Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Författarna tackar Orsolina Petillo för teknisk support. Författarna tackar Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) för bibliografiska stöd. Författarna tackar Dr Gustavo Damiano Mita för att införa dem till EDC världen. Författarna tackar Leica Microsystems och Pasquale Romano för deras hjälp. Denna forskning stöddes av Project PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie orientera alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica i Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 KAMPANIEN; Projekt PO FESR Kampanien 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

1. beredning av livsmedel
<ol><li>
För lager underhåll och för larv tillväxt, Använd en majsmjöl medium som innehåller 3% pulveriserad jäst, 10% sackaros, 9% förkokt majsmjöl, 0,4% agar, därefter kallas majsmjöl medium (cm).
	<ol>
<li>Sätt 30 g jäst i 100 mL kran vatten, ta den till en koka och låt den koka i 15 min.</li>
		<li>Separat, blanda väl 90 g förkokt majsmjöl, 100 g socker, och 4 g agar i 900 mL kran vatten.</li>
		<li>Ta lösningen till en koka, Sänk värmen och koka i 5 m...

Frukt flugan D. melanogaster har i stor utsträckning använts som ett in vivo-modellsystem för att undersöka de potentiella effekterna av miljö-edcs såsom DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31, 32, DEHP33och EE234. Flera anledningar har lett till dess användning som förebild inom detta forsknings område. Bortsett från dess...

Mänsklig verksamhet har släppt ut i miljön en massiv mängd kemikalier, som utgör ett allvarligt problem för organismer och för naturliga eko system1. Av dessa föroreningar uppskattas det att cirka 1 000 olika kemikalier kan förändra den normala balansen i endokrina system; enligt denna egenskap klassificeras de som endokrinstörande kemikalier (hormonstörande ämnen). Specifikt, baserat på en nyligen definition av endokrina samfundet, EDCs är "en exogen kemikalie, eller blandning av kemikalier, som kan störa någon aspekt av hormon åtgärder"2. Under de senaste tre decennierna har det vuxit fram vetenskapliga belägg för att hormonstörande ämnen kan påverka reproduktion och utveckling av djur och växter3,4,5,6,7, och 8. Ytterligare, EDC exponering har varit relaterad till den ökande prevalensen av vissa mänskliga sjukdomar, inklusive cancer, fetma, diabetes, sköldkörtel sjukdomar, och beteendemässiga störningar9,10,11.
Allmänna mekanismer för EDC
På grund av sina molekyl ära egenskaper beter sig edcs som hormoner eller hormon prekursorer3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. I denna mening, de kan binda till ett hormon ' s receptor och störa endokrina system antingen genom att imitera hormon aktivitet eller genom att blockera endogena hormoner bindande. I det första fallet, efter bindning till receptorn, de kan aktivera det som dess naturliga hormon skulle göra. I det andra fallet, bindning av EDC till receptorn förhindrar bindningen av dess naturliga hormon, så receptorn är blockerad och kan inte längre aktive ras, även i närvaro av dess naturliga hormon3. Som en följd, hormonstörande ämnen kan påverka flera processer, såsom syntes, sekretion, transport, metabolism, eller perifer verkan av endogena hormoner som är ansvariga för upprätthållandet av homeostas, reproduktion, utveckling, och/eller beteende av organismen. Receptor bindning är inte det enda sättet för åtgärder som hittills beskrivits för hormonerna. Det står nu klart att de också kan agera genom att rekrytera coactivatorer eller corepressorer i enzymatiska vägar eller genom att modifiera epigenetiska markörer avreglera gen uttryck10,11,12,13 ,14, med följder inte endast för ström utvecklingen men också för det vård-av utvecklingar att komma8.
Drosophila hormoner
De potentiella effekterna av utvalda hormonstörande ämnen har studerats brett, både i vilda djur och i flera modell system där endokrina mekanismer är tämligen välkända. För ryggradslösa djur har endokrina system som påverkar tillväxt, utveckling och reproduktion i stor utsträckning karaktäriserats av insekter av flera anledningar, vilket inbegriper deras omfattande användning inom området biologisk forskning, deras ekonomiska betydelse, och Slutligen utvecklingen av insekticider kan ingripa specifikt med hormon systemet av skadegörare insekter.
I synnerhet bland insekter, har frukten flyga D. melanogaster visat sig vara ett mycket kraftfullt modell system för att utvärdera de potentiella endokrina effekterna av hormonstörande ämnen. I D. melanogaster, liksom i ryggradsdjur, hormoner spelar en viktig roll under hela livs cykeln. I denna organism, det finns tre huvudsakliga hormonella system, som involverar steroid hormonet 20-hydroxyecdysone (20e)15,16, den sesquiterpenoid juvenila hormonet (Jh)17, och neuropeptider och peptid/protein hormoner18. Denna tredje grupp består av flera peptider som upptäcktes på senare tid men klart involverade i ett enormt utbud av fysiologiska och beteendemässiga processer, såsom livs längd, homeostas, metabolism, reproduktion, minne och rörelse kontroll. 20E är homologa till kolesterol-härledda steroidhormoner såsom estradiol, medan JH delar vissa likheter med retinoinsyra; båda är de mer kända hormonerna i Drosophila19,20. Deras balans är avgörande för att samordna ömsat och metamorfos, samt för att kontrol lera flera postutvecklande processer, såsom reproduktion, livs längd, och beteende21, vilket erbjuder olika möjligheter för att testa endokrina störningar i Drosophila. Ytterligare, ecdysteroid hormoner och JHs är de viktigaste målen för den så kallade tredje generationens insekticider, som utvecklats för att störa utvecklings-och reproduktiva endokrina medierade processer i insekter. Den agonist eller antagonist verkningsmekanismen av dessa kemikalier är välkänd, och därmed kan de fungera som referens standarder för att utvärdera effekterna av potentiella hormonstörande ämnen på tillväxt, reproduktion, och utveckling av insekter22. Till exempel, Methoprene, som har varit allmänt används för att kontrol lera myggor och andra vatten levande insekter23,24, fungerar som en Jh-agonist och pressar 20e-inducerad gentranskription och metamorfos.
Förutom hormoner, kärn-receptor (NR) superfamiljen i Drosophila är också välkänd; Den består av 18 evolutionärt bevarade transkriptionsfaktorer involverade i att kontrol lera hormon beroende utvecklings vägar, samt reproduktion och fysiologi25. Dessa hormon NRS tillhör alla sex nr superfamiljen subtypes, inklusive de inblandade i neurotransmission26, två för retinoinsyra Acid NRS, och de för steroid NRS att, på ryggradsdjur, utgör ett av de primära målen för hormonstörande ämnen27.
Drosophila som modell system för att studera hormonerna
För närvarande, på grund val av molekyl ära egenskaper, kan flera miljö byråer runt om i världen tillräkna potentialen att störa de endokrina systemen till olika konstgjorda kemikalier. Med tanke på att hormonerna är ett globalt och allmänt förekommande problem för miljön och för organismer, är det övergripande målet för forskningen på detta område att minska deras sjukdoms börda, samt att skydda levande organismer från deras negativa effekter. För att fördjupa förståelsen om de potentiella endokrina effekterna av en kemikalie, är det nödvändigt att testa den in vivo. För detta ändamål representerar D. melanogaster ett giltigt modell system. Hittills har frukt flugan använts i stor utsträckning som in vivo modell för att utvärdera effekterna av flera miljö-Hormonorganiska ämnen; Det har rapporter ATS att exponering för flera hormonerna, såsom dibutylftalat (DBP)28, bisfenol a (BPA), 4-nonylfenol (4-NP), 4-tert-octylfenol (4-TERT-OP)29, METYLPARABEN (MP)30, ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-etylhexyl) ftalat (dehp)33, och 17-α-ETINYLESTRADIOL (EE2)34, påverkar metabolism och endokrina funktioner som i ryggradsdjur modeller. Flera anledningar har lett till dess användning som förebild inom detta forsknings område. Utöver en utmärkt kunskap om dess endokrina system, ytterligare fördelar inkluderar dess korta livs cykel, låg kostnad, lätt manipulerbara genom, en lång historia av forskning, och flera tekniska möjligheter (se FlyBase hem sida, http://flybase.org/). D. melanogaster ger också en kraftfull modell för att enkelt studera transgenerationseffekter och populations reaktioner på miljö faktorer8 och undviker etiska frågor som är relevanta för in vivo-studier på högre djur. Dessutom, banan fluga delar en hög grad av gen bevarande med människor som kan göra det möjligt för Drosophila EDC analyser för att hjälpa till att förutsäga eller föreslå potentiella effekter av dessa kemikalier för människors hälsa. Förutom att öka förståelsen för människors hälso effekter kan Drosophila hjälpa till att bedöma riskerna med EDC-exponering för miljön, såsom förlust av biologisk mångfald och miljöförstöring. Slutligen ger frukt flugan den extra fördelen att de används i laboratorier, där de faktorer som potentiellt påverkar dess utveckling, reproduktion och livs längd kan hållas under kontroll för att tillskriva en variant av ämnet som skall testas.
Med detta i åtanke, vi har optimerat enkla och robusta Fitness analyser för att fastställa EDC effekter på vissa Drosophila hormonella egenskaper, såsom fruktsamhet/fertilitet, utveckling timing, och vuxen livs längd. Dessa analyser har ofta använts för vissa edcs23,24,25,26,27. I synnerhet har vi använt följande protokoll för att utvärdera effekterna av exponeringen för syntetiskt östrogen EE234 och till BPA och BISFENOL AF (BPA F) (opublicerade data). Dessa protokoll kan lätt ändras för att undersöka effekterna av en given EDC i taget, liksom de kombinerade effekterna av flera hormonerna i D. melanogaster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

Under de senaste åren har det funnits allt fler belägg för att alla organismer och miljön utsätts för hormonliknande kemikalier, så kallade hormonstörande kemikalier (EDCs). Dessa kemikalier kan förändra den normala balansen i endokrina system och leda till negativa effekter, samt ett ökande antal hormonella störningar i den mänskliga populationen eller störd tillväxt och minskad reproduktion i vilda arter. För vissa hormonrelaterade ämnen finns dokumenterade hälso effekter och restriktioner för deras användning. Men för de flesta av dem finns det fortfarande inga vetenskapliga belägg i den meningen. För att kontrol lera potentiella endokrina effekter av en kemikalie i hela organismen, måste vi testa den i lämpliga modell system, liksom i banan fluga, Drosophila melanogaster. Här rapporterar vi detaljerade in vivo-protokoll för att studera endokrina störningar i Drosophila, ta itu med EDC effekter på fruktsamhet/fertilitet, utveckling timing, och livs längd i farten. Under de senaste åren har vi använt dessa Drosophila livs drag för att undersöka effekterna av exponering för 17-α-etinylestradiol (EE2), bisfenol A (BPA), och bisfenol AF (BPA F). Sammantaget omfattade dessa tester alla Drosophila livs stadier och gjorde det möjligt att utvärdera endokrina störningar i alla hormon-medierade processer. Fecundity/fertilitet och utveckling timing analyser var användbara för att mäta EDC inverkan på fluga fortplantnings förmågan och på utvecklingsstadier, respektive. Slutligen, livs längd analysen inblandade kronisk EDC exponeringar mot vuxna och mätt deras överlevnad. Dessa livs egenskaper kan dock också påverkas av flera experimentella faktorer som måste kontrol leras noggrant. Så, i detta arbete, föreslår vi en rad förfaranden som vi har optimerat för rätt resultat av dessa analyser. Dessa metoder gör det möjligt för forskarna att etablera endokrina störningar för alla HORMONSTÖRANDE ämnen eller för en blandning av olika hormonstörande egenskaper i Drosophila, men för att identifiera den endokrina mekanismen som är ansvarig för effekten kan ytterligare uppsatser behövas.

I detta avsnitt rapporteras de viktigaste stegen i ovanstående protokoll i form av förenklade system. Med tanke på att flugor tenderar att undvika obehagliga föreningar, är det första att göra för att assay smaken av den valda EDC. Detta kan göras genom att blanda en karamellfärg (till exempel, rött mat färg ämne nr. 40)35 med maten kompletterat med den utvalda EDC på olika doser eller med vätskan ensamt. Flugor som matas på dessa media unders öks under ett stereo mikroskopet och ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Kemikalier för hormonstörande ämnen utgör ett allvarligt problem för organismer och för naturliga miljöer. Drosophila melanogaster är en idealisk modell för att studera EDC-effekter in vivo. Här presenterar vi metoder för att undersöka endokrina störningar i Drosophila, ta itu med EDC effekter på fruktsamhet, fertilitet, utveckling timing, och livs längd i farten.

Metoder för att testa endokrina störningar i Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster är en kraftfull modell för att in vivo utvärdera de potentiella toxiska och endokrina effekterna av kemikalier, såsom hormonstörande ämnen, som utgör ett allvarligt problem för människors hälsa och naturliga miljöer. Att ta itu med effekten av EDCs på de hormonella livsdrag i flugan, såsom fruktbarhet, fertilitet, utvecklingstid, och livslängden. Det är ett enkelt, billigt och snabbt sätt att undersöka endokrina störningar in vivo.Fertilitet, utveckling, och livslängd i Drosophila kan påverkas av flera faktor som måste kontrolleras noggrant för att säkerställa ett framgångsrikt resultat av detta protokoll. Därför krävs maximal uppmärksamhet vid uppfödning och hantering av flugor. För att analysera smaken av den valda EDC, efter anesthetisering, överföra 15 unga flugor från flugsängen till fyra parallella injektionsflaska som innehåller majsmjölsmedium blandat med en livsmedelsfärg.Kontrollflaskan innehåller lösningsmedlet ensamt, och de tre övriga injektionsflaskan kompletteras med olika doser av de utvalda EDC: erna. Förvara injektionsflaskan i en fuktad inkubator under en dag med ett naturligt 12-timmarsljus. Efter att ha sövt flugorna igen, överför de immobiliserade flugorna till ett vitt papper, och placera det under ett stereomikroskop för att observera.Jämför bukfärgningen för varje behandlingsgrupp med avseende på kontrollgruppen. För att analysera flugornas reproduktionsförmåga, förbered tre injektionsflaska med flugor för varje EDC som föräldra- injektionsflaska, med åtta honor och fyra hanar i 10 milliliter majsmjölsmedium kompletterat med EE2. För kontrollen, förbereda sex injektionsflaska med flugor, var och en med åtta honor och fyra hanar i 10 milliliter av majsmjöl medium mat kompletterad med EE2 lösningsmedel.Bakre flugor i en inkubator vid 25 grader Celsius. Under deras utveckling, undvik överbeläggning av larverna. Efter fyra dagar, invertera varje injektionsflaska över en etherizer för att ta bort föräldrarna och returnera injektionsflaskan till inkubatorn i ytterligare fem dagar.Sent på eftermiddagen dag nio, invertera varje injektionsflaska över en etherizer för att ta bort alla nyuppförda flugor från injektionsflaskan och sätta injektionsflaskan i en annan inkubator på 18 grader Celsius över natten. På morgonen dag 10, på en Drosophila koldioxid arbetsstation, försiktigt invertera odlingsflaskan för att förhindra sövda flugor från att falla på medium och sätt in ett gummirör med en nål i injektionsflaskan mellan bomullsproppen och injektionsflaskan väggen. Öppna ventilen för att leverera koldioxid.Inom några sekunder, överför flugorna till en flugsäng under ett mikroskop. Samla jungfruliga honor och unga hanar separat i två grupper på flugsängen. Slumpvis subdivide varje grupp av flugor i små undergrupper, med 10 honor eller 20 hanar per injektionsflaska fylld med färskt motsvarande majsmjöl medium.Fortsätt inkubering och samla in 30 jungfruliga honor och 30 hanar för varje EDC, och 90 jungfruliga honor och 90 hanar för kontrollen. Hus dessa grupper av flugor på 25 grader Celsius tills de är i åldern fyra dagar efter eclosion. Överför dem sedan till nya injektionsflaska som innehåller färskt motsvarande medium varannan dag.Kontrollera att det inte finns några larver i injektionsflaskan hos honor. Märk sedan in injektionsflaska med en annan serie sekventiella nummer för följande behandling. Efter anesthetization, överför en EE2 lösningsmedel-behandlad hona i en liten injektionsflaska som innehåller färskt majsmjöl tomat medium utan EE2 och tillsätt en EE2 lösningsmedel-behandlade hane för kontroll över.Para ihop en EE2-behandlad hane med EE2 lösningsmedelsbehandlad hona eller EE2-behandlad hona med EE2 lösningsmedelsbehandlad hane för varje behandling. Hus 20 enstaka kors vid 25 grader Celsius. Överför varje parningspar till färska majsmjöl tomat medelstora injektionsflaska utan EDC varje dag under de efterföljande 10 dagarna.Visuellt inspektera varje injektionsflaska varje dag för äggen och rapportera deras antal på fertilitet kalkylblad. I varje injektionsflaska, kontrollera noga för nyuppkomna flugor och registrera det dagliga antalet vuxna avkomor under 10-dagarsperioden. Efter 10 dagar från den första parningen, ta bort föräldrarna från den sista serien av injektionsflaska.I eclosion assay protokoll, först, för varje behandlingsgrupp, inrätta 10 injektionsflaska av unga, friska flugor mindre än två dagar gammal, var och en med sex honor och tre hanar i 10 milliliter majsmjöl mat utan EDC. Bakre flugorna på mat i 24 timmar och låt dem para sig. Sedan förbereda ytterligare 10 parallella injektionsflaska per behandlingsgrupp med 10 milliliter vardera av färsk majsmjöl mat kompletterad med olika EDC koncentrationer eller EE2 lösningsmedlet ensam för kontrollen.Överför de parade flugorna till dessa nya injektionsflaska. Gör ett kalkylblad för utveckling för att spela in de olika serierna. Låt flugorna lägga ägg i 16 timmar.Ta sedan bort föräldrarna från injektionsflaskan. Inkubera injektionsflaskan vid 25 grader Celsius i tre till fyra dagar, eller tills vandrande larver är synliga. Varje dag, räkna antalet nya puppor i varje injektionsflaska genom att skriva ett nummer i följd av varje pupa på utsidan av injektionsflaskan för att undvika att räkna samma pupa två gånger.Rapportera antalet nyuppkomna puppor i tre till fyra dagar, eller tills ingen mer puppor form. Från och med dag nio, räkna antalet nya vuxna dagligen, tills inga fler vuxna dyker upp. Rapportera det på utvecklingskalkbladet och utför resten av eclosion assay enligt manuskriptet.I livslängden protokollet, först inrätta 20 injektionsflaska med åtta honor och fyra hanar, var och en fylld med 10 milliliter majsmjöl mat och hus dem på 25 grader Celsius. Efter fyra dagar, kasta flugorna och placera injektionsflaskan tillbaka i inkubatorn. Under sen eftermiddag dag nio, ta bort alla nyuppförda flugor från injektionsflaskan och returnera injektionsflaskan till inkubatorn.Efter 16 till 24 timmar, dela 250 en dags gamla vuxna flugor av båda könen i fyra grupper under lätt koldioxidbedövning och överföra dem till 250-milliliter flaskor som innehåller vuxna medelhög mat, tre kompletteras med olika EDC koncentrationer och en med EE2 lösningsmedel ensam. Underhåll flugorna vid 25 grader Celsius i två till tre dagar så att de kan para sig. Sortera sedan varje kohort av flugor efter kön i två grupper.Inom varje behandlingstillstånd, för båda könen, dela slumpmässigt upp varje grupp i fem parallella injektionsflaska vid en densitet av 20 individer per injektionsflaska. Förbered ett livslängds kalkylblad där antalet döda flugor subtraheras från antalet överlevande flugor från den tidigare överföringen, så att antalet överlevande vid varje överföring erhålls automatiskt. Efter tre dagar överför du flugorna utan bedövning till nya injektionsflaska som innehåller motsvarande mat samtidigt och kontrollerar om det finns döden.Registrera flugornas ålder och antalet döda flugor. Upprepa överföringen var tredje dag tills alla flugorna dör. I detta experiment ritades livslängden kurvor som den kumulativa överlevande jämfört med förfluten dagar för varje EDC koncentration och kontroll.För kontrollen, efter en lång inledande period där efterlevandekurvan förblev relativt hög, minskade exponentiellt efter ca 60 dagar. Efter EDC exponering, survivorship kurvan av de behandlade flugorna påverkades avsevärt och visade dramatisk nedgång efter 36 dagar. Det rekommenderas om att de parallella injektionsflaskan under analys bör vara mycket lika, annars blir det svårt att förstå vilka att kasta.Därför föreslår vi att du är mycket försiktig, antar en god experimentell praxis, med hjälp av en stor provstorlek. Efter dessa protokoll är det också möjligt att utvärdera transgenereringspåverkan från ett utvalt hormonstörande ljud liksom att testa de potentiella additiva effekterna av en kombination av olika hormonstörande ämnen.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Analysera blodcellpopulationer av<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Uppfödning bananfluga<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Under axenisk och gnotobiotiska Villkor

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Metoder för att undersöka lymfkörtel och hemocyter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protokoll för Visualisering steroidogena organ och deras interaktiva organ med immunfärgning i fruktflugan<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Upptining, odling och bevarandet Drosophila cellinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Analys för blod-hjärnbarriären integritet i Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Hel djuravbildning av Drosophila melanogaster med mikrodatortomografi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Avbildning av levande hjärnexplantat från Drosophila melanogaster Third Instar-larver

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Författare Spotlight: Undersöker asymmetrisk celldelningsdynamik: Ett protokoll för live-avbildning av Drosophila-larvhjärnexplantat 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Levande cellavbildning av Drosophila melanogaster Tredje Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...