7.8K Views
•
11:39 min
•
June 9th, 2019
DOI :
June 9th, 2019
•0:04
Title
1:18
Cell Culture on Day 1
4:37
Preparation of Reagents and Pre-washing Centrifugal Filter Units
6:17
Cell Culture on Day 2
7:24
Extraction of Metabolites from Cultured Cells and Ultrafiltration of Cell Extracts
8:55
Results: Diamide Treatment
10:42
Conclusion
Transcript
Formålet med denne artikel er at give en detaljeret, trinvis visuel protokol til udvinding af vandige metabolitter fra dyrkede kræftceller til efterfølgende metabolom analyse. Den største fordel ved denne teknik er dens enkelhed og pålidelighed for at udvinde metabolitter fra klæbende celler. Men frem for alt, Det er godt optimeret til metabolom analyse ved hjælp af kapillær elektroforese-massespektrometri eller CEMS.
Metabolomics er en kraftfuld teknik til at identificere biomarkører eller opdage tidlig kræft og forudsige kemoterapi respons på kræftpatienter. Vi bruger kræftceller i denne demonstration. Men, denne teknik kan også anvendes til høst metabolitter fra andre klæbende celler såsom fibroblaster i iPS-celler.
Metabolitkoncentrationerne normaliseres baseret på antallet af levedygtige celler. Så omhyggelig forberedelse af kultur, dette er nøglen til at opnå gode reproducerbare data. Demonstrationen af proceduren vil være Ami Maruyama, en tekniker fra mit laboratorium.
Til at begynde, plade HCC827 og PC-9 celler i 100-millimeter retter, der indeholder 10 milliliter RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtal kvæg serum. Placer retterne i en kuvøse på 5% kuldioxid og 37 grader Celsius i 24 timer til kultur. Efter inkubationen vippes forsigtigt de 100 millimeter kulturretter for at aspirere cellekulturmediet.
Cellerne vaskes på hver skål ved hjælp af to milliliter fosfat-bufferet saltvandsopløsning uden calcium og magnesium. Sten forsigtigt hver skål, så PBS-opløsningen helt dækker skålens overflade, og vip derefter skålene for at aspirere vaskebufferen. Varm 0,25% trypsin-EDTA løsning til 37 grader Celsius.
Med en fem-milliliter serologisk pipette, tilsæt to milliliter af den opvarmede trypsin-EDTA opløsning til hver skål. Sten forsigtigt hver skål, så trypsin helt dækker overfladen af skålen. Inkuber kulturretterne ved 37 grader Celsius i cirka fem minutter.
Derefter tilsættes fire milliliter af det forvarmte komplette vækstmedium til hver skål. Og forsigtigt pipette flere gange for at re-suspendere cellerne i medium. Hver cellesuspension overføres til et separat konisk rør med 15 milliliter.
Centrifuge ved 800 gange g i fem minutter. Kassér supernatanten og re-suspension hver celle pellet i to milliliter af den forvarmte komplette vækstmedium. Bland 10 mikroliter af cellesuspensionen med 10 mikroliter 0,4% trypanblå opløsning, i en 1,5-milliliter mikrorør.
Læg 10 mikroliter af blandingen i en celletælling kammer glide gennem kapillær handling. Indsæt kammerdiaset i den automatiserede celletæller, og tryk på hentningsknappen for at tage billedet og vise resultaterne af cellernes samlede antal og procente levedygtighed. Hvis det samlede celletal er over 0,5 millioner celler pr. milliliter, tilsættes yderligere vækstmedium til det koniske rør på 15 milliliter for at opnå den ønskede cellekoncentration.
Nu tilføje to til fem milliliter af kulturen til hver 100-millimeter celle kultur parabol til frø ca. en til 2 1/2 million celler pr skål. Inkuber kulturretterne i 5% kuldioxid ved 37 grader Celsius i 18 timer. Først fortyndes en kommerciel intern standardopløsning, der indeholder L-Methionin sulfone og D-Kamfer-10-sulfasyre 1.000 gange i ultrarent vand, i en 15 milliliter volumetrisk kolbe.
Opløsning mannitol i ultrarent vand for at forberede en 0,05 gram pr. milliliter mannitolopløsning i ultrarent vand som vaskebuffer. Derefter i filterkoppen for hver centrifugalfilterenhed, pipette 250 mikroliter ultrarent vand. Cap filterenhederne stramt, og centrifuge ved 9, 100 gange g ved fire grader Celsius i fem minutter.
Kontroller lydstyrken for hvert filtrat. Hvis der er akkumuleret et betydeligt filtrat under det første korte spin, kan filterenheden være defekt. Kassér filterenheden, og brug i stedet en ny filterenhed.
Luk låget af filterenhederne stramt og centrifuge igen ved 9, 100 gange g ved fire grader Celsius i 30 minutter. Sørg for, at der ikke er ultrarent vand tilbage i nogen af filterkopperne, og fjern det filtrerede ultrarent vand i hvert opsamlingsrør med en pipette. Sæt filterkopperne tilbage i deres opsamlingsrør, og brug centrifugalfilterenhederne inden for en time for at undgå skader ved tørring.
Tag de 100 millimeter kulturretter ud af kuvøsen og inspirer cellekulturmediet fra hver skål. Tilsæt 10 milliliter PBS kulturmedium med eller uden 250 mikromolardiamid til hver skål, idet der skal passes på ikke at forstyrre cellelaget. Inkuber kulturretterne ved 37 grader Celsius i 30 minutter.
Efter inkubation, aspirere cellekultur medium fra hver 100-millimeter kultur parabol. Let vippe skålen, og forsigtigt tilføje to milliliter 5% mannitol vask buffer til kanten af hver skål til at vaske cellerne, passe på ikke at forstyrre cellelaget. Aspirer vaskebufferen fra hver kulturskål, og vask cellerne igen ved at vippe skålen en smule og forsigtigt tilføje 10 milliliter vaskebuffer pr. skål.
Derefter helt aspirere vaskebufferen fra kanten af hver kulturskål. Nu tilføje 800 mikroliter af 99,7% methanol pr kultur parabol, og forsigtigt rock hver kultur parabol frem og tilbage, for at dække hele sin overflade. Lad opvasken blive ved stuetemperatur i 30 sekunder.
Tilsæt langsomt 550 mikroliter af den fortyndede interne standardopløsning pr. skål ved at nedsænke spidsen af pipetten i methanolen og forsigtigt pipettere op og ned flere gange. Sten forsigtigt hver kulturskål frem og tilbage for at dække hele overfladen, og lad retterne være ved stuetemperatur i 30 sekunder. Derefter overføres den ekstraherede opløsning fra hver kulturskål til et separat 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.
Centrifuge rørene ved 2, 300 gange g ved fire grader Celsius i fem minutter. Overfør 700 mikroliter af hver supernatant i to centrifugalfilterenheder med 350 mikroliter pr. enhed. Centrifuge filterrørene ved 9, 100 gange g ved fire grader Celsius i ca. to timer, indtil der ikke er væske tilbage i filterkopperne.
Fjern filterkopperne, og luk låget på opsamlingsrørene tæt. I denne undersøgelse voksede HCC827 og PC-9 celler ligeligt i tre timer. CEMS-analyse indikerer forskellen mellem diamidbehandlede celler og PBS-behandlede celler for begge cellelinjer.
Blandt disse var flere mellemprodukter i pentosephosphatvejen og i øvre glykolyse signifikant højere i de diamidbehandlede forhold, mens nogle få tricarboxylcyklus mellemliggende var lavere i de behandlede forhold. Metabolomprofiler af intracellulære metabolitter afslørede henholdsvis 175 og 150 differentialmetabolitter i HCC827- og PC-9-celler. Efter diamid behandling, niveauet af gluconinsyre og oxideret glukose steg 12 gange i HCC827 celler og 10-fold i PC-9 celler.
Tilsvarende steg niveauet af glucose 6-fosfat, en fosfosyleret glukose i det første hexokinase-katalyserede glykolyseprodukt, også 6,3- og 3,5 gange i henholdsvis HCC827 og PC-9. Desuden steg niveauerne af 6-fosfogluconat, det første mellemprodukt i pentosephosphatvejen, dramatisk 89 gange i HCC827-celler og 231 gange i PC-9 celler. I modsætning hertil har niveauet af andre glykolytiske mellemprodukter såsom fruktose 6-fosfat ikke ændret sig i den diamid eksperimentelle tilstand.
Det samlede indhold af nicotinamid adenin dinucleotidphosphat var næsten ækvivalente mellem diamidbehandling og PBS-kontrolbetingelser. Brug af 5% mannitolopløsning, bortset fra PBS, som vaskebuffer til vask af celler er meget vigtig for CEMS-analyse, fordi saltbaserede buffere forstyrrer analysen og påvirker målingen negativt. Denne protokol er uegnet til udvinding af hydrofobe metabolitter som lipider, så vi er nødt til at udvikle en protokol for bekvemt at udvinde både hydrofile og hydrofobe metabolitter til mere omfattende metabolomanalyse.
Denne teknik indser en nem udvinding af metabolitter fra næsten alle tilholdsstoffer celler, og dermed gælder for en bred vifte af forskning såsom kræft, stamceller, farmakologi, ernæring, og kosmetisk videnskab.
Formålet med denne artikel er at beskrive en protokol til ekstraktion af vandige metabolitter fra kultiverede vedlige celler til metabolomic analyse, især, kapillar elektroforese-massespektrometri.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved