Name: methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Yazarlar teknik destek için Orsolina Petillo teşekkür ederiz. Yazarlar, bibliyografik destek için Dr. mariarosaria Aletta 'ya (CNR) teşekkür ederler. Yazar, Dr. Gustavo Damiano Mita 'ya onları EDC dünyasına takdim etmesi için teşekkür ederler. Yazarlar yardım için Leica Microsystems ve Pasquale Romano teşekkür ederiz. Bu araştırma proje PON03PE_00110_1 tarafından destekleniyordu. "Sviluppo di nanotecnologie orientate Alla rigenerazione e ricostruzione tissutale, odontoiatria/oculistica içinde implantologia e sensoristica" tanıtıldı "Sorriso"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Proje PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE BAŞıNA Il RILASCIO CONTROLLATO DI moleküler BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

1. gıda hazırlama
<ol><li>
Stok bakım ve larva büyüme için,% 3 toz Maya,% 10 sakaroz,% 9 önceden pişmiş mısır unu, 0,4% agar, daha sonra Mısır unu Orta (cm) denilen içeren bir Mısır yemeği ortamı kullanın.
	<ol>
<li>100 mL musluk suyu içine Maya 30 g koyun, bir kaynatma getirmek ve 15 dakika boyunca kaynatın izin.</li>
		<li>Ayrı olarak, Mix iyi 90 g önceden pişmiş mısır unu, 100 g şeker ve 4 g agar içine 900 mL musluk suyu.</li>
		<li>Bir kaynatma çözümü getirmek, ıs?...

Meyve sinek D. melanogaster yaygın olarak DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31 gibi çevresel EDCs potansiyel etkilerini araştırmak için bir In vivo model sistemi olarak istihdam edilmiştir 32, DEHP33ve EE234. Çeşitli nedenlerle bu araştırma alanında bir model olarak kullanımını açtı. Bir model sistemi olarak onun t...

İnsan faaliyetleri çevreye büyük miktarda kimyasallar, organizmalar için ciddi bir sorun ve doğal ekosistemler1için temsil serbest edilmiştir. Bu kirleticilerin, yaklaşık 1.000 farklı kimyasallar endokrin sistemlerin normal dengesini değiştirebilir tahmin edilmektedir; Bu özelliğe göre, endokrin bozma kimyasalları (EDCs) olarak sınıflandırılır. Özellikle, endokrin Society tarafından son tanımına dayanarak, EDCs "bir eksojen kimyasal, ya da kimyasallar karışımı, hormon eylem herhangi bir yönü ile müdahale edebilir"2. Son üç yıl içinde, EDCs üreme ve hayvanların ve bitkilerin gelişimini etkileyebilir bilimsel kanıtlar büyüyen olmuştur3,4,5,6,7, 8' den itibaren. Ayrıca, EDC pozlama kanser, obezite, diyabet, tiroid hastalıkları, ve davranışsal bozukluklar da dahil olmak üzere bazı insan hastalıkları, artan prevalansı ile ilgili olmuştur9,10,11.
EDC genel mekanizmaları
Moleküler özelliklerinedeniyle, EDCs hormonlar veya hormon öncüleri gibi davranır3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. Bu anlamda, onlar bir hormon reseptörü bağlamak ve hormon aktivitesini taklit ederek ya da endojen hormonları bağlama bloke ederek endokrin sistemlerini bozabilir. İlk durumda, reseptör bağladıktan sonra, doğal hormon yapacağını olarak etkinleştirebilirsiniz. Diğer durumda, reseptör EDC bağlayıcı doğal hormon bağlama önler, bu nedenle reseptör bloke edilir ve artık aktif olabilir, doğal hormonu varlığında bile3. Sonuç olarak, EDCs, homeostasis, üreme, gelişim ve/veya davranışlarının bakımından sorumlu endojen hormonların sentezlenmesi, salgılanması, taşınması, metabolizması veya periferik etkisi gibi çeşitli süreçleri etkileyebilir organizma. Reseptör bağlayıcı eylem şimdiye kadar EDCs için açıklanan tek yolu değildir. Şimdi onlar da enzimatik yolların koaktijen veya corepressors işe tarafından ya da gen ifadesi deregülasyonu epigenetik işaretçileri değiştirerek hareket edebilir açıktır10,11,12,13 ,14, sadece mevcut nesil için değil, aynı zamanda nesiller sağlık için8gelmek için sonuçları ile.
Drosophila hormonları
Seçilen EDCs potansiyel etkileri yaygın olarak incelenmiştir, hem yaban hayatı türleri ve çeşitli model sistemlerde hangi endokrin mekanizmaları makul iyi bilinmektedir. Omurgasızlar için, büyüme, geliştirme ve üreme etkileyen endokrin sistemler yaygın olarak çeşitli nedenlerden dolayı böcekler ile karakterize edilmiştir, biyolojik araştırma alanında geniş kullanımı içeren, ekonomik önemi, ve son olarak böcek böceklerin hormon sistemi ile özellikle müdahale edebilmek için insektisit gelişimi.
Özellikle, böcekler arasında, meyve sinek D. melanogaster EDCs potansiyel endokrin etkilerini değerlendirmek için çok güçlü bir model sistemi olduğu kanıtlanmıştır. D. melanogaster, hem de omurgalı olarak, hormonlar tüm yaşam döngüsü boyunca önemli bir rol oynamaktadır. Bu organizmada, üç ana hormonal sistem vardır, hangi steroid hormonu içeren 20-hidroxyecdysone (20E)15,16, seskuiterpenoid Juvenil hormonu (JH)17, ve nörofobik ve peptid/protein hormon18. Bu üçüncü grup birçok peptitler daha son zamanlarda keşfedilen ancak açıkça fizyolojik ve davranışsal süreçler, uzun ömürlü, homeostasis, metabolizma, üreme, bellek ve Lokomotor kontrol gibi çok çeşitli yer oluşur. 20E kolesterol türevi steroid hormonları estradiol gibi homolog, JH retinoik asit ile bazı benzerlik paylaşırken; ikisi de Drosophila19,20daha iyi bilinen hormonlar vardır. Onların dengesi kalıp ve Metamorphosis koordine hayati, yanı sıra, üreme, ömür ve davranış21gibi çeşitli postdevelopmental süreçleri kontrol etmek, böylece endokrin test etmek için farklı olanaklar sunan Drosophila 'da bozulma. Dahası, ecdysteroid hormonları ve JHs, böceklerde gelişimsel ve üreme endokrin aracılı süreçlere müdahale etmek için geliştirilen, sözde üçüncü nesil böcek öldürücülerin ana hedefleridir. Agonisti veya bu kimyasalların eylem antagonisti modu iyi bilinmektedir ve böylece onlar büyüme, üreme, ve böcek gelişimi üzerinde potansiyel EDCs etkilerini değerlendirmek için referans standartları olarak hizmet verebilir22. Örneğin, sivrisinekler ve diğer su böcekler23,24kontrol yaygın olarak kullanılan Methoprene, bir JH agonist olarak çalışır ve 20E kaynaklı gen transkripsiyon ve Metamorphosis bastırır.
Hormonlara ek olarak, Drosophila 'daki nükleer reseptör (NR) süper ailesi de bilinmektedir; hormon bağımlı gelişimsel yolların kontrol edilmesi, üreme ve Fizyoloji25' in yanı sıra evrimsel olarak gerçekleştirilen 18 transkripsiyon faktöründen oluşur. Bu hormon NRs tüm altı NR süper aile alt türlerine aittir, nörotransmisyon katılan olanlar dahil olmak üzere26, retinoik asit NRS için iki, ve steroid NRS için bu, omurates Içinde, EDCs temel hedeflerinden birini temsil27.
EDCs okumak için bir model sistemi olarak Drosophila
Şu anda, moleküler özellikleri temelinde, dünya çapında çeşitli çevre kurumları endokrin sistemleri farklı insan yapımı kimyasallara müdahale potansiyeline atanıyor. EDCs çevre ve organizmalar için küresel ve her yerde bir sorun olduğu göz önüne alındığında, bu alanda araştırma genel amacı onların hastalık yükünü azaltmak, yanı sıra onların olumsuz etkilerinden yaşayan organizmaları korumak için. Bir kimyasalın potansiyel endokrin etkileri hakkında anlayış derinleştirmek için, It in vivo test etmek gereklidir. Bu amaçla, D. melanogaster geçerli bir model sistemi temsil eder. Bugüne kadar, meyve sinek çeşitli çevresel EDCs etkilerini değerlendirmek için in vivo modeli olarak yaygın olarak kullanılmıştır; Bu birkaç EDCs maruz olduğu bildirilmiştir, örneğin Dibutil ftalat (DBP)28, Bisfenol A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-op)29, metilparaben (MP)30, etilparaben (EP)31, 32, bis-(2-etilhekil) FTALAT (dehp)33ve 17-α-ethinylestradiol (EE2)34, omurga modellerinde olduğu gibi metabolizma ve endokrin fonksiyonları etkiler. Çeşitli nedenlerle bu araştırma alanında bir model olarak kullanımına yol açmıştır. Endokrin sistemlerinin mükemmel bir bilgi ötesinde, daha fazla avantaj, kısa yaşam döngüsü, düşük maliyetli, kolayca manipulable genom, araştırma uzun bir geçmişi ve çeşitli teknik olanaklar (bkz: FlyBase Web sitesi, http://flybase.org/). D. melanogaster Ayrıca çevre faktörleri8 ' e transjenerasyonel etkileri ve nüfus yanıtlarını kolayca incelemek için güçlü bir model sağlar ve yüksek hayvanlarda in vivo çalışmalar için ilgili etik sorunları önler. Buna ek olarak, meyve sinek, Drosophila EDC için mümkün kılan insanlar ile gen koruma yüksek derecede hisse öngörü veya insan sağlığı için bu kimyasalların potansiyel etkilerini düşündürmektedir yardımcı olduğunu söylüyor. İnsan sağlığı etkileri hakkında anlayış genişleyen yanı sıra, Drosophila, biyolojik çeşitlilik kaybı ve çevresel bozulma gibi çevreye EDC maruz kalma riskleri değerlendirmek için yardımcı olabilir. Son olarak, meyve sinek test edilecek maddeye herhangi bir varyasyon niteliği için kontrol altında tutulabilir faktörler potansiyel olarak gelişimi, üreme ve ömrünü etkileyen laboratuvarlarda kullanılan ek avantajı sunar.
Bu akılda, biz, bazı Drosophila hormonal özellikleri üzerinde EDC etkilerini belirlemek için basit ve sağlam Fitness deneyleri optimize edilmiştir, gibi özlülik/fertilite, gelişimsel zamanlama, ve yetişkin ömrü. Bu çeşitli EDCs23,24,25,26,27için yaygın olarak kullanılmıştır. Özellikle, biz sentetik östrojene maruz kalma etkilerini değerlendirmek için aşağıdaki protokolleri kullandık EE234 ve BPA ve Bisfenol için AF (BPA F) (yayımlanmamış veriler). Bu protokoller, bir defada belirli bir EDC etkilerini araştırmak için kolayca değiştirilebilir, hem de D. melanogasterbirden fazla EDCs kombine etkileri.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>17&#945;-Ethinylestradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for Drosophila medium</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239658-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol AF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90477-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>CA&#39; BIANCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789008</td>
			<td>25x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>BIOSIGMA</td>
			<td>789009</td>
			<td>29x95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vials</td>
			<td>Kaltek</td>
			<td>187</td>
			<td>22X63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherizer</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>cylindrical glass container with a cotton plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250mL Bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>ST 10024</td>
			<td>FLAT BOTTOM TUBE 100X24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand blender Pimmy</td>
			<td>Ariete</td>
			<td></td>
			<td>food processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Success yeast</td>
			<td>ESKA</td>
			<td></td>
			<td>Powdered yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laying tray</td>
			<td>Crafts</td>
			<td></td>
			<td>plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351016</td>
			<td>60x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red dye no. 40</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with LED lights</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>S4E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>MB025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomato sauce</td>
			<td>Cirio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to test endocrine disruption in drosophila melanogaster

Son yıllarda tüm organizmaların ve çevrenin endokrin parçalayıcı kimyasalları (EDCs) olarak bilinen hormon benzeri kimyasallara maruz kaldığı kanıtlar büyüyor. Bu kimyasallar endokrin sistemlerin normal dengesini değiştirebilir ve olumsuz etkilere yol açabilir, hem de insan nüfusunda hormonal bozuklukların artan sayıda ya da rahatsız edici büyüme ve yaban hayatı türlerinde üreme azalır. Bazı EDCs için, onların kullanımı üzerinde belgelenen sağlık etkileri ve kısıtlamalar vardır. Ancak, çoğu için, bu anlamda hala bilimsel bir kanıt yoktur. Tam organizmada bir kimyasal potansiyel endokrin etkilerini doğrulamak için, biz uygun model sistemlerinde test etmek gerekir, yanı sıra meyve sinek, Drosophila melanogaster. Burada Drosophila endokrin bozulma çalışması için ayrıntılı in vivo protokolleri rapor, uzallık/fertilite üzerinde EDC etkileri ele, gelişimsel zamanlama, ve sinek ömrü. Son birkaç yılda, bu Drosophila yaşam özelliklerini 17-α-ethinylestradiol (EE2), Bisfenol A (BPA) ve Bisfenol AF (BPA F) maruz kalma etkilerini araştırmak için kullandık. Tamamen, bu tüm Drosophila yaşam aşamalarını kapsanan ve tüm hormon aracılı süreçlerde endokrin bozulması değerlendirmek mümkün hale gösteriyor. Gelişimsel/fertilite ve gelişim zamanlamaları, sırasıyla, sinek üreme performansı ve gelişim aşamalarında EDC etkisini ölçmek için yararlıdır. Son olarak, ömrü tahlil yetişkinler için kronik EDC pozlama dahil ve onların survivorship ölçülen. Ancak, bu yaşam özellikleri de dikkatle kontrol edilmesi gereken birkaç deneysel faktörler tarafından etkilenebilir. Yani, bu iş, biz bu süreçlerin doğru sonucu için optimize ettik prosedürleri bir dizi öneririz. Bu yöntemler, bilim adamlarının herhangi EDC için veya Drosophila farklı EDCs bir karışımı için endokrin bozulma kurmak için izin, ancak etki için sorumlu endokrin mekanizması tanımlamak için, daha fazla denemeler gerekli olabilir.

Bu bölümde, yukarıdaki protokollerin önemli adımları Basitleştirilmiş düzenleri şeklinde bildirilir. Bu sinekler tatsız bileşikler önlemek eğilimindedir göz önüne alındığında, yapılacak ilk şey assay seçilen EDC tadı etmektir. Bu bir gıda boyama karıştırma yapılabilir (örneğin, kırmızı gıda boya No. 40)35 çeşitli dozlarda veya tek başına çözücü Ile seçilen EDC ile tamamlayıcı gıda ile. Bu medyada beslenen sinekler bir stereomikoscope altında incelen...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endokrin parçalayıcı kimyasalları (EDCs), organizmalar ve doğal ortamlar için ciddi bir sorun oluşturmaktadır. Drosophila melanogaster EDC efektleri içinde vivo çalışmak için ideal bir model temsil eder. Burada, Drosophila endokrin bozulması araştırmak için yöntemler mevcut, fitabet üzerinde EDC etkileri ele, fertilite, gelişimsel zamanlama, ve sinek ömrü.

Drosophila melanogaster endokrin bozulma test yöntemleri

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster in vivo kimyasalların potansiyel toksik ve endokrin etkilerini değerlendirmek için güçlü bir modeldir, endokrin bozucular gibi, bu insan sağlığı ve doğal ortamlar için ciddi bir sorun temsil. FECundity, doğurganlık, gelişim süresi ve yaşam süresi gibi sinek hormonal yaşam özellikleri, EDCs etkisi ele. Bu vivo endokrin bozulma araştırmak için kolay, ucuz ve hızlı bir yoldur.Drosophila doğurganlık, gelişme ve yaşam süresi dikkatle bu protokolün başarılı bir sonucu sağlamak için kontrol edilmesi gereken çeşitli faktör etkilenebilir. Bu nedenle sinek yetiştirme ve taşımada azami dikkat gereklidir. Seçilen EDC'nin tadını tisem için, anesteziden sonra, 15 genç sinek yiyişiyle, mısır unu ortasını içeren dört paralel şişeye bir gıda boyası ile karıştırın.Kontrol şişesi tek başına çözücü içerir, ve diğer üç şişe seçilen EDCs farklı dozlarda ile desteklenmektedir. Şişeleri 12 saatlik doğal bir ışıkla bir gün boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde tutun. Sinekleri tekrar anestezi ettikten sonra, hareketsiz sinekleri beyaz bir kağıda aktarın ve gözlemlemek için stereo mikroskobun altına yerleştirin.Her tedavi grubunun karın boyasını kontrol grubu ile karşılaştırın. Sineklerin üreme performansını tsaymak için, her EDC için ebeveyn şişeleri olarak sinek üç şişe hazırlamak, sekiz kadın ve dört erkek mısır unu orta 10 mililitre EE2 ile desteklenmektedir. Kontrol için, her biri sekiz dişi ve dört erkek tene2 çözücü ile desteklenen 10 mililitre mısır unu orta gıda olmak üzere altı şişe sinek hazırlayın.Arka, 25 santigrat derecede bir kuvözde uçuyor. Gelişimleri sırasında larvaların aşırı kalabalıklaşmasını önleyin. Dört gün sonra, ebeveynleri çıkarmak ve beş gün daha kuvöze şişeleri geri getirmek için bir etherizer üzerinde her şişe ters.Dokuzuncu günün geç saatlerinde, şişelerden yeni çıkan tüm sinekleri çıkarmak ve şişeleri bir gecede 18 santigrat derecede başka bir kuvöze koymak için her şişeyi bir etherizer'ın üzerine ters çevirin. 10. günün sabahında, Drosophila karbondioksit iş istasyonunda, anestezili sineklerin ortama düşmesini önlemek için kültür şişesini dikkatlice tersine çevirin ve pamuk durdurucu ile şişe duvarı arasındaki şişeye iğneyle kauçuk bir tüp yerleştirin. Karbondioksit sağlamak için vanayı açın.Birkaç saniye içinde, sinekleri mikroskop altında bir sinek yatağına aktarın. Bakire dişileri ve genç erkekleri ayrı ayrı sinek yatağında iki gruba ayırın. Her sinek grubunu küçük alt gruplarhalinde rastgele bölün, şişe başına 10 dişi veya 20 erkek taze mısır unu ile doldurulmuştur.Kuluçkaya devam edin ve her EDC için 30 bakire kadın ve 30 erkek, kontrol için 90 bakire kadın ve 90 erkek toplayın. Bu sinek gruplarını, eclosion sonrası dört gün yaşlanınncaya kadar 25 derecede barındırın. Daha sonra her iki günde bir taze karşılık gelen orta içeren yeni şişeler içine aktarın.Dişi şişelerde larva yok. Daha sonra aşağıdaki tedavi için sıralı numaraları farklı bir dizi ile şişeleri etiket. Anesteziden sonra, ee2 solventle işlenmiş bir dişi, EE2'siz taze mısır unu domates lifi içeren küçük bir şişeye aktarın ve kontrol için bir EE2 solvent le tedavi edilen erkek ekleyin.Her tedavi için EE2 ile tedavi edilen bir erkeği EE2 solvent le tedavi edilen kadın veya EE2 ile tedavi edilen dişi ile EE2 solvent ile tedavi edilen erkek ile eşleştirin. Ev 20 tek haç 25 santigrat derecede. Sonraki 10 gün boyunca her gün EDC olmadan taze mısır unu domates orta şişeler için her çiftleme çifti aktarın.Her şişeyi her gün yumurtalar için görsel olarak inceleyin ve doğurganlık tablosunda sayılarını bildirin. Her şişede, yeni ortaya çıkan sinekler için yakından kontrol edin ve 10 günlük süre içinde yetişkin soyundan günlük sayısını kaydedin. İlk miteden 10 gün sonra, anne ve babaları son şişe serisinden çıkarın.Klozyon test protokollerinde, ilk olarak, her bir tedavi grubu için, iki günden daha eski 10 şişe genç, sağlıklı sinekler, her biri EDC'siz 10 mililitre mısır unu yiyeceğinde altı kadın ve üç erkek vardır. Sinekleri 24 saat boyunca yiyeceklerin üzerine koyve çiftleşmelerine izin ver. Daha sonra tedavi grubu başına 10 adet paralel şişe daha hazırlayın ve her biri farklı EDC konsantrasyonları veya kontrol için tek başına EE2 çözücüsü ile desteklenen taze mısır unu gıdasının her biri.Çiftleştirilmiş sinekleri bu yeni şişelere aktarın. Farklı serileri kaydetmek için bir gelişim tablosu yapın. Sinekler 16 saat boyunca yumurtlamak için izin verin.Sonra, şişelerden ebeveynleri çıkarın. Şişeleri 25 derecede 3-4 gün veya dolaşan larvalar görünene kadar kuluçkaya yatırın. Her gün, aynı pupaiki kez sayma önlemek için şişe dışında her pupa tarafından sırayla bir sayı yazarak her şişede yeni pupa sayısını saymak.Yeni ortaya çıkan pupa sayısını üç ila dört gün veya daha fazla pupa formu oluşmayana bildirin. Dokuzuncu günden itibaren, daha fazla yetişkin ortaya çıkana kadar, her gün ortaya çıkan yetişkinlerin sayısını sayın. Gelişim tablosunda rapor layın ve makaleye göre klozyon tayinigeri gerçekleştirmek.Yaşam süresi protokolünde, ilk olarak sekiz dişi ve dört erkekten oluşan 20 şişe kurulur, her biri 10 mililitre mısır unu yiyeceği yle doldurulmuş ve 25 santigrat derecede barındırışlar. Dört gün sonra sinekleri atın ve şişeleri kuvöze geri yerleştirin. Dokuzuncu günün öğleden sonra, şişelerden yeni çıkan tüm sinekleri çıkarın ve şişeleri kuvöze geri getirin.16 ila 24 saat sonra, her iki cinsten 250 adet bir günlük yetişkin sinekleri hafif karbondioksit anestezisi altında dört gruba ayırın ve bunları yetişkin orta gıda içeren 250 mililitrelik şişelere aktarın, üçü farklı EDC konsantrasyonları ve biri de sadece EE2 çözücüsüyle tamamlanır. Sinekleri çiftleşmek için 2-3 gün boyunca 25 derecede koruyun. Daha sonra, sineklerin her bir kohortunu sekse göre iki gruba ayırın.Her tedavi koşulu içinde, her iki cins için, rastgele şişe başına 20 bireylerin yoğunluğunda beş paralel şişeler her grup bölmek. Ölü sinek sayısının bir önceki transferden hayatta kalan sinek sayısından çıkarıldığı bir yaşam süresi tablosu hazırlayın, böylece her transferde kurtulanların sayısı otomatik olarak elde edilir. Üç gün sonra, aynı anda ilgili gıda içeren yeni şişeler anestezi olmadan sinek transfer ve ölüm kontrol edin.Sineklerin yaşını ve ölü sinek sayısını kaydedin. Tüm sinekler ölene kadar transferi üç günde bir tekrarlayın. Bu deneyde, yaşam süresi eğrileri her EDC konsantrasyonu ve kontrol için geçen gün karşı kümülatif kurtulan lık olarak çizilmiştir.Kontrol için, hayatta kalma eğrisi nispeten yüksek kaldı uzun bir başlangıç döneminden sonra, yaklaşık 60 gün sonra katlanarak azaldı. EDC maruziyetinin ardından, tedavi edilen sineklerin hayatta kalma eğrisi önemli ölçüde etkilendi ve 36 gün sonra dramatik bir düşüş gösterdi. Bu analiz altında paralel şişeler çok benzer olması gerektiği hakkında tavsiye edilir, aksi takdirde hangi atmak için anlamak zor olacaktır.Bu nedenle, büyük bir örnek boyutu kullanarak, iyi bir deneysel uygulama benimseyerek, büyük bir özen öneririz. Bu protokolleri takiben, seçilen endokrin bozucunun kuşaklar arası etkisini değerlendirmek ve farklı endokrin bozucuların bir kombinasyonunun potansiyel katkı etkilerini test etmek de mümkündür.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Gelişim Biyolojisi

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Meyve Fly Yetiştirme<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Aksenik ve gnotobiyotik Koşullarında

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Drosophila melanogaster Kan-beyin Bariyer Bütünlüğü için Tahse

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larvalarından Canlı Beyin Eksplantlarının Görüntülenmesi

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Yazar Gündemi: Asimetrik Hücre Bölünmesi Dinamiğinin Araştırılması: Drosophila Larva Beyin Eksplantlarının Canlı Görüntülenmesi İçin Bir Protokol 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...