Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
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Os autores agradecem Orsolina Petillo pelo apoio técnico. Os autores agradecem ao Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) pelo apoio bibliográfico. Os autores agradecem ao Dr. Gustavo Damiano Mita por apresentá-los ao mundo EDC. Os autores agradecem à Leica Microsystems e ao Pasquale romano por sua assistência. Esta pesquisa foi apoiada pelo projeto PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate Alla rigenerazione e ricostruzione tissutale, Implantologia e sensoristica em odontoiatria/oculistica" sigla "sorriso"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projeto PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

1. preparação de alimentos
<ol><li>
Para a manutenção de estoque e para o crescimento larval, use um meio de farinha de milho contendo 3% de fermento em pó, 10% de sacarose, 9% de farinha de milho pré-cozida, 0,4% de agar, depois chamado meio de farinha de milho (CM).
	<ol>
<li>Coloque 30 g de fermento em 100 mL de água da torneira, leve-o a ferver e deixe ferver por 15 min.</li>
		<li>Separadamente, misture bem 90 g de farinha de milho pré-cozida, 100 g de açúcar e 4 g de agar em 900 mL de ?...

O Fruit Fly D. melanogaster tem sido extensivamente empregado como um sistema in vivo modelo para investigar os efeitos potenciais de EDCs ambientais, tais como DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31, 32, DEHP33, e EE234. Várias razões levaram seu uso como modelo neste campo de pesquisa. Aparte de suas vantagens indiscutíveis com...

As actividades humanas têm vindo a libertar no ambiente uma enorme quantidade de produtos químicos, que representam um grave problema para os organismos e para os ecossistemas naturais1. Destes poluentes, estima-se que cerca de 1.000 produtos químicos diferentes podem alterar o equilíbrio normal dos sistemas endócrinos; de acordo com esta propriedade, eles são classificados como produtos químicos de desregulação endócrina (EDCs). Especificamente, com base em uma definição recente pela sociedade endócrina, os EDCs são "um produto químico exógeno, ou mistura de produtos químicos, que podem interferir com qualquer aspecto da ação hormonal"2. Ao longo das últimas três décadas, tem havido crescente evidência científica de que os EDCs podem afetar a reprodução e o desenvolvimento de animais e plantas3,4,5,6,7, a 8. Além disso, a exposição à EDC tem sido relacionada à crescente prevalência de algumas doenças humanas, incluindo câncer, obesidade, diabetes, doenças da tireoide edistúrbios comportamentais9,10,11.
Mecanismos gerais de EDC
Devido às suas propriedades moleculares, os EDCs comportam-se como hormônios ou precursores hormonais3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. Neste sentido, eles podem se ligar ao receptor de um hormônio e perturbar os sistemas endócrinos, quer imitando a atividade hormonal ou bloqueando hormônios endógenos obrigatório. No primeiro caso, após a ligação ao receptor, eles podem ativá-lo como seu hormônio natural faria. No outro caso, a ligação do EDC ao receptor impede a ligação de seu hormônio natural, de modo que o receptor é bloqueado e não pode mais ser ativado, mesmo na presença de seu hormônio natural3. Consequentemente, os EDCs podem afetar vários processos, como a síntese, secreção, transporte, metabolismo ou ação periférica de hormônios endógenos que são responsáveis pela manutenção da homeostase, reprodução, desenvolvimento e/ou comportamento de o organismo. A ligação do receptor não é a única maneira de ação descrita até agora para os EDCs. Agora é evidente que eles também podem atuar recrutando coativadores ou corepressores em vias enzimáticas ou modificando marcadores epigenéticosdesregulando a expressão gênica10,11,12,13 ,14, com conseqüências não somente para a geração atual mas também para a saúde das gerações para vir8.
Hormônios da Drosophila
Os efeitos potenciais dos EDCs selecionados têm sido amplamente estudados, tanto nas espécies de animais selvagens como em vários sistemas de modelos nos quais os mecanismos endócrinos são razoavelmente conhecidos. Para os invertebrados, os sistemas endócrinos que influenciam o crescimento, o desenvolvimento e a reprodução têm sido extensivamente caracterizados em insetos por várias razões, envolvendo seu uso extensivo no campo da pesquisa biológica, sua importância econômica e Finalmente, o desenvolvimento de inseticidas capazes de interferir especificamente com o sistema hormonal de insetos pragas.
Em particular, entre os insetos, o fruto mosca D. melanogaster provou ser um sistema de modelo muito poderoso para avaliar os efeitos endócrinos potenciais de EDCs. Em D. melanogaster, bem como em vertebrados, os hormônios desempenham um papel importante ao longo de todo o ciclo de vida. Neste organismo, existem três principais sistemas hormonais, que envolvem a hormona esteróide 20-hidroxiecdysona (20e)15,16, o hormônio juvenil sesquiterpenóide (JH)17, e os neuropeptídeos e peptídeos/proteínas hormônios18. Este terceiro grupo consiste em vários peptídeos descobertos mais recentemente, mas claramente envolvidos em uma enorme variedade de processos fisiológicos e comportamentais, como longevidade, homeostase, metabolismo, reprodução, memória e controle locomotor. 20E é homóloga aos hormônios esteróides derivados do colesterol, como o estradiol, enquanto JH compartilha algumas semelhanças com o ácido retinóico; Ambos são os hormônios mais conhecidos em Drosophila19,20. Seu equilíbrio é vital na coordenação da muda e metamorfose, bem como no controle de vários processos pós-desenvolvimentais, tais como reprodução, vida útil e comportamento21, oferecendo assim diferentes possibilidades para testar a glândula endócrina perturbação na Drosophila. Além disso, os hormônios ecdiesteróide e JHS são os principais alvos dos chamados inseticidas de terceira geração, desenvolvidos para interferir com os processos de desenvolvimento e mediado por endócrinos em insetos. O modo de ação agonista ou antagonista desses produtos químicos é bem conhecido e, portanto, eles podem servir como padrões de referência para avaliar os efeitos de potenciais EDCs sobre o crescimento, reprodução e desenvolvimento de insetos22. Por exemplo, o Methoprene, que tem sido amplamente utilizado no controle de mosquitos e outros insetos aquáticos23,24, funciona como um agonista JH e reprisa a transcrição e metamorfose do gene 20e-induced.
Além dos hormônios, a superfamília de receptores nucleares (NR) em Drosophila também é bem conhecida; consiste em 18 fatores de transcrição evolutivamente conservados envolvidos no controle de vias de desenvolvimento dependentes de hormônio, bem como na reprodução e fisiologia25. Estes NRS da hormona pertencem a todos os seis subtypes da superfamília do NR, incluindo aqueles envolvidos na neurotransmissão26, dois para NRS do ácido retinóico, e aqueles para NRS esteróides que, nos Vertebrates, representam um dos alvos preliminares de EDCs27.
Drosophila como um sistema modelo para estudar EDCs
Atualmente, com base em Propriedades moleculares, várias agências ambientais em todo o mundo estão atribuindo o potencial de interferir com os sistemas endócrinos para diferentes produtos químicos feitos pelo homem. Dado que os FED constituem um problema global e onipresente para o ambiente e para os organismos, o objectivo geral da investigação neste domínio é reduzir a sua carga de doença, bem como proteger os organismos vivos dos seus efeitos adversos. A fim de aprofundar o entendimento sobre os potenciais efeitos endócrinos de um produto químico, é necessário testá-lo in vivo. Para este fim, D. melanogaster representa um sistema de modelo válido. Até o momento, a mosca-das-frutas tem sido amplamente utilizada como modelo in vivo para avaliar os efeitos de vários EDCs ambientais; foi relatado que a exposição a vários EDCs, como o ftalato de dibutilo (PAD)28, bisfenol A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-Octilfenol (4-tert-op)29, metilparabeno (MP)30, Etilparabeno (EP)31, 32, bis-(2-ethylhexyl) phthalate (dehp)33, e 17-α-Etinilestradiol (EE2)34, influencia o metabolismo e as funções endócrinas como em modelos vertebrados. Várias razões levaram ao seu uso como modelo neste campo de pesquisa. Além de um excelente conhecimento de seus sistemas endócrinos, outras vantagens incluem seu ciclo de vida curto, baixo custo, genoma facilmente manipulável, uma longa história de pesquisa e várias possibilidades técnicas (consulte o site do FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster também fornece um modelo poderoso para facilmente estudar efeitos transgeracionais e respostas da população a fatores ambientais8 e evita questões éticas relevantes para estudos in vivo em animais mais elevados. Além, a mosca da fruta compartilha de um alto nível da conservação do gene com os seres humanos que puderam fazer possível para que os ensaios de Drosophila EDC ajudem em prever ou em sugerir efeitos potenciais destes produtos químicos para a saúde humana. Além de ampliar o entendimento sobre os efeitos da saúde humana, a Drosophila pode ajudar a avaliar os riscos da exposição ao ambiente EDC, como a perda de biodiversidade e a degradação ambiental. Finalmente, a mosca da fruta oferece a vantagem adicional de ser usado nos laboratórios, onde os fatores que afetam potencial seu desenvolvimento, reprodução, e vida útil podem ser mantidos o controle a fim atribuir toda a variação à substância a ser testada.
Com isso em mente, otimizamos os ensaios de condicionamento físico simples e robusto para determinar os efeitos do EDC em alguns traços hormonais da Drosophila, como fecundidade/fertilidade, tempo de desenvolvimento e vida adulta. Estes ensaios têm sido amplamente utilizados para alguns EDCs23, 24,25,26,27. Em particular, foram utilizados os seguintes protocolos para avaliar os efeitos da exposição ao estrogênio sintético EE234 e ao BPA e ao BISFENOL AF (BPA F) (dados não publicados). Esses protocolos podem ser facilmente modificados para investigar os efeitos de um determinado EDC de cada vez, bem como os efeitos combinados de múltiplos EDCs em D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

Nos últimos anos, tem havido uma crescente evidência de que todos os organismos e o meio ambiente estão expostos a produtos químicos semelhantes a hormônios, conhecidos como produtos químicos do disruptor endócrino (EDCs). Estes produtos químicos podem alterar o equilíbrio normal dos sistemas endócrinos e levar a efeitos adversos, bem como um número crescente de distúrbios hormonais na população humana ou o crescimento perturbado e redução da reprodução nas espécies selvagens. Para alguns EDCs, existem efeitos de saúde documentados e restrições sobre a sua utilização. No entanto, para a maioria deles, ainda não há evidências científicas nesse sentido. A fim de verificar os potenciais efeitos endócrinos de um produto químico no organismo completo, precisamos testá-lo em sistemas de modelo adequados, bem como na mosca da fruta, Drosophila melanogaster. Aqui nós relatamos detalhado in vivo protocolos para estudar o rompimento da glândula endócrina em Drosophila, abordando efeitos de EDC na fecundidade/fertilidade, no sincronismo desenvolvente, e no tempo da mosca. Nos últimos anos, utilizamos esses traços de vida de Drosophila para investigar os efeitos da exposição a 17-α-Etinilestradiol (EE2), bisfenol A (BPA) e bisfenol AF (BPA F). Ao todo, esses ensaios cobriram todos os estágios de vida da Drosophila e possibilitava avaliar o rompimento endócrino em todos os processos mediados por hormônios. Os ensaios de fecundidade/fertilidade e tempo de desenvolvimento foram úteis para mensurar o impacto do EDC no desempenho reprodutivo de mosca e em estágios de desenvolvimento, respectivamente. Finalmente, o ensaio da vida envolveu exposições crônicas do EDC aos adultos e mediu sua sobrevivência. No entanto, esses traços de vida também podem ser influenciados por vários fatores experimentais que tiveram que ser cuidadosamente controlados. Assim, neste trabalho, sugerimos uma série de procedimentos que otimizamos para o resultado correto desses ensaios. Estes métodos permitem que os cientistas estabeleçam o rompimento da glândula endócrina para todo o EDC ou para uma mistura de EDCs diferentes em Drosophila, embora identifique o mecanismo da glândula endócrina responsável para o efeito, uns essays mais adicionais poderiam ser necessários.

Nesta seção, as etapas-chave dos protocolos acima são relatadas a forma de esquemas simplificados. Dado que as moscas tendem a evitar compostos inpalatáveis, a primeira coisa a fazer é o ensaio do gosto do EDC selecionado. Isto pode ser feito misturando uma coloração de alimento (por exemplo, corante vermelho do alimento no. 40)35 com o alimento suplementado com o EDC selecionado em várias doses ou com o solvente sozinho. Moscas alimentadas com esses meios são examinadas um estereomicrosc...

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Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Os produtos químicos do disruptor da glândula endócrina (EDCs) representam um problema sério para organismos e para ambientes naturais. A Drosophila melanogaster representa um modelo ideal para estudar os efeitos da EdC in vivo. Aqui, nós apresentamos métodos para investigar o rompimento da glândula endócrina em Drosophila, abordando efeitos de EDC na fecundidade, na fertilidade, no sincronismo desenvolvente, e no tempo da mosca.

Métodos para testar a perturbação endócrina na Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster é um modelo poderoso para avaliar in vivo os potenciais efeitos tóxicos e endócrinos de produtos químicos, como disruptores endócrinos, que representam um grave problema para a saúde humana e ambientes naturais. Abordando o efeito dos EDCs sobre os traços hormonais de vida da mosca, como fecundidade, fertilidade, tempo de desenvolvimento e a vida útil. É uma maneira fácil, barata e rápida de investigar a interrupção endócrina in vivo.A fertilidade, o desenvolvimento e a vida útil em Drosophila podem ser afetados por vários fatores que devem ser cuidadosamente controlados para garantir o sucesso deste protocolo. Portanto, é necessária máxima atenção na criação e manuseio de moscas. Para avaliar o sabor do EDC selecionado, após a anestesia, transfira 15 moscas jovens do leito de mosca para quatro frascos paralelos contendo meio de fubá misturado com uma coloração alimentar.O frasco de controle contém apenas o solvente, e os outros três frascos são suplementados com diferentes doses dos EDCs selecionados. Mantenha os frascos em uma incubadora umidificada por um dia com uma luz natural de 12 horas. Depois de anestesiar as moscas novamente, transfira as moscas imobilizadas para um papel branco, e coloque-a sob um microscópio estéreo para observar.Compare a coloração abdominal de cada grupo de tratamento em relação ao grupo controle. Para avaliar o desempenho reprodutivo das moscas, prepare três frascos de moscas para cada EDC como frascos parentais, com oito fêmeas e quatro machos em 10 mililitros de meio de fubá suplementados com EE2. Para o controle, prepare seis frascos de moscas, cada um com oito fêmeas e quatro machos em 10 mililitros de alimentos médios de fubá suplementados com solvente EE2.A traseira voa em uma incubadora a 25 graus Celsius. Durante seu desenvolvimento, evite a superlotação das larvas. Após quatro dias, inverta cada frasco sobre um eternte para remover os pais e devolva os frascos à incubadora por mais cinco dias.No final da tarde do nono dia, inverta cada frasco sobre um etherizer para remover todas as moscas recém-emergidas dos frascos e coloque os frascos em outra incubadora a 18 graus Celsius durante a noite. Na manhã do dia 10, em uma estação de trabalho de dióxido de carbono Drosophila, inverta cuidadosamente o frasco de cultura para evitar que moscas anestesiadas caiam em meio e insira um tubo de borracha com uma agulha no frasco entre a rolha de algodão e a parede do frasco. Abra a válvula para fornecer dióxido de carbono.Em questão de segundos, transfira as moscas para uma cama de mosca sob um microscópio. Colete fêmeas virgens e machos jovens separadamente em dois grupos na cama de mosca. Subdividir aleatoriamente cada grupo de moscas em pequenos subgrupos, com 10 fêmeas ou 20 machos por frasco preenchido com meio de fubá correspondente fresco.Continue a incubação e colete 30 fêmeas virgens e 30 machos para cada EDC, e 90 fêmeas virgens e 90 machos para o controle. Abriga esses grupos de moscas a 25 graus Celsius até que tenham quatro dias de idade após a eclosão. Em seguida, transfira-os para novos frascos contendo meio correspondente fresco a cada dois dias.Verifique se não há larvas nos frascos de fêmeas. Em seguida, rotule frascos com uma série diferente de números sequenciais para o seguinte tratamento. Após a anestesia, transfira uma fêmea tratada com solvente EE2 em um pequeno frasco contendo meio de tomate de fubá fresco sem EE2 e adicione um macho tratado com solvente EE2 para o controle.Emparelhe um macho tratado com EE2 com fêmea tratada com solvente EE2 ou fêmea tratada com eE2 com macho tratado com solvente EE2 para cada tratamento. Casa 20 cruzes únicas a 25 graus Celsius. Transfira cada par de acasalamento para frascos médios de tomate de fubá fresco sem EDC todos os dias durante os 10 dias seguintes.Inspecione visualmente cada frasco todos os dias em busca dos ovos e informe seu número na planilha de fertilidade. Em cada frasco, verifique de perto as moscas recém-emergidas e registe o número diário de progens adultos durante o período de 10 dias. Após 10 dias do acasalamento inicial, remova os pais da última série de frascos.Nos protocolos de ensaio de eclosão, primeiro, para cada grupo de tratamento, estabeleceu 10 frascos de moscas jovens e saudáveis com menos de dois dias de idade, cada um com seis fêmeas e três machos em 10 mililitros de alimentos de fubá sem EDC. Crie as moscas na comida por 24 horas e deixe-as acasalar. Em seguida, prepare outros 10 frascos paralelos por grupo de tratamento com 10 mililitros cada um de alimentos frescos de fubá suplementados com diferentes concentrações de EDC ou o solvente EE2 sozinho para o controle.Transfira as moscas acasaladas para estes novos frascos. Faça uma planilha de desenvolvimento para gravar as diferentes séries. Deixe as moscas colocarem ovos por 16 horas.Então, remova os pais dos frascos. Incubar os frascos a 25 graus Celsius por três a quatro dias, ou até que as larvas errantes sejam visíveis. Todos os dias, conte o número de pupas novas em cada frasco escrevendo um número em sequência por cada pupa do lado de fora do frasco para evitar contar a mesma pupa duas vezes.Informe o número de pupas recém-emergidas por três a quatro dias, ou até que não haja mais forma de pupae. A partir do nono dia, conte o número de adultos emergentes diariamente, até que não surjam mais adultos. Denuncie-o na planilha de desenvolvimento e realize o resto do ensaio de encerramento de acordo com o manuscrito.No protocolo de vida útil, primeiro montou 20 frascos com oito fêmeas e quatro machos, cada um cheio de 10 mililitros de alimentos de fubá e abriga-os a 25 graus Celsius. Depois de quatro dias, descarte as moscas e coloque os frascos de volta na incubadora. No final da tarde do nono dia, remova todas as moscas recém-emergidas dos frascos e devolva os frascos para a incubadora.Após 16 a 24 horas, divida 250 moscas adultas de um dia de ambos os sexos em quatro grupos sob anestesia de dióxido de carbono leve e transfira-as para garrafas de 250 mililitros contendo alimentos médios adultos, três complementadas com diferentes concentrações de EDC e uma só com o solvente EE2. Mantenha as moscas a 25 graus Celsius por dois a três dias para permitir que acasalem. Então, classifique cada coorte de moscas por sexo em dois grupos.Dentro de cada condição de tratamento, para ambos os sexos, subdividir aleatoriamente cada grupo em cinco frascos paralelos a uma densidade de 20 indivíduos por frasco. Prepare uma planilha de vida em que o número de moscas mortas é subtraído do número de moscas sobreviventes da transferência anterior, de modo que o número de sobreviventes em cada transferência seja obtido automaticamente. Após três dias, transfira as moscas sem anestesia para novos frascos contendo os alimentos correspondentes ao mesmo tempo e verifique se há morte.Regissua a idade das moscas e o número de moscas mortas. Repita a transferência a cada três dias até que todas as moscas morram. Neste experimento, as curvas de vida foram traçadas como a sobrevivência cumulativa versus os dias decorridos para cada concentração de EDC e o controle.Para o controle, após um longo período inicial em que a curva de sobrevivência permaneceu relativamente alta, ela declinou exponencialmente após cerca de 60 dias. Após a exposição ao EDC, a curva de sobrevivência das moscas tratadas foi afetada significativamente e apresentou declínio dramático após 36 dias. É aconselhável que os frascos paralelos em análise devem ser muito semelhantes, caso contrário será difícil entender qual descartar.Por isso, sugerimos tomar muito cuidado, adotando uma boa prática experimental, utilizando um grande tamanho amostral. Seguindo esses protocolos, também é possível avaliar o impacto transgeracional de um disruptor endócrino selecionado, bem como testar os potenciais efeitos aditivos de uma combinação de diferentes disruptores endócrinos.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ensaiando populações de células do sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Biologia do Desenvolvimento

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Elevando a mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sob axênicas e gnotobióticos Condições

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Métodos para examinar a linfa Gland e Hemócitos em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Descongelamento, cultivo e Cryopreserving linhas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Imagem de explantes cerebrais vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autor em destaque: Investigando a dinâmica assimétrica da divisão celular: um protocolo para imagens ao vivo de explantes cerebrais de larvas de Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...