupper.Innenfor hver behandlingstilstand, for begge kjønn, tilfeldig dele hver gruppe i fem parallelle hetteglass med en tetthet på 20 personer per hetteglass. Forbered et levetidsregneark der antall døde fluer trekkes fra antall overlevende fluer fra forrige overføring, slik at antall overlevende ved hver overføring automatisk hentes. Etter tre dager, overfør fluene uten anestesi til nye hetteglass som inneholder tilsvarende mat samtidig og se etter døden.Registrer alderen på fluene og antall døde fluer. Gjenta overføringen hver tredje dag til alle fluene dør. I dette eksperimentet ble levetidskurver plottet som det kumulative overlevende sammenlignet med de forløpte dagene for hver EDC-konsentrasjon og kontrollen.For kontrollen, etter en lang innledende periode hvor overlevelseskurven forble relativt høy, falt den eksponentielt etter ca. 60 dager. Etter EDC-eksponering ble overlevelseskurven til de behandlede fluene påvirket betydelig og viste dramatisk nedgang etter 36 dager. Det anbefales om at parallelle hetteglass under analyse skal være svært like, ellers vil det være vanskelig å forstå hvilken du skal kaste.Derfor foreslår vi å ta stor forsiktighet, vedta en god eksperimentell praksis, ved hjelp av en stor prøvestørrelse. Etter disse protokollene, Det er også mulig å evaluere transgenerasjonelle virkningen av en valgt endokrine disruptor samt å teste de potensielle additiv effekter av en kombinasjon av ulike endokrine disruptors.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Analyse av blodcellepopulasjoner i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Oppdragelse bananflue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Under Axenic og gnotobiotiske betingelser

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Metoder for å undersøke lymfekjertel og Hemocytes i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protokoller for Visualisering Steroidogenic organer og deres Interaktiv organer med Farging i bananflue<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Analysen for Blood-Brain Barrier integritet i Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Hele dyrets avbildning av Drosophila melanogaster ved hjelp av mikrocomputert tomografi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Avbildning av levende hjerneeksplantasjoner fra Drosophila melanogaster Third Instar larver

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Forfatter Spotlight: Undersøkelse av asymmetrisk celledelingsdynamikk: En protokoll for levende avbildning av Drosophila-larvehjerneeksplantater 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Live-Cell Imaging av Drosophila melanogaster Tredje Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...