Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Авторы благодарят Орсолину Петильо за техническую поддержку. Авторы благодарят доктора Марианасорию Алетту (CNR) за библиографическую поддержку. Авторы благодарят д-ра Густаво Дамиано Миту за то, что он познакомил их с миром EDC. Авторы благодарят Leica Microsystems и Pasquale Romano за помощь. Это исследование было поддержано проектом PON03PE-00110-1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Комманент: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Проект PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NanoTECNOLOGIE".

1. Приготовление пищи
<ol><li>
Для поддержания запасов и для роста личинок, используйте среду кукурузной муки, содержащую 3 % порошкообразных дрожжей, 10 % сахарозы, 9 % предварительно приготовленную кукурузную муку, 0,4 % агара, после чего называется Cornmeal medium (CM).
	<ol>
<li>Положите 30 г дрожж...

Плодовая муха D. melanogaster широко используется в качестве модели системы in vivo для изучения потенциальных последствий экологических EDC, таких как DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33, и EE234. Нескол...

Деятельность человека высвобождает в окружающую среду огромное количество химических веществ, которые представляют собой серьезную проблему для организмов и для природных экосистем1. Из этих загрязнителей, по оценкам, около 1000 различных химических веществ могут изменить нормальный баланс эндокринной системы; в соответствии с этим свойством, они классифицируются как эндокринные разрушающие химические вещества (EDCs). В частности, на основе недавнего определения Эндокринного общества, EDCs являются "экзогенным химическим веществом, или смесь химических веществ, которые могут вмешиваться в любой аспект гормонального действия"2. За последние три десятилетия, наблюдается рост научных доказательств того, что EDCs может повлиять на воспроизводство и развитие животных и растений3,4,5,6,7, 8. Кроме того, воздействие EDC было связано с ростом распространенности некоторых заболеваний человека, включая рак, ожирение, диабет, заболевания щитовидной железы, и поведенческие расстройства9,10,11.
Общие механизмы EDC
Из-за своих молекулярных свойств, EDCs ведут себякак гормоны или прекурсоры гормонов 3,4,5,6,8,9, 10,11,12. В этом смысле они могут связываться с рецептором гормона и нарушать эндокринную систему либо, имитируя активность гормонов, либо блокируя эндогенные гормоны, связывающие. В первом случае, после связывания с рецептором, они могут активировать его, как его естественный гормон будет делать. В другом случае, связывание EDC с рецептором предотвращает связывание его естественного гормона, поэтому рецептор блокируется и больше не может быть активирован, даже при наличии его естественного гормона3. Как следствие, EDCs может повлиять на несколько процессов, таких как синтез, секреция, транспорт, метаболизм, или периферийное действие эндогенных гормонов, которые отвечают за поддержание гомеостаза, размножения, развития и / или поведение организма. Связывание рецепторов не является единственным способом действия, описанным до сих пор для EDCs. Теперь ясно, что они также могут действовать путем набора коактиваторов или основных сепрессоров в ферментативных путей или путем изменения эпигенетических маркеров дерегулирования экспрессии генов10,11,12,13 ,14, с последствиями не только для нынешнего поколения, но и для здоровья грядущих поколений8.
Гормоны дрозофилы
Потенциальные последствия отдельных ЭДЦ были широко изучены, как в видах дикой природы, так и в нескольких модельных системах, в которых достаточно хорошо известны эндокринные механизмы. Для беспозвоночных эндокринные системы, влияющие на рост, развитие и размножение, широко охарактеризованы насекомыми по нескольким причинам, включая их широкое использование в области биологических исследований, их экономическое значение и наконец, развитие инсектицидов в состоянии вмешиваться конкретно в гормональную систему насекомых-вредителей.
В частности, среди насекомых плодовая муха D. melanogaster оказалась очень мощной модельной системой для оценки потенциальных эндокринных эффектов ЭДЦ. В D. melanogaster, как и у позвоночных, гормоны играют важную роль на протяжении всего жизненного цикла. В этом организме, Есть три основные гормональные системы, которые включают стероидных гормонов 20-гидроксиексидизон (20E)15,16, сесквитерпеноид ювенильный гормон (JH)17, и нейропептидов и пептида / белка гормоны18. Эта третья группа состоит из нескольких пептидов, обнаруженных совсем недавно, но явно участвующих в огромном разнообразии физиологических и поведенческих процессов, таких как долголетие, гомеостаз, обмен веществ, воспроизводство, память, и локомотив ный контроль. 20E является гомологичным для холестерина полученных стероидных гормонов, таких как эстрадиол, в то время как JH разделяет некоторые сходства с ретинойной кислоты; оба они являются наиболее известными гормонами в Drosophila19,20. Их баланс имеет жизненно важное значение в координации линьки и метаморфозы, а также в управлении несколькими постразвития процессов, таких как воспроизводство, продолжительность жизни, и поведение21, таким образом, предлагая различные возможности для тестирования эндокринной нарушения в Дрозофиле. Кроме того, экристероидные гормоны и JH являются основными целями так называемых инсектицидов третьего поколения, разработанных для вмешательства в процессы развития и репродуктивного эндокринных опосредованных у насекомых. Агонист или антагонист режим действия этих химических веществ хорошо известен, и, таким образом, они могут служить в качестве эталонных стандартов для оценки влияния потенциальных EDCs на рост, размножение и развитие насекомых22. Например, метопрена, которая широко используется в борьбе с комарами и другими водными насекомыми23,24, работает как агонист JH и подавляет 20E-индуцированной транскрипции генов и метаморфоз.
В дополнение к гормонам, суперсемейка ядерных рецепторов (NR) в Дрозофиле также хорошо известна; она состоит из 18 эволюционно сохраненных транскрипционных факторов, участвующих в контроле гормонозависимых путей развития, а также воспроизводства и физиологии25. Эти гормоны НР принадлежат ко всем шести NR суперсемейных подтипов, в том числе тех, кто участвует в нейротрансмиссии26, два для ретинойной кислоты НР, и те, для стероидных НР, которые, у позвоночных, представляют собой одну из основных целей EDCs27.
Дрозофила как модельная система для изучения EDCs
В настоящее время, исходя из молекулярных свойств, несколько природоохранных учреждений во всем мире объясняют возможность вмешательства в эндокринные системы различными антропогенными химическими веществами. С учетом того, что ЭЦП представляют собой глобальную и повсеместную проблему для окружающей среды и организмов, общая цель исследований в этой области заключается в сокращении бремени их болезней, а также в защите живых организмов от их неблагоприятных последствий. Для того, чтобы углубить понимание о потенциальном эндокринных эффектов химического вещества, необходимо проверить его in vivo. С этой целью D. melanogaster представляет собой действительную модельную систему. До настоящего времени плодовая муха широко использовалась в качестве модели in vivo для оценки воздействия нескольких экологических ЭДЦ; было сообщено, что воздействие нескольких EDCs, таких как дибутил фталат (DBP)28, бисфенол A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-терт-октильфенол (4-терт-OP)29, метилпарабен (MP)30, этилпарабен (EP)31, 32, бис-(2-этилгексил) фталат (DEHP)33,и 17-з-этинилэстрадиол (EE2)34, влияет на обмен веществ и эндокринные функции, как в позвоночных моделей. Несколько причин привели к его использованию в качестве модели в этой области исследований. Помимо превосходного знания его эндокринной системы, дальнейшие преимущества включают в себя его короткий жизненный цикл, низкая стоимость, легко манипулируемый геном, долгая история исследований, и несколько технических возможностей (см. сайт FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster также обеспечивает мощную модель для легкого изучения эффектов трансгенерации и реакции населения на факторы окружающей среды8 и позволяет избежать этических вопросов, имеющих отношение к исследованиям in vivo у высших животных. Кроме того, плодовая муха разделяет высокую степень сохранения генов с людьми, которые могли бы сделать возможным для Drosophila EDC анализы, чтобы помочь в прогнозировании или предлагая потенциальные последствия этих химических веществ для здоровья человека. Помимо расширения понимания последствий для здоровья человека, Дрозофила может помочь оценить риски воздействия ЭДК на окружающую среду, такие как утрата биоразнообразия и ухудшение состояния окружающей среды. Наконец, плодовая муха предлагает дополнительное преимущество использования в лабораториях, где факторы, потенциально влияющие на ее развитие, размножение и продолжительность жизни, могут быть под контролем, с тем чтобы отнести любые изменения к веществу, которое должно быть проверено.
Имея это в виду, мы оптимизировали простые и надежные фитнес-анализы для определения эффектов EDC на некоторые причинно-то гормональные черты, такие как плодовитость/фертильность, время развития и продолжительность взрослой жизни. Эти анализы были широко использованы для некоторых EDCs23,24,25,26,27. В частности, мы использовали следующие протоколы для оценки воздействия синтетического эстрогена EE234 и BPA и бисфенола AF (BPA F) (неопубликованные данные). Эти протоколы могут быть легко изменены для изучения последствий данной EDC в то время, а также комбинированные эффекты нескольких EDCs в D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

В последние годы растет доказательств того, что все организмы и окружающая среда подвергаются воздействию гормоноподобных химических веществ, известных как эндокринные химические вещества-разрушители (ЭДК). Эти химические вещества могут изменить нормальный баланс эндокринной системы и привести к неблагоприятным последствиям, а также увеличение числа гормональных нарушений в популяции человека или нарушенного роста и сокращения воспроизводства в дикой природе видов. Для некоторых ЭДЦ существуют документально подтвержденные последствия для здоровья и ограничения на их использование. Однако для большинства из них до сих пор нет научных доказательств в этом смысле. Для того, чтобы проверить потенциальное эндокринное воздействие химического вещества в полном организме, мы должны проверить его в соответствующих модельных системах, а также в плодовой мухи, Drosophila melanogaster. Здесь мы сообщаем подробные протоколы in vivo для изучения эндокринных нарушений в Drosophila, обращаясь edC эффекты на плодовитость / фертильность, сроки развития, и продолжительность жизни мухи. В последние несколько лет, мы использовали эти черты жизни дрозофилы для расследования последствий воздействия 17-й-этинилэстрадиол (EE2), бисфенол А (BPA), и бисфенол AF (BPA F). В общей сложности, эти анализы охватывает все этапы жизни Drosophila и позволило оценить эндокринные нарушения во всех гормоно-опосредованных процессов. Анализы сроков плодородия/фертильности и развития были полезны для измерения воздействия EDC на репродуктивную производительность мух и на этапы развития, соответственно. Наконец, продолжительность жизни с участием хронических воздействия EDC взрослых и измеряется их выживаемости. Тем не менее, эти жизненные черты также могут зависеть от нескольких экспериментальных факторов, которые должны были быть тщательно контролируется. Итак, в этой работе мы предлагаем ряд процедур, которые мы оптимизировали для правильного результата этих анализов. Эти методы позволяют ученым установить эндокринные нарушения для любого EDC или для смеси различных EDCs в Drosophila, хотя для определения эндокринного механизма, ответственного за эффект, дальнейшие эссе могут быть необходимы.

В этом разделе основные шаги вышеуказанных протоколов сообщаются в виде упрощенных схем. Учитывая, что мухи, как правило, чтобы избежать неприятных соединений, первое, что нужно сделать, это, чтобы рассказать вкус выбранного EDC. Это можно сделать путем смешивания пищевой краситель (напр?...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Химические вещества эндокринного разрушителя (ЭДЦ) представляют собой серьезную проблему для организмов и природной среды. Drosophila melanogaster представляет собой идеальную модель для изучения эффектов EDC in vivo. Здесь мы представляем методы для исследования эндокринных нарушений в Drosophila, обращаясь EDC эффекты на плодовитость, плодовитость, время развития, и продолжительность жизни мухи.

Методы тестирования эндокринных нарушений в Drosophila меланогастер

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster является мощной моделью для оценки in vivo потенциального токсического и эндокринного воздействия химических веществ, таких как эндокринные разрушители, которые представляют собой серьезную проблему для здоровья человека и природной среды. Решение влияние ЭДК на гормональные черты жизни мухи, такие как плодовитость, плодовитость, время развития, и продолжительность жизни. Это простой, дешевый и быстрый способ исследовать эндокринные нарушения in vivo.На фертильность, развитие и продолжительность жизни в Дрозофиле может повлиять несколько факторов, которые должны быть тщательно проутрены, чтобы обеспечить успешный результат этого протокола. Поэтому требуется максимальное внимание при воспитании и обработке мух. Чтобы почувствовать вкус выбранного ЭДК, после обезболивания перенесите 15 молодых мух с лету на четыре параллельных флакона, содержащих кукурузную муки, смешанную с пищевой окраской.Контрольный флакон содержит только растворитель, а три других флакона дополняются различными дозами отобранных ЭДК. Держите флаконы во влажном инкубаторе в течение одного дня с естественным 12-часовым светом. После обезболивания мух снова, передать обездвиженной мух на белую бумагу, и поместить его под стерео микроскоп для наблюдения.Сравните окраску брюшной полости каждой группы лечения по отношению к контрольной группе. Чтобы продать репродуктивную работоспособность мух, подготовь три флакона мух для каждого EDC в качестве родительских флаконов, с восемью самками и четырьмя самцами в 10 миллилитров кукурузной муки среды, дополненной EE2. Для контроля, подготовить шесть флаконов мух, каждая из которых восемь самок и четыре мужчины в 10 миллилитров кукурузной муки средней пищи, дополненной EE2 растворителя.Задние мухи в инкубаторе при 25 градусах по Цельсию. Во время их развития избегайте перенаселенности личинок. Через четыре дня, инвертировать каждый флакон над эфиризатором, чтобы удалить родителей и вернуть флаконы в инкубатор еще на пять дней.Во второй половине дня девять, инвертировать каждый флакон над эфиризатором, чтобы удалить все вновь возникшие мухи из флаконов и положить флаконы в другой инкубатор при 18 градусов по Цельсию в одночасье. Утром 10-го дня на рабочей станции по работе с углекислым газом Drosophila тщательно инвертировать культурный флакон, чтобы предотвратить падение анестезировалых мух на средний и вставить резиновую трубку с иглой во флакон между хлопчатобумажной пробкой и стенкой флакона. Откройте клапан для доставки углекислого газа.В течение нескольких секунд, передача мух на кровать мухи под микроскопом. Соберите девственных самок и молодых самцов отдельно на две группы на лету кровать. Случайно подраздеть каждую группу мух в небольших подгруппах, с 10 самок или 20 мужчин на флакон заполнены свежей соответствующей среды кукурузной муки.Продолжить инкубацию и собирать 30 девственных женщин и 30 мужчин для каждого EDC, и 90 девственных женщин и 90 мужчин для контроля. Дом этих групп мух при 25 градусов по Цельсию, пока они не в возрасте четырех дней после выкупа. Затем перенесите их в новые флаконы, содержащие свежие соответствующие среды каждые два дня.Проверьте Есть нет личинок во флаконах самок. Затем этикетка флаконы с другой серии последовательных номеров для следующего лечения. После анестезии перенесите одну самку, обработанную растворителем EE2, в небольшой флакон, содержащий свежую томатную среду из кукурузной муки без EE2, и добавьте одного мужчину, обработанного растворителем EE2, для контроля поперек.Соедините мужчину, обработанного EE2, с женщиной, обработанной растворителем EE2, или женщиной, обработанной EE2, с мужчиной, обработанным растворителем EE2 для каждого лечения. Дом 20 одиночных крестов при 25 градусах по Цельсию. Передача каждой пары спаривания на свежие кукурузные муки томатных средних флаконов без EDC каждый день в течение последующих 10 дней.Визуально осмотрите каждый флакон каждый день для яичек и сообщите их номер на таблице плодородности. В каждом флаконе внимательно проверяйте наличие новых мух и записывайте ежедневное количество взрослых progenies в течение 10-дневного периода. Через 10 дней после первоначального спаривания удалите родителей из последней серии флаконов.В протоколах анализа, во-первых, для каждой группы лечения, создано 10 флаконов молодых, здоровых мух менее двух дней, каждый с шестью женщинами и тремя мужчинами в 10 миллилитров кукурузной муки пищи без EDC. Задняя мух на питание в течение 24 часов и дать им спариваться. Затем приготовьте еще 10 параллельных флаконов в группе обработки с 10 миллилитров каждый из свежих кукурузной муки пищи, дополненной различными концентрациями EDC или EE2 растворитель только для контроля.Перенесите спариваемые мухи на эти новые флаконы. Сделайте таблицу разработки для записи различных серий. Разрешить мухам откладывать яйца в течение 16 часов.Затем удалите родителей из флаконов. Инкубировать флаконы при 25 градусах по Цельсию в течение трех-четырех дней, или до блуждающих личинок видны. Каждый день, подсчитайте количество новых куколок в каждом флаконе, написав число в последовательности каждой куколки на внешней стороне флакона, чтобы избежать подсчета же куколки в два раза.Сообщите о количестве вновь возникших куколок в течение трех-четырех дней, или до тех пор, пока не будет больше куколки форме. Начиная с девятый день, подсчитайте число новых взрослых ежедневно, пока не появится больше взрослых. Сообщите об этом в таблице разработки и выполните остальную часть анализа по исключению в соответствии с рукописью.В протоколе продолжительности жизни, сначала создано 20 флаконов с восемью самками и четырьмя самцами, каждый из которых заполнен 10 миллилитров кукурузной муки пищи и дома их при 25 градусов по Цельсию. Через четыре дня отбросьте мух и поместите флаконы обратно в инкубатор. Во второй половине дня девять, удалить все вновь возникшие мухи из флаконов и вернуть флаконы в инкубатор.Через 16-24 часа разделите 250 однодневных взрослых мух обоих полов на четыре группы под легким наркозом двуокиси углерода и перенесите их в 250-миллилитровые бутылки, содержащие взрослую средняю пищу, три из которых будут дополнены различными концентрациями EDC и одну только растворителем EE2. Поддерживайте мух при 25 градусах по Цельсию в течение двух-трех дней, чтобы позволить им спариваться. Затем сортируют каждую когорту мух по полу на две группы.В каждом лечении условие, для обоих полов, случайным образом подраздеть каждую группу на пять параллельных флаконов при плотности 20 человек на флакон. Подготовь таблицу продолжительности жизни, в которой количество мертвых мух вычитается из числа выживших мух из предыдущей передачи, так что количество выживших при каждой передаче автоматически получается. Через три дня перенесите мух без анестезии на новые флаконы, содержащие соответствующую пищу, и проверьте на смерть.Запись возраста мух и количество мертвых мух. Повторяйте передачу каждые три дня, пока все мухи не умрут. В этом эксперименте кривые продолжительности жизни были построены как совокупный выживший по сравнению с истекшей дней для каждой концентрации EDC и контроля.Для контроля, после длительного начального периода, в котором кривая выжившего оставалась относительно высокой, она снизилась в геометрической прогрессии примерно через 60 дней. После воздействия EDC, кривая выжившего обработанных мух была затронута значительно и показал резкое снижение после 36 дней. Сообщается, что параллельные флаконы, на которые идет анализ, должны быть очень похожи, иначе будет трудно понять, от чего отказаться.Поэтому мы предлагаем с большой осторожностью, приняв хорошую экспериментальную практику, используя большой размер выборки. Следуя этим протоколам, можно также оценить трансгенеративное воздействие выбранного эндокринного разрушителя, а также проверить потенциальное аддитивное воздействие сочетания различных эндокринных разрушителей.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Опробование клеток крови народам<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Личинка

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Выращивание дрозофилы<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Под аксенический и гнотобионтных Условия

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Методы Изучить лимфа железой и гемоцитах в<em&gt; Drosophila</em&gt; личинки

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Протоколы Визуальное стероидогенных органов и их интерактивные Органов с иммунным окрашиванием плодовой мушки<em&gt; Дрозофилы</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Анализ на кроветчебно-мозговой барьер целостности в Drosophila меланогастер

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Визуализация дрозофилы меланогастера с использованием микрокомпьютерной томографии

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Визуализация живых эксплантов мозга личинок третьего возраста Drosophila melanogaster

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

В центре внимания автора: Исследование асимметричной динамики деления клеток: протокол для визуализации в реальном времени эксплантов мозга личинок дрозофилы 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Визуализация живых клеток личинки Drosophila melanogaster третьего возраста

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...