7.8K Views
•
11:39 min
•
June 9th, 2019
DOI :
June 9th, 2019
•0:04
Title
1:18
Cell Culture on Day 1
4:37
Preparation of Reagents and Pre-washing Centrifugal Filter Units
6:17
Cell Culture on Day 2
7:24
Extraction of Metabolites from Cultured Cells and Ultrafiltration of Cell Extracts
8:55
Results: Diamide Treatment
10:42
Conclusion
Transcript
Het doel van dit artikel is om een gedetailleerd, stapsgewijs visueel protocol te bieden voor het extraheren van waterige metabolieten uit gekweekte kankercellen voor latere metabokoomanalyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud en betrouwbaarheid voor het extraheren van metabolieten uit aanhangende cellen. Maar bovenal is het goed geoptimaliseerd voor metabolome-analyse met capillaire elektroforese-massaspectrometrie of CEMS.
Metabolomics is een krachtige techniek om biomarkers te identificeren of het detecteren van kanker in een vroeg stadium en het voorspellen van de respons op kankerpatiënten. We gebruiken kankercellen in deze demonstratie. Deze techniek kan echter ook worden toegepast om metabolieten te oogsten uit andere aanhangende cellen, zoals fibroblasten in iPS-cellen.
Metabolietconcentraties worden genormaliseerd op basis van het aantal levensvatbare cellen. Dus zorgvuldige voorbereiding van de cultuur, dit is de sleutel voor het verkrijgen van goede reproduceerbare gegevens. Het aantonen van de procedure zal Ami Maruyama zijn, een technicus van mijn laboratorium.
Om te beginnen, plaat HCC827 en PC-9 cellen in 100-millimeter schotels met 10 milliliter RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetale runderserum. Plaats de gerechten in een couveuse op 5% kooldioxide en 37 graden Celsius gedurende 24 uur naar cultuur. Na incubatie, voorzichtig kantelen de 100-millimeter cultuur gerechten om de cel cultuur media aan te sporen.
Was cellen op elke schotel met behulp van twee milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium. Wieg elk gerecht voorzichtig zodat de PBS-oplossing het oppervlak van de schotel volledig bedekt en kantel vervolgens de afwasbuffer. Warme 0,25% trypsin-EDTA oplossing tot 37 graden Celsius.
Voeg met een serologische pipet van vijf milliliter twee milliliter van de opgewarmde trypsine-EDTA-oplossing toe aan elke schotel. Wieg elk gerecht voorzichtig zodat de trypsine het oppervlak van de schotel volledig bedekt. Broed de cultuurgerechten op 37 graden Celsius gedurende ongeveer vijf minuten.
Voeg vervolgens vier milliliter van het voorverwarmde complete groeimedium toe aan elk gerecht. En voorzichtig pipette meerdere malen om opnieuw op te schorten de cellen in medium. Breng elke celsuspensie over naar een aparte conische buis van 15 milliliter.
Centrifuge op 800 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang elke celpellet opnieuw op in twee milliliter van het voorverwarmde volledige groeimedium. Meng 10 microliter van de celsuspensie met 10 microliter van 0,4%trypan blauwe oplossing, in een 1,5-milliliter microtube.
Laad 10 microliter van het mengsel in een celtelkamer die door capillaire werking wordt geschutijd. Plaats de dia van de kamer in de geautomatiseerde celteller en druk op de opnameknop om de afbeelding vast te leggen en de resultaten van het totale aantal en de levensvatbaarheid van de cellen weer te geven. Als het totale celaantal meer dan 0,5 miljoen cellen per milliliter is, voeg dan verder groeimedium toe aan de 15-milliliter conische buis om de gewenste celconcentratie te verkrijgen.
Nu, voeg twee tot vijf milliliter van de cultuur toe aan elke 100-millimeter celkweekschotel om ongeveer één tot 2 1/2 miljoen cellen per schotel te zaaien. Incubeer de cultuurgerechten in 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius gedurende 18 uur. Verdun eerst in een maatkolf van 15 milliliter een commerciële interne standaardoplossing met L-Methionine sulfone en D-Camphor-10-sulfonic acid 1,000-voudig in ultrazuiver water.
Los mannitol op in ultrazuiver water om een 0,05 gram per milliliter mannitoloplossing in ultrazuiver water als wasbuffer voor te bereiden. Vervolgens, in de filter beker van elke centrifugaal filter eenheid, pipet 250 microliters van ultrazuiver water. Dop de filtereenheden stevig vast en vercentrifuge vijf minuten op 9, 100 keer g bij vier graden Celsius.
Controleer het volume van elk filtraat. Als er tijdens de eerste korte spin een aanzienlijk filtraat is opgelopen, kan de filterunit defect zijn. Gooi de filtereenheid weg en gebruik in plaats daarvan een nieuwe filtereenheid.
Sluit de deksels van de filterunits stevig en centrifuge opnieuw bij 9, 100 keer g bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Zorg ervoor dat er geen ultrazuiver water in een van de filterbekers achterblijft en verwijder het gefilterde ultrazuivere water in elke opvangbuis met een pipet. Plaats de filterbekers terug in hun opvangbuizen en gebruik de centrifugaalfilterunits binnen een uur om schade bij het drogen te voorkomen.
Haal de 100-millimeter cultuurgerechten uit de couveuse en aspirate de cel cultuur medium uit elk gerecht. Voeg 10 milliliter PBS-kweekmedium toe met of zonder 250 micromolardiamide aan elk gerecht, waarbij u ervoor zorgt dat de cellaag niet wordt verstoord. Broed de cultuurgerechten op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.
Na incubatie, aspirate de cel cultuur medium van elke 100-millimeter cultuur schotel. Lichtjes kantelen van de schotel, en voeg voorzichtig twee milliliter van 5% mannitol wassen buffer aan de rand van elke schotel om de cellen te wassen, oppassen niet aan de cellaag verstoren. Aspirate de wasbuffer van elke cultuur schotel, en was de cellen weer door iets kantelen van de schotel en voorzichtig toe te voegen 10 milliliter wasbuffer per schotel.
Dan, volledig aspirate de wasbuffer van de rand van elke cultuurschotel. Voeg nu 800 microliters van 99,7% methanol per kweekgerecht toe en rock elk kweekgerecht zachtjes heen en weer, om het hele oppervlak te bedekken. Laat de gerechten 30 seconden op kamertemperatuur.
Voeg langzaam 550 microliter van de verdunde interne standaardoplossing per schotel toe door de punt van de pipet in de methanol onder te dompelen en voorzichtig op en neer te pipetten, meerdere malen. Wieg zachtjes elk kweekgerecht heen en weer om het hele oppervlak te bedekken en laat de gerechten 30 seconden op kamertemperatuur. Breng vervolgens de geëxtraheerde oplossing uit elke kweekschaal over naar een aparte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.
Centrifugeren de buizen op 2, 300 keer g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Breng 700 microliter van elk supernatant over in twee centrifugale filtereenheden, met 350 microliter per eenheid. Centrifugeren de filterbuizen op 9, 100 keer g bij vier graden Celsius gedurende ongeveer twee uur, totdat er geen vloeistof in de filterbekers blijft.
Verwijder de filterbekers en sluit de deksels van de opvangbuizen stevig dicht. In deze studie groeiden HCC827- en PC-9 cellen gedurende drie uur gelijk. CEMS-analyse geeft het verschil aan tussen met diamide behandelde cellen en met PBS behandelde cellen voor beide cellijnen.
Onder deze, verschillende tussenproducten in de pentose fosfaat route en in de bovenste glycolyse waren aanzienlijk hoger in de diamide-behandelde omstandigheden, terwijl een paar tricarboxylische cyclus tussenproducten lager waren in de behandelde omstandigheden. Metabolome profielen van intracellulaire metabolieten bleek 175 en 150 differentiële metabolieten in HCC827 en PC-9 cellen, respectievelijk. Na diamide behandeling, het niveau van gluconisch zuur en geoxideerde glucose steeg 12-voudig in HCC827 cellen en 10-voudig in PC-9 cellen.
Ook het glucosegehalte van 6-fosfaat, een fosforyleerde glucose in het eerste hexokinase-gekatalyseerde glycolyseproduct, steeg eveneens met respectievelijk 6,3 en 3,5 keer in HCC827- en PC-9-cellen. Bovendien zijn de niveaus van 6-fosfosfroetaat, de eerste tussenpersoon in de pentose fosfaatroute, drastisch toegenomen 89-voudig in HCC827 cellen en 231-voudig in PC-9 cellen. Daarentegen veranderden de niveaus van andere glycolytische tussenproducten zoals fructose 6-fosfaat niet in de experimentele toestand van diamide.
De totale fosfaatgehalten van adenine dinucleotidegehalten van nicotinamide adenine waren bijna gelijkwaardig tussen diamidebehandeling en PBS-controleomstandigheden. Het gebruik van 5%mannitol oplossing, andere dan PBS, als wasbuffer voor wascellen is zeer belangrijk voor CEMS-analyse, omdat zoutgebaseerde buffers interfereren met de analyse en de meting negatief beïnvloeden. Dit protocol is ongeschikt voor het extraheren van hydrofobe metabolieten zoals lipiden, dus we moeten een protocol ontwikkelen voor het gemakkelijk extraheren van zowel hydrofiele als hydrofobe metabolieten voor een uitgebreidere metabokoomanalyse.
Deze techniek realiseert een gemakkelijke extractie van metabolieten uit bijna elke aanhangende cellen, en is dus van toepassing op een verscheidenheid aan onderzoek, zoals kanker, stamcellen, farmacologie, voeding en cosmetische wetenschap.
Het doel van dit artikel is een protocol voor extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor metabolomic analyse, in het bijzonder, capillaire elektroforese-massaspectrometrie te beschrijven.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved