Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
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Los autores agradecen a Orsolina Petillo por su apoyo técnico. Los autores agradecen a la Dra. Mariarosaria Aletta (CNR) su apoyo bibliográfico. Los autores agradecen al Dr. Gustavo Damiano Mita por presentarlos al mundo de la EDC. Los autores agradecen a Leica Microsystems y Pasquale Romano por su ayuda. Esta investigación fue apoyada por el Proyecto PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Compromiso: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Proyecto PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

1. Preparación de alimentos
<ol><li>
Para el mantenimiento de las poblaciones y para el crecimiento larvario, utilice un medio de harina de maíz que contenga un 3 % de levadura en polvo, un 10 % de sacarosa, un 9 % de harina de maíz precocida, un 0,4 % de agar, denominado a partir de entonces medio de harina de maíz (CM).
	<ol>
<li>Poner 30 g de levadura en 100 ml de agua del grifo, llevarla a ebullición y dejar hervir durante 15 minutos.</li>
		<li>Por separado, mezcle bien 90 g de harina de maí...

La mosca de la fruta D. melanogaster ha sido ampliamente empleada como un sistema modelo in vivo para investigar los efectos potenciales de los EDC ambientales como DBP28,BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33y EE234. Varias razones han llevado a su uso como modelo en este campo de investigación. Aparte de sus ventajas indiscu...

Las actividades humanas han estado liberando al medio ambiente una enorme cantidad de productos químicos, que representan un grave problema para los organismos y para los ecosistemas naturales1. De estos contaminantes, se estima que unos 1.000 productos químicos diferentes pueden alterar el equilibrio normal de los sistemas endocrinos; según esta propiedad, se clasifican como sustancias químicas disruptoras endocrinas (EDC). Específicamente, sobre la base de una definición reciente de la Sociedad Endocrina, las EDC son "un químico exógeno, o mezcla de productos químicos, que puede interferir con cualquier aspecto de la acción hormonal"2. En las últimas tres décadas, ha habido cada vez más evidencia científica de que las EDC pueden afectar a la reproducción y desarrollo de animales y plantas3,4,5,6,7, 8. Además, la exposición a la EDC se ha relacionado con la creciente prevalencia de algunas enfermedades humanas, incluyendo cáncer, obesidad, diabetes, enfermedades tiroideas, y trastornos del comportamiento9,10,11.
Mecanismos generales de la EDC
Debido a sus propiedades moleculares, los EDC se comportan como hormonas o precursores hormonales3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. En este sentido, pueden unirse al receptor de una hormona y interrumpir los sistemas endocrinos ya sea imitando la actividad hormonal o bloqueando la unión de hormonas endógenas. En el primer caso, después de la unión al receptor, pueden activarlo como su hormona natural haría. En el otro caso, la unión de la EDC al receptor impide la unión de su hormona natural, por lo que el receptor está bloqueado y ya no se puede activar, incluso en presencia de su hormona natural3. Como consecuencia, los EDC pueden afectar a varios procesos, como la síntesis, secreción, transporte, metabolismo o acción periférica de hormonas endógenas que son responsables del mantenimiento de la homeostasis, reproducción, desarrollo y/o comportamiento de el organismo. La unión del receptor no es la única forma de acción descrita hasta ahora para las EDC. Ahora está claro que también pueden actuar reclutando coactivadores o corepresores en vías enzimáticas o modificando marcadores epigenéticos que desreguladoran la expresión génica10,11,12,13 ,14, con consecuencias no sólo para la generación actual, sino también para la salud de las generaciones venideros8.
Hormonas drosofílicas
Los efectos potenciales de las EDC seleccionadas se han estudiado ampliamente, tanto en especies de vida silvestre como en varios sistemas de modelos en los que los mecanismos endocrinos son razonablemente bien conocidos. En el caso de los invertebrados, los sistemas endocrinos que influyen en el crecimiento, el desarrollo y la reproducción se han caracterizado ampliamente en insectos por varias razones, lo que implica su uso extensivo en el campo de la investigación biológica, su importancia económica y finalmente el desarrollo de insecticidas capaces de interferir específicamente con el sistema hormonal de los insectos de plagas.
En particular, entre los insectos, la mosca de la fruta D. melanogaster ha demostrado ser un sistema modelo muy potente para evaluar los posibles efectos endocrinos de las EDC. En D. melanogaster, así como en los vertebrados, las hormonas juegan un papel importante a lo largo de todo el ciclo de vida. En este organismo, hay tres sistemas hormonales principales, que involucran la hormona esteroide 20-hidroxiediseano (20E)15,16, la hormona juvenil sesquiterpenoides (JH)17, y los neuropéptidos y péptidos /proteínas hormonas18. Este tercer grupo consta de varios péptidos descubiertos más recientemente pero claramente involucrados en una gran variedad de procesos fisiológicos y conductuales, tales como longevidad, homeostasis, metabolismo, reproducción, memoria, y control locomotor. 20E es homólogo a las hormonas esteroides derivadas del colesterol como el estradiol, mientras que la JH comparte algunas similitudes con el ácido retinoico; ambos son las hormonas más conocidas en Drosophila19,20. Su equilibrio es vital en la coordinación de la muda y la metamorfosis, así como en el control de varios procesos de postdesarrollo, como la reproducción, la vida útil y el comportamiento21,ofreciendo así diferentes posibilidades para probar endocrinos disrupción en Drosophila. Además, las hormonas ecdysteroid y los JH son los principales objetivos de los llamados insecticidas de tercera generación, desarrollados para interferir con los procesos mediados endocrinos en el desarrollo y la reproducción en los insectos. El modo agonista o antagonista de acción de estos productos químicos es bien conocido, y por lo tanto pueden servir como normas de referencia para evaluar los efectos de los posibles EDC en el crecimiento, reproducción y desarrollo de insectos22. Por ejemplo, el metopreno, que ha sido ampliamente utilizado en el control de mosquitos y otros insectos acuáticos23,24, funciona como un agonista JH y reprime la transcripción genética inducida por 20E y la metamorfosis.
Además de las hormonas, la superfamilia del receptor nuclear (NR) en Drosophila también es bien conocida; consiste en 18 factores de transcripción evolutivamente conservados involucrados en el control de las vías de desarrollo dependientes de las hormonas, así como la reproducción y fisiología25. Estas hormonas NR pertenecen a los seis subtipos de superfamilia NR, incluidos los involucrados en la neurotransmisión26,dos para los NR de ácido retinoico, y los de los NR esteroides que, en los vertebrados, representan uno de los objetivos principales de los EDC27.
Drosophila como sistema modelo para el estudio de las EDC
Actualmente, sobre la base de propiedades moleculares, varias agencias ambientales de todo el mundo están atribuyendo el potencial de interferir con los sistemas endocrinos a diferentes productos químicos artificiales. Dado que las EDC son un problema global y omnipresente para el medio ambiente y para los organismos, el objetivo general de la investigación en este campo es reducir su carga de morbilidad, así como proteger a los organismos vivos de sus efectos adversos. Con el fin de profundizar la comprensión sobre los posibles efectos endocrinos de un producto químico, es necesario probarlo in vivo. Con este fin, D. melanogaster representa un sistema de modelos válido. Hasta la fecha, la mosca de la fruta se ha utilizado ampliamente como modelo in vivo para evaluar los efectos de varias EDC ambientales; se ha informado de que la exposición a varios EDC, como el dibutilo ftalato (DBP)28,el bisfenol A (BPA), el 4-nonilfenol (4-NP), el 4-tert-octilfenol (4-tert-OP)29, el metilparabeno (MP)30, el etilparabeno (EP)31, 32, bis-(2-etilhexilo) ftalato (DEHP)33y 17-o-etinilestradiol (EE2)34, influye en el metabolismo y las funciones endocrinas como en los modelos de vertebrados. Varias razones han llevado a su uso como modelo en este campo de investigación. Más allá de un excelente conocimiento de sus sistemas endocrinos, otras ventajas incluyen su corto ciclo de vida, bajo costo, genoma fácilmente manipulable, una larga historia de investigación, y varias posibilidades técnicas (ver el sitio web de FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster también proporciona un modelo potente para estudiar fácilmente los efectos transgeneracionales y las respuestas de la población a los factores ambientales8 y evita cuestiones éticas relevantes para los estudios in vivo en animales superiores. Además, la mosca de la fruta comparte un alto grado de conservación de genes con los seres humanos que podría hacer posible que los ensayos de Drosophila EDC ayuden a predecir o sugerir los efectos potenciales de estos productos químicos para la salud humana. Además de ampliar la comprensión sobre los efectos en la salud humana, Drosophila puede ayudar a evaluar los riesgos de exposición de la EDC al medio ambiente, como la pérdida de biodiversidad y la degradación del medio ambiente. Por último, la mosca de la fruta ofrece la ventaja adicional de ser utilizada en laboratorios, donde los factores que pueden afectar a su desarrollo, reproducción y vida útil pueden mantenerse bajo control con el fin de atribuir cualquier variación a la sustancia a probar.
Con esto en mente, hemos optimizado ensayos de fitness simples y robustos para determinar los efectos de la EDC en algunos rasgos hormonales de Drosophila, como la fecundidad/fertilidad, el tiempo de desarrollo y la vida útil de los adultos. Estos ensayos han sido ampliamente utilizados para algunos EDCs23,24,25,26,27. En particular, hemos utilizado los siguientes protocolos para evaluar los efectos de la exposición al estrógeno sintético EE234 y al BPA y al bisfenol AF (BPA F) (datos no publicados). Estos protocolos pueden modificarse fácilmente para investigar los efectos de una EDC dada a la vez, así como los efectos combinados de múltiples EDC en D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

En los últimos años ha habido creciente evidencia de que todos los organismos y el medio ambiente están expuestos a productos químicos similares a las hormonas, conocidos como productos químicos disruptores endocrinos (EDC). Estos productos químicos pueden alterar el equilibrio normal de los sistemas endocrinos y conducir a efectos adversos, así como un número creciente de trastornos hormonales en la población humana o crecimiento perturbado y reproducción reducida en las especies de vida silvestre. Para algunas EDCs, hay efectos documentados para la salud y restricciones en su uso. Sin embargo, para la mayoría de ellos, todavía no hay evidencia científica en este sentido. Con el fin de verificar los posibles efectos endocrinos de un producto químico en todo el organismo, necesitamos probarlo en sistemas modelo adecuados, así como en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Aquí informamos protocolos in vivo detallados para estudiar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC en la fecundidad/fertilidad, tiempo de desarrollo y vida útil de la mosca. En los últimos años, utilizamos estos rasgos de vida Drosophila para investigar los efectos de la exposición a 17-o-etinilestradiol (EE2), bisfenol A (BPA), y bisfenol AF (BPA F). En conjunto, estos ensayos cubrieron todas las etapas de la vida de Drosophila y hicieron posible evaluar la interrupción endocrina en todos los procesos mediados por hormonas. Los ensayos de fecundidad/fertilidad y tiempo de desarrollo fueron útiles para medir el impacto de la EDC en el rendimiento reproductivo de la mosca y en las etapas del desarrollo, respectivamente. Por último, el ensayo de vida útil implicó exposiciones crónicas de la EDC a adultos y midió su supervivencia. Sin embargo, estos rasgos de vida también pueden ser influenciados por varios factores experimentales que tuvieron que ser cuidadosamente controlados. Por lo tanto, en este trabajo, sugerimos una serie de procedimientos que hemos optimizado para el resultado correcto de estos ensayos. Estos métodos permiten a los científicos establecer la interrupción endocrina para cualquier EDC o para una mezcla de diferentes EDC en Drosophila, aunque para identificar el mecanismo endocrino responsable del efecto, podrían ser necesarios ensayos adicionales.

En esta sección, los pasos clave de los protocolos anteriores se notifican en forma de esquemas simplificados. Dado que las moscas tienden a evitar compuestos desagradables, lo primero que hay que hacer es probar el sabor de la EDC seleccionada. Esto se puede hacer mezclando un colorante alimentario (por ejemplo, tinte de alimentos rojos no 40)35 con el alimento complementado con la EDC seleccionada en varias dosis o solo con el disolvente. Las moscas alimentadas en estos medios se examinan bajo ...

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Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Los productos químicos disruptores endocrinos (EDC) representan un problema grave para los organismos y para los entornos naturales. Drosophila melanogaster representa un modelo ideal para estudiar los efectos de la EDC in vivo. Aquí, presentamos métodos para investigar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC sobre la fecundidad, fertilidad, tiempo de desarrollo, y la vida útil de la mosca.

Métodos para probar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster es un potente modelo para evaluar in vivo los posibles efectos tóxicos y endocrinos de los productos químicos, como los disruptores endocrinos, que representan un grave problema para la salud humana y los entornos naturales. Abordar el efecto de los EDC en los rasgos hormonales de la vida de la mosca, como la fecundidad, la fertilidad, el tiempo de desarrollo y la vida útil. Es una manera fácil, barata y rápida de investigar la interrupción endocrina in vivo.La fertilidad, el desarrollo y la vida útil de Drosophila pueden verse afectados por varios factores que deben controlarse cuidadosamente para garantizar el resultado exitoso de este protocolo. Por lo tanto, se requiere la máxima atención en la cría y manipulación de moscas. Para ensayar el sabor de la EDC seleccionada, después de la anestesia, transfiera 15 moscas jóvenes del lecho de mosca a cuatro viales paralelos que contengan un medio de harina de maíz mezclado con un colorante alimentario.El vial de control contiene el disolvente solo, y los otros tres viales se complementan con diferentes dosis de los EDC seleccionados. Conservar los viales en una incubadora humidificada durante un día con una luz natural de 12 horas. Después de anestesiar las moscas de nuevo, transfiera las moscas inmovilizadas a un papel blanco, y colóquelo bajo un microscopio estéreo para observar.Compare la coloración abdominal de cada grupo de tratamiento con respecto al grupo de control. Para ensayar el rendimiento reproductivo de las moscas, prepare tres viales de moscas para cada EDC como viales parentales, con ocho hembras y cuatro machos en 10 mililitros de medio de harina de maíz complementados con EE2. Para el control, preparar seis viales de moscas, cada uno con ocho hembras y cuatro machos en 10 mililitros de alimentos medianos de harina de maíz complementados con disolvente EE2.Vuela en una incubadora a 25 grados centígrados. Durante su desarrollo, evite el hacinamiento de las larvas. Después de cuatro días, invierta cada vial sobre un etherizer para retirar a los padres y devolver los viales a la incubadora durante cinco días más.A última hora de la tarde del día nueve, invierta cada vial sobre un etherizer para eliminar todas las moscas recién emergidas de los viales y coloque los viales en otra incubadora a 18 grados centígrados durante la noche. En la mañana del día 10, en una estación de trabajo de dióxido de carbono Drosophila, invierta cuidadosamente el vial de cultivo para evitar que las moscas anestesiadas caigan en el medio e inserte un tubo de goma con una aguja en el vial entre el tapón de algodón y la pared del vial. Abra la válvula para suministrar dióxido de carbono.En cuestión de segundos, transfiera las moscas a un lecho de mosca bajo un microscopio. Recoger hembras vírgenes y machos jóvenes por separado en dos grupos en la cama de la mosca. Subdividir aleatoriamente cada grupo de moscas en pequeños subgrupos, con 10 hembras o 20 machos por vial llenos de medio de harina de maíz fresco correspondiente.Continuar la incubación y recoger 30 hembras vírgenes y 30 machos por cada EDC, y 90 hembras vírgenes y 90 machos para el control. Alberga a estos grupos de moscas a 25 grados centígrados hasta que tengan cuatro días de edad después de la eclosión. A continuación, transfiéralos a viales nuevos que contengan el medio fresco correspondiente cada dos días.Compruebe que no hay larvas en los viales de las hembras. A continuación, etiquete los viales con una serie diferente de números secuenciales para el siguiente tratamiento. Después de la anestesia, transfiera una hembra tratada con disolvente EE2 a un pequeño vial que contenga un medio de tomate de harina de maíz fresco sin EE2 y agregue un macho tratado con disolvente EE2 para el control.Emparejar a un macho tratado con EE2 con una hembra tratada con disolvente EE2 o una hembra tratada con EE2 con un macho tratado con disolvente EE2 para cada tratamiento. Casa 20 cruces individuales a 25 grados centígrados. Transfiera cada par de apareamiento a viales medianos de tomate de harina de maíz fresco sin EDC todos los días durante los siguientes 10 días.Inspeccione visualmente cada vial todos los días en busca de los óvulos e informe su número en la hoja de cálculo de fertilidad. En cada vial, compruebe atentamente si hay moscas recién emergidas y registre el número diario de progenies adultas durante el período de 10 días. Después de 10 días desde el apareamiento inicial, retire a los padres de la última serie de viales.En los protocolos de ensayo de eclosión, en primer lugar, para cada grupo de tratamiento, se establecen 10 viales de moscas jóvenes y sanas de menos de dos días de edad, cada una con seis hembras y tres machos en 10 mililitros de alimentos de harina de maíz sin EDC. Trasera las moscas en la comida durante 24 horas y deja que se aparees. A continuación, prepare otros 10 viales paralelos por grupo de tratamiento con 10 mililitros cada uno de alimentos frescos de harina de maíz complementados con diferentes concentraciones de EDC o el disolvente EE2 solo para el control.Transfiera las moscas apareadas a estos nuevos viales. Haga una hoja de cálculo de desarrollo para grabar las diferentes series. Deje que las moscas pongan huevos durante 16 horas.Luego, retire a los padres de los viales. Incubar los viales a 25 grados centígrados durante tres a cuatro días, o hasta que las larvas errantes sean visibles. Cada día, cuente el número de pupas nuevas en cada vial escribiendo un número en secuencia por cada pupa en el exterior del vial para evitar contar la misma pupa dos veces.Informar del número de pupas recién surgidas durante tres a cuatro días, o hasta que no se forme más pupas. A partir del día nueve, cuente el número de adultos emergentes diariamente, hasta que no surjan más adultos. Informar sobre la hoja de cálculo del desarrollo y realizar el resto del ensayo de eclosión de acuerdo con el manuscrito.En el protocolo de vida útil, primero se instalaron 20 viales con ocho hembras y cuatro machos, cada uno lleno de 10 mililitros de alimentos de harina de maíz y los albergan a 25 grados centígrados. Después de cuatro días, deseche las moscas y vuelva a colocar los viales en la incubadora. A última hora de la tarde del día nueve, retire todas las moscas recién emergidas de los viales y devuelva los viales a la incubadora.Después de 16 a 24 horas, divida 250 moscas adultas de un día de edad de ambos sexos en cuatro grupos bajo anestesia de dióxido de carbono ligero y transfieralas a botellas de 250 mililitros que contengan alimentos medianos para adultos, tres complementados con diferentes concentraciones de EDC y uno con el disolvente EE2 solo. Mantenga las moscas a 25 grados centígrados durante dos o tres días para permitir que se aparecen. Luego, ordene cada cohorte de moscas por sexo en dos grupos.Dentro de cada condición de tratamiento, para ambos sexos, subdividir aleatoriamente cada grupo en cinco viales paralelos a una densidad de 20 individuos por vial. Prepare una hoja de cálculo de vida útil en la que el número de moscas muertas se resta del número de moscas supervivientes de la transferencia anterior, de modo que el número de supervivientes en cada transferencia se obtenga automáticamente. Después de tres días, transfiera las moscas sin anestesia a nuevos viales que contengan los alimentos correspondientes al mismo tiempo y compruebe la muerte.Registre la edad de las moscas y el número de moscas muertas. Repita la transferencia cada tres días hasta que todas las moscas mueran. En este experimento, las curvas de vida útil se trazaron como la supervivencia acumulativa frente a los días transcurridos para cada concentración de la EDC y el control.Para el control, después de un largo período inicial en el que la curva de supervivencia se mantuvo relativamente alta, disminuyó exponencialmente después de unos 60 días. Después de la exposición de la EDC, la curva de supervivencia de las moscas tratadas se vio afectada significativamente y mostró una disminución dramática después de 36 días. Se aconseja acerca de que los viales paralelos en análisis deben ser muy similares, de lo contrario será difícil entender cuál desechar.Por lo tanto, sugerimos tener mucho cuidado, adoptando una buena práctica experimental, utilizando un gran tamaño de muestra. Siguiendo estos protocolos, también es posible evaluar el impacto transgeneracional de un disruptor endocrino seleccionado, así como probar los posibles efectos aditivos de una combinación de diferentes disruptores endocrinos.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Analizando poblaciones de células sanguíneas de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

La cría de la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bajo axénicos y Condiciones gnotobióticos

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Métodos para examinar los nódulos linfáticos y en los hemocitos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Descongelación, cultivo y criopreservación de líneas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Imágenes en animales enteros de Drosophila melanogaster mediante tomografía microcomputada

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Imágenes de explantes cerebrales vivos de larvas de Drosophila melanogaster en el tercer estadio

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autor destacado: Investigación de la dinámica de la división celular asimétrica: un protocolo para la obtención de imágenes en vivo de explantes cerebrales de larvas de Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...