Name: assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2019-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Författarna tackar Dr Beth Gonzalez och Dr Aprajita Garg för stöd vid utförandet av experiment som Invivo fagocytos. En NSF UMD ADVANCE utsäde Grant och UMD NIH T32-utbildningsbidrag, Cell och molekylärbiologi (CMB) och värd-patogen interaktioner (HPI), finansierade detta arbete.

1. Förbered Fluorescein partiklar för injektion
<ol><li>Beredes 10 mg av kommersiellt tillgängliga, värmeavdödade bakterier partiklar märkt med fluorescein (se Tabell för material) till lager koncentrationen 10 mg/mL genom att lägga till 990 µL sterilt 1 x PBS och 10 µL 50 mM natriumazid. Vortex att blanda.<ol>
<li>Dela i engångsbruk 8 µL portioner i 0,2 mL rör och förvara i en mörk låda vid 4 ° C att minimera associerade ljuskänslighet. Obs: Natriumazid konserveringsmedel är valf...

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li><li>Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+host-pathogen+interactions+and+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.">Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).</li><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).</li><li>Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Immunity:+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection.">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).</li><li>De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+and+Imd+pathways+are+the+major+regulators+of+the+immune+response+in+Drosophila.">The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila.</a> EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).</li><li>Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Toll+is+activated+by+Gram-positive+bacteria+through+a+circulating+peptidoglycan+recognition+protein.">Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein.</a> Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).</li><li>Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+a+peptidoglycan+recognition+protein+(PGRP)+in+Relish+activation+and+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila.">Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Science. 296 (5566), 359-362 (2002).</li><li>Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ird1+is+a+Vps15+homologue+important+for+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila.">ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).</li><li>Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsoventral+regulatory+gene+cassette+spatzle/Toll/cactus+controls+the+potent+antifungal+response+in+Drosophila+adults.">The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults.</a> Cell. 86 (6), 973-983 (1996).</li><li>Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+pathway+is+important+for+an+antiviral+response+in+Drosophila.">The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).</li><li>Lemaitre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recessive+mutation,+immune+deficiency+(imd),+defines+two+distinct+control+pathways+in+the+Drosophila+host+defense.">A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).</li><li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection.">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).</li><li>Meister, M., Lagueux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilablood+cells.">Drosophilablood cells.</a> Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).</li><li>Anderson, R. A., Sando, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+human+lysosomal+acid+lipase/cholesteryl+ester+hydrolase.+Similarities+to+gastric+and+lingual+lipases.">Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).</li><li>Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+cytoskeleton+association+with+CR3+and+CR4+regulates+receptor+mobility+and+phagocytosis+of+iC3b-opsonized+erythrocytes.">Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).</li><li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila.">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10, 781-784 (2000).</li><li>Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Scavenger+Receptor+CI+Is+a+Pattern+Recognition+Receptor+for+Bacteria.">Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria.</a> Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).</li><li>Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli.">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li><li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection.">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309, 1251-1253 (2005).</li><li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).</li><li>Stuart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+Staphylococcus+aureus+requires+CD36-mediated+phagocytosis+triggered+by+the+COOH-terminal+cytoplasmic+domain.">Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain.</a> Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).</li><li>Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O&#8217;Farrell, P. H., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+gene+products+required+for+phagocytosis+of+Candida+albicans.">Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).</li><li>Kocks, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eater,+a+transmembrane+protein+mediating+phagocytosis+of+bacterial+pathogens+in+Drosophila.">Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila.</a> Cell. 123 (2), 335-346 (2005).</li><li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+the+cellular+and+humoral+responses+in+the+Drosophila+host+defense+against+three+gram-positive+bacterial+infections.">Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections.</a> PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).</li><li>Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peptidoglycan+recognition+protein+PGRP-SC1a+is+essential+for+Toll+signaling+and+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus+in+Drosophila.">The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).</li><li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus.">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li><li>Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glutamate-dependent+redox+system+in+blood+cells+is+integral+for+phagocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).</li><li>Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Splicing+Factor+RNA-Binding+Fox+Protein+1+Mediates+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).</li><li>Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , (1999).</li><li>Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zuker+collection:+a+resource+for+the+analysis+of+autosomal+gene+function+in+Drosophila+melanogaster.">The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).</li><li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes.">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li><li>Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psidin+is+required+in+Drosophila+blood+cells+for+both+phagocytic+degradation+and+immune+activation+of+the+fat+body.">Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body.</a> Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).</li><li>Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+full-of-bacteria+gene+is+required+for+phagosome+maturation+during+immune+defense+in+Drosophila.">The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).</li></ol>

Kommersiellt tillgängliga, fluorescently märkt partiklar används för att bedöma fagocytos i allmänhet (0.2 µm bildas modifierade mikrosfärer) eller fagocytos av mikrober (fluorescently-märkt värme - eller kemiskt dödade bakterier eller jäst). För att bedöma phagosome mognad, kan forskare välja partiklar märkt med ett pH-känsliga färgämne som fluorescerar när pH sjunker från neutral till sura, som i phagolysosome. Alternativt, för att undersöka de första stegen av fagocytos, patogen er...

Medfödda immunförsvar bildar den första försvarslinjen mot patogena mikrober. Dessa svar kan indelas funktionellt i humorala och cellulära medfödd immunitet, som båda medieras av könsceller-kodat mönster erkännande receptorer (PRRs) som känner av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs)1. Många av signalvägar och effektor mekanismer av den medfödda immuniteten bevaras hos däggdjur och ryggradslösa djur, såsom Nematoden, Caenorhabditis elegans, och bananflugan, Drosophila melanogaster2. Bananflugan har vuxit fram som ett kraftfullt system att studera värd försvar mot smittsamma mikroorganismer3. Drosophila är genetiskt eftertraktansvärda, enkelt och billigt uppfödda i laboratorier, och har en kort generationstid. Dessutom uppvisar bananflugan högeffektiva försvar mot en mängd mikrober, aktivera granskningen av värd immunitet mot virala, bakteriella, svamp eller parasiter patogener.
Drosophila Immunologer har historiskt utnyttjas framåt genetiska skärmar, genome-wide RNA-medierad störningar (RNAi) screening av insekt cellinjer, och redan existerande mutanta flyga stammar för att undersöka medfödd immunitet – leder till den identifiering och karakterisering av flera evolutionärt bevarade humorala immunsystemet vägar4,5,6,7,8. Det humorala medfödda immunsvaret är, utan tvekan, bäst kännetecknas immunförsvar hos bananflugor. Efter infektion leder den humorala Svaren till produktion och systemisk frisättning av antimikrobiell peptid (AMP) molekyler i hemolymph, blod motsvarighet i insekter. Ampere är producerad av mycket Toll och Imd signalering vägar. Den avgiftsbelagda vägen är homolog till däggdjur TLR/IL-1R receptor signalering och Imd stigen är homolog till däggdjur tumörnekrosfaktor-alfa signalering. I Drosophila, Toll signalering framkallas av grampositiva bakterier, svampar och Drosophila X virus6,9,10 och Imd signalering framkallas av Gramnegativa bakterier11 ,12.
Cellulär immunitet, består av inkapsling, melanization och fagocytos av invaderande patogener, som utförs av specialiserade blodkroppar som kallas hemocytes13. Det finns tre klasser av hemocytes i bananfluga: crystal celler, lamellocytes och plasmatocytes13. Crystal celler, som utgör 5% av de cirkulerande hemocytes i larver, släpp proPhenoloxidase (föreslagen) enzymer leder till melanization av patogener och värd vävnader på såret platser. Lamellocytes, som normalt inte finns i friska embryon eller larver, är vidhäftande celler som inkapslar främmande föremål. Dessa celler induceras vid pupariation eller när parasitizing geting ägg deponeras i larver. Fagocytos plasmatocytes, som utgör 95% av cirkulerande hemocytes i larver och alla återstående hemocytes hos vuxna, spela en roll i vävnad remodeling under utveckling och, framför allt, fungera som den huvudsakliga effektor cellen i Drosophila cellulär immunitet.
Fagocytos en omedelbara och avgörande rad medfödda immunförsvaret; mikrober som bryter mot den värd epiteliala barriären är snabbt uppslukat och undanröjas genom fagocytos celler (se referens 14för en omfattande översyn av cellbiologi för fagocytos). Denna process initieras när könsceller-kodade mönsterigenkänning receptorer (PRRs) på hemocytes känner igen patogener associerade molekylära mönster (PAMPs) av mikrober. PRRs bindning till sina mål, och initiera signalering kaskader som leder till bildandet av pseudopods genom aktin cytoskelettet remodeling. Pseudopods omger mikrob, som därefter är uppslukade och internaliserad i en begynnande organell, phagosome. Mikrober förstörs då phagosome genomgår processen av phagosome mognad när phagosome är trafikerad mot inre av hemocyte och försurar genom en rad interaktioner med lysosomer. Vitro och cell har biologi studier i däggdjursceller primär varit instrumental i att identifiera och karaktärisera faktorer som reglerar fagocytos, såsom däggdjur Fc-gamma receptor och C3b receptorer15,16. Möjligheten att köra storskaliga skärmar eller in vivo-studier är dock begränsade däggdjur system.
Här presenterar vi i vivo test för fagocytos i vuxen bananflugor, som bygger på ett förfarande som först introducerades av laboratoriet för David Schneider i 200017. Schneider labbet visade att oskaftade hemocytes klustrade längs buken dorsala fartyget lätt phagocytose polystyren pärlor och bakterier. För att visualisera fagocytos, flugor injiceras med fluorescently märkta partiklar (såsom E. coli märkt med fluorescein Isotiocyanat (E. coli -FITC)), inkuberas i 30 minuter så att hemocytes tid att uppsluka partiklarna, och sedan injiceras med trypan blå, som släcker fluorescensen av partiklar inte fagocyteras under inkubationstiden. Flyga dorsala fartyg är sedan avbildas med en inverterad fluorescerande Mikroskop. Detta nyskapande papper, använder ett relativt enkelt experiment, visat att hemocytes phagocytose bakterier och latex pärlor, den bakteriella fagocytos kan hämmas genom att pre injicera flyger med latex pärlor, och som flyger utan både cellulära och humorala immunsvar är känsliga även för E. coli. Analysen presenteras i denna rapport bygger på arbete av Schneider labbet att kvantifiera Invivo fagocytos genom att mäta fluorescensintensiteten hos partiklar uppslukas av dorsala fartyget associerade hemocytes.
Liknar synsättet i däggdjur system, Drosophila genetiker användes ursprungligen genome-wide in vitro-RNAi-skärmar för att identifiera gener som krävs för den cellulära immunsvar18,19,20 ,21,22,23. Men gjort utvecklingen av vuxen Invivo fagocytos analysen uppföljande experiment skall utföras lätt i hela djur, vilket tillåter forskare att verifiera biologiskt betydelsen av faktorer som identifierats i in vitro-studier. Så var fallet med transmembrana receptorn Eater, som först identifierades som en bakteriell receptor i en RNAi skärm använder S2 celler24 och sedan senare visat att medla Escherichia coli (E. coli),, Enterococcus faecalis, och Staphylococcus aureus (S. aureus) fagocytos i vuxna25.
Vårt labb Anställd Invivo fagocytos analysen i framåt genetiska skärmar och genome-wide associationsstudier (med Drosophila genetiska referens Panel (DGRP)) för att identifiera nya gener som reglerar fagocytos i vuxen hemocytes. Dessa studier ledde till att karakterisera receptorerna PGRP-SC1A och PGRP-SA26, den intracellulära vesikler människohandel protein Rab1427, glutamat transportör Polyfemos28och RNA-bindande protein Fox-129.
Vi räknar med att framtida skärmar införliva den i vivo fagocytos kan leda till identifiering av ytterligare gener som är viktiga för cellulära immunsvaret i Drosophila. Skärmar med fullt sekvenserade inavlade linjer, till exempel DGRP eller Drosophila syntetiska befolkningen resurs (DSPR), kan identifiera naturliga varianter påverkar fagocytos eller hemocyte utveckling. Dessutom kan tekniken antogs i andra arter av Drosophila eller användas till skärmen nya gemenskapens medel, såsom insamling av 250 Drosophila arter upprätthålls av de nationella Drosophila arter lager Center (NDSSC ) på Cornell. Dessa experiment kan utföras med hjälp av fluorescently-märkta bakterie- eller svampinfektioner-wall biopartiklar som finns kommersiellt eller kan utföras med valfritt antal bakterie- eller svampinfektioner arter – förutsatt att mikrob uttrycker fluorescerande markörer .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2&#956;m Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810</td>
			<td>Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5430-10 PicoNozzle Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-10</td>
			<td>Holder for 1.0mm pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E13231</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E23370</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2861</td>
			<td>Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10010</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump PV820</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid &#8211; allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables &#8211; the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms &#8220;TIMED&#8221; mode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23371</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23372</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2851</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-3</td>
			<td>Needles for injection. OD = 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23373</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23374</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2841</td>
			<td>Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay

Alla djur ger medfödd immunitet en omedelbar och robust försvar mot ett brett spektrum av patogener. Humorala och cellulära immunsvaret är de viktigaste grenarna av den medfödda immuniteten, och många av de faktorer som reglerar dessa svar är evolutionärt bevarade mellan ryggradslösa djur och däggdjur. Fagocytos, den centrala komponenten i cellulär medfödd immunitet, utförs av specialiserade celler i immunsystemet. Bananflugan, Drosophila melanogaster, har vuxit fram som en kraftfull genetisk modell att undersöka molekylära mekanismer och fysiologiska effekterna av fagocytos i hela djur. Här visar vi en injektion-baserade Invivo fagocytos analysmetod för att kvantifiera partikel upptag och förstörelse av Drosophila blodkroppar, hemocytes. Förfarandet gör det möjligt för forskare att exakt kontrollera partikel koncentration och DOS, vilket gör det möjligt att få mycket reproducerbara resultat i en kort tid. Experimentet är kvantitativa, lätt att utföra, och kan användas för att skärmen för värd faktorer som påverkan patogen erkännande, upptag och clearance.

Figur 1Avisar en schematisk Invivo fagocytos analysens med fluorescein-märkt partiklar. Flugor är monterade ventrala sida ner på en bit eltejp och de två första segmenten av buken, där dorsala fartyget ligger, är klart synliga (figur 1B). Viktiga källor till experimentella fel uppstår vid injektionen och imaging steg av förfarandet (figur 1 c). Med samma nålen för att injicera flera flugo...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Det här protokollet beskriver ett Invivo fagocytos test i vuxen Drosophila melanogaster att kvantifiera fagocytsystemet erkännande och clearance av mikrobiella infektioner.

Bedömningen av cellulära immunsvaret hos bananflugan, Drosophila melanogaster, använder ett fagocytos i Vivo test

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Denna in vivo fagocytos analys tillåter forskare att utföra genetiska skärmar och genom-omfattande association studier för att identifiera nya gener som reglerar fagocytos i vuxna blodkroppar. Detta experiment är kvantitativt, lätt att utföra, och kan tillämpas på screening av levande djur för värdfaktorer som påverkar patogener erkännande, upptag, och clearance. Efter att ha dragit tunnväggsglaskebalkor med en nåldragare, använd en mikrometer för att hålla nålen under ett mikroskop, och använd nummer fem, finpunkts, rostfri pincetten för att bryta spetsen till en 100-mikrometers spetsdiameter.För att mäta volymen av vätska som kommer att injiceras i varje fluga, ladda en kapillär nål med steril 5%livsmedelsfärg i PBS, och utvisa vätskan på en droppe mineralolja på en 0,01-millimeters steg mikrometer. Dispensera 10 mikroliter av 1,6 milligram per milliliter partiklar på en liten kvadrat av Parafilm, och dra vätskan i nålen. Montera nålen i injektormunstycket, och linje de sövda flugor längs deras utsedda område på flugplattan, ventrala sidan upp, med huvudena orienterade mot framsidan av dynan.Placera injektionsflaskan i motsvarande områden på bänken, och injicera flugorna i övre hörnet av buken med fem, 100-millisekkunder pumpar av vätska för att leverera cirka 10 nanoliter av partiklar totalt. Överför varje fluga i lämplig injektionsflaska som den injiceras, och där man kan däran med tiden på injektionsflaskan. Därefter laddar en ny nål med 0,4%Trypan Blå lösning, och ställ in pneumatiska injektorn till gated, att tillåta ett konstant flöde av luft för att driva vätskan ur nålen.30 minuter efter den första injektionen, injicera varje flug buk med Trypan Blue tills buken är fulla och utspänd. Montera flugorna på mikroskop glider med eltejp, ventrala sidan ner, trycka vingarna till sidan av flugan för att säkra dem till bandet. Tryck sedan försiktigt huvudet in i bandet för att säkerställa att flugan inte kommer att röra sig.Omedelbart efter att alla flugor har säkrats, bild insekterna, en i taget, vid en 25 eller 32 gånger förstoring på en inverterad fluorescens mikroskop fäst vid en digitalkamera och dator, med fokus på dorsala fartyget i varje fluga med hjälp av datorprogramvara för digitalkamera. Sedan, registrera exponeringstiden och förstoring mellan experiment. För att kvantifiera fluorescensen öppnar du ett lämpligt bildhanteringsanalysprogram och öppnar en bild.För att mäta ryggkärls fluorescensintensitet, rita en polygon runt dorsalkärlet och välj Mät för att registrera fluorescensintensen inuti polygonen. För att bestämma bakgrunden fluorescens intensitet, kopiera den första polygonen, och flytta den till ett område intill dorsala fartyget i varje fluga. Välj sedan Mät och spela in fluorescensintensiteten för bakgrundsområdet.För att normalisera dorsalfartyget fluorescens av bakgrunden fluorescens, efter mätning av fluorescensintensiteterna i resten av flugorna, dela upp dorsalkärlet fluorescens av bakgrunden fluorescens, och beräkna den genomsnittliga normaliserade dorsala kärl fluorescens intensiteten av alla flugor i en stam. Efter att ha monterats ventrala sidan ner på en bit eltejp, de två första segmenten av buken, där dorsala fartyget är beläget, är tydligt synliga. Viktiga källor till experimentellt fel uppstår vid insprutnings- och bildtagningsstegen i proceduren.Använda samma nål för att injicera flera flugor kan orsaka att det blir igensatt med fluga vävnad eller partiklar. Flugor som inte får tillräckligt med Trypan Blue fluorescens starkt i hela sin buk, vilket kan minska förhållandet mellan dorsala fartyget till bakgrunden fluorescens, vilket minskar den sanna fluorescens intensitet förhållandet av djuret. Flugor bör fotograferas medan immobiliserade av koldioxid, som aktivt rörliga flugor producerar suddiga bilder som inte kan kvantifieras.En mutant linje från Zuker insamling av etyl metansulfonat-behandlade flugor är oförmögna att fagocytose gramnegativa och grampositiva bakterier och visar nästan inga dorsala kärl fluorescens i in vivo fagocytos analys, paras ihop med isogenic bakgrund Zuker stam och en annan gemensam laboratoriekontroll stam. Håll koll på tiden och i vilken ordning flugor injiceras för att säkerställa att flugor befinner sig i jämförbara stadier av patogenigenkänning och upptag när de avbildas. De molekylära mekanismer som ligger bakom phagocytic defekter kan bestämmas genom att studera enkelhemocyter med confocal microscopy eller efter fluorescens-aktiverat cellsortering eller genom magnetisk pärla isolering av vuxna hemocyter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor flödescytometrisystem Analyser av cellulära immunförsvaret i Rhesus makaker

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

En introduktion till parasitsteklar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Och Antiparasite immunsvar

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Kvantitativ mätning av immunsvaret och sova i<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantifiering av Respirator Burst Response som en indikator för Innate Immune Health i Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersöka effekterna av probiotika på Pneumococcal Colonization Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adherensanalysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Att använda RNA-interferens för att undersöka det medfödda immunsvar i musmakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro Analys av MyD88-medierad cellulärt immunsvar till West Nile-virus mutant stam Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemisk bakterieinfektion och immunförsvar fenotyper i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...