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June 9th, 2019
DOI :
June 9th, 2019
•0:04
Title
1:18
Cell Culture on Day 1
4:37
Preparation of Reagents and Pre-washing Centrifugal Filter Units
6:17
Cell Culture on Day 2
7:24
Extraction of Metabolites from Cultured Cells and Ultrafiltration of Cell Extracts
8:55
Results: Diamide Treatment
10:42
Conclusion
Transcript
इस लेख का उद्देश्य बाद के मेटाबोलोम विश्लेषण के लिए सुसंस्कृत कैंसर कोशिकाओं से जलीय मेटाबोलाइट्स निकालने के लिए एक विस्तृत, सौतेली दृश्य प्रोटोकॉल प्रदान करना है। इस तकनीक का मुख्य लाभ अनुयायी कोशिकाओं से मेटाबोलाइट्स निकालने के लिए इसकी सादगी और विश्वसनीयता है। लेकिन सबसे बढ़कर, यह केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस-मास स्पेक्ट्रोमेट्री या सीईएमएस का उपयोग करके मेटाबोलोम विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है।
मेटाबोलोमिक्स बायोमार्कर की पहचान करने या प्रारंभिक चरण के कैंसर का पता लगाने और कैंसर रोगियों के लिए कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। हम इस प्रदर्शन में कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करते हैं। हालांकि, इस तकनीक को आईपीएस कोशिकाओं में फाइब्रोब्लास्ट जैसी अन्य अनुयायी कोशिकाओं से फसल मेटाबोलाइट्स पर भी लागू किया जा सकता है।
मेटाबोलाइट सांद्रता व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के आधार पर सामान्यीकृत कर रहे हैं। संस्कृति की इतनी सावधानीपूर्वक तैयारी, यह अच्छा प्रजनन योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रक्रिया का प्रदर्शन अमी मारुयामा, मेरी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा ।
शुरू करने के लिए, प्लेट HCC827 और पीसी-9 कोशिकाओं में १०० मिलीमीटर आरएमएमआई के 10 मिलीलीटर युक्त-१६४० मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक । व्यंजनों को 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर एक इनक्यूबेटर में रखें और संस्कृति के लिए 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस रखें। इनक्यूबेशन के बाद, धीरे से १०० मिलीमीटर संस्कृति व्यंजन झुकाव सेल संस्कृति मीडिया आकांक्षी ।
कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना फॉस्फेट-बफर नमकीन समाधान के दो मिलीलीटर का उपयोग करके प्रत्येक डिश पर कोशिकाओं को धोएं। धीरे-धीरे प्रत्येक पकवान को रॉक करें ताकि पीबीएस समाधान पूरी तरह से पकवान की सतह को कवर करे, फिर धोने के बफर को एस्पिरेट करने के लिए व्यंजनों को झुकाएं। गर्म 0.25% ट्राइप्सिन-EDTA समाधान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए।
पांच मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ, प्रत्येक डिश में गर्म ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान के दो मिलीलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे प्रत्येक पकवान को रॉक करें ताकि ट्राइप्सिन पूरी तरह से पकवान की सतह को कवर करे। लगभग पांच मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति व्यंजनों इनक्यूबेट ।
फिर, प्रत्येक पकवान में पूर्व-गर्म पूर्ण विकास माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें। और धीरे-धीरे माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए कई बार पिपेट करें। प्रत्येक कोशिका निलंबन को एक अलग 15-मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें।
पांच मिनट के लिए 800 बार जी पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्यागें और प्रत्येक सेल पेलेट को पूर्व-गर्म पूर्ण विकास माध्यम के दो मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें। 1.5 मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में 0.4% ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन के 10 माइक्रोलीटर के साथ सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोलीटर मिलाएं।
केशिका कार्रवाई के माध्यम से एक सेल गिनती कक्ष स्लाइड में मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर लोड करें। स्वचालित सेल काउंटर में चैंबर स्लाइड डालें और छवि पर कब्जा करने के लिए कैप्चर बटन दबाएं और कोशिकाओं की कुल संख्या और प्रतिशत व्यवहार्यता के परिणामों को प्रदर्शित करें। यदि कुल सेल संख्या प्रति मिलीलीटर 0.5 मिलियन कोशिकाओं से ऊपर है, तो वांछित कोशिका एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 15-मिलीलीटर शंकु नली में आगे विकास माध्यम जोड़ें।
अब, प्रत्येक १०० मिलीमीटर सेल संस्कृति पकवान के लिए संस्कृति के दो से पांच मिलीलीटर जोड़ने के लिए लगभग एक से 2 1/2 लाख कोशिकाओं प्रति पकवान बीज । 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड में संस्कृति व्यंजनों को इनक्यूबेट करें। सबसे पहले, 15-मिलीलीटर वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में, एक वाणिज्यिक आंतरिक मानक समाधान को पतला करें जिसमें एल-मेथियोनीन सल्फोन और डी-कपूर-10-सल्फोनिक एसिड 1, 000-गुना अल्ट्रापुरे पानी में शामिल हैं।
अल्ट्रापुरे पानी में मैनिटोल को भंग करें ताकि वॉश बफर के रूप में अल्ट्रापुरे पानी में 0.05 ग्राम प्रति मिलीलीटर मैनिटोल घोल तैयार किया जा सके। फिर, प्रत्येक अपकेंद्रित्र फिल्टर इकाई के फिल्टर कप में, अल्ट्रापुरे पानी के 250 माइक्रोलीटर पिपेट करें। फिल्टर इकाइयों को कसकर कैप करें, और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 9, 100 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें।
प्रत्येक फिलट्रेट की मात्रा की जांच करें। यदि पहले शॉर्ट स्पिन के दौरान महत्वपूर्ण फिल्ट्रेट जमा हो गया है, तो फिल्टर यूनिट खराब हो सकती है। फिल्टर यूनिट को त्यागें और इसके बजाय एक नई फ़िल्टर यूनिट का उपयोग करें।
फिल्टर इकाइयों के ढक्कन कसकर बंद करें और 30 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 9, १०० बार जी पर फिर से अपकेंद्रित्र । सुनिश्चित करें कि किसी भी फिल्टर कप में कोई अल्ट्रापुरे पानी न रहे, और प्रत्येक संग्रह ट्यूब में फ़िल्टर किए गए अल्ट्रापुरे पानी को पिपेट के साथ हटा दें। फिल्टर कप को वापस अपने संग्रह ट्यूबों में रखें, और सूखने पर नुकसान से बचने के लिए एक घंटे के भीतर अपकेंद्रित्र फिल्टर इकाइयों का उपयोग करें।
इनक्यूबेटर से 100 मिलीमीटर संस्कृति व्यंजन बाहर ले लो और प्रत्येक पकवान से सेल संस्कृति माध्यम aspirate। प्रत्येक डिश में 250 माइक्रोमोलर डायमाइड के साथ या बिना पीबीएस कल्चर मीडियम के 10 मिलीलीटर जोड़ें, जिससे सेल लेयर को परेशान न किया जा सके। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति व्यंजनों को इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक 100 मिलीमीटर संस्कृति पकवान से सेल संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें। डिश को थोड़ा झुकाएं, और धीरे-धीरे कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक डिश के किनारे पर 5% मैनिटोल वॉश बफर के दो मिलीलीटर जोड़ें, जिससे सेल लेयर को परेशान न किया जा सके। प्रत्येक संस्कृति पकवान से धोने बफर आकांक्षी, और थोड़ा पकवान झुकाव और धीरे प्रति पकवान धोने बफर के 10 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को फिर से धोने ।
फिर, प्रत्येक संस्कृति पकवान के किनारे से वॉश बफर को पूरी तरह से एस्पिरेट करें। अब, संस्कृति पकवान प्रति 99.7% मेथनॉल के 800 माइक्रोलीटर जोड़ें, और धीरे से अपनी पूरी सतह को कवर करने के लिए, आगे और पीछे प्रत्येक संस्कृति पकवान रॉक। 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर व्यंजन छोड़ दें।
धीरे-धीरे मेथनॉल में पिपेट की नोक को विसर्जित करके प्रति डिश पतला आंतरिक मानक समाधान के 550 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे-धीरे कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करें। धीरे-धीरे अपनी पूरी सतह को कवर करने के लिए प्रत्येक संस्कृति पकवान को आगे और पीछे रॉक करें, और 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर व्यंजन छोड़ दें। फिर, प्रत्येक संस्कृति डिश से निकाले गए समाधान को एक अलग 1.5-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 2, ३०० बार जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र । प्रत्येक सुपरनेट के 700 माइक्रोलीटर को दो सेंट्रलीफ्यूगल फिल्टर इकाइयों में स्थानांतरित करें, जिसमें 350 माइक्रोलीटर प्रति यूनिट हैं। लगभग दो घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 9, १०० बार जी पर फिल्टर ट्यूबों अपकेंद्रित्र, जब तक कोई तरल फिल्टर कप में रहता है ।
फिल्टर कप निकालें, और संग्रह ट्यूबों के ढक्कन कसकर बंद करें। इस अध्ययन में एचसीसी827 और पीसी-9 कोशिकाओं में तीन घंटे तक समान रूप से वृद्धि हुई। सीईएमएस विश्लेषण दोनों सेल लाइनों के लिए डायमाइड-उपचारित कोशिकाओं और पीबीएस-उपचारित कोशिकाओं के बीच अंतर को इंगित करता है।
इनमें से, पेंटोज फॉस्फेट मार्ग में और ऊपरी ग्लाइकोलिसिस में कई मध्यवर्ती डायमाइड-उपचारित स्थितियों में काफी अधिक थे, जबकि कुछ ट्राइकार्बोक्सिलिक चक्र मध्यवर्ती उपचारित स्थितियों में कम थे। इंट्रासेलुलर मेटाबोलाइट्स के मेटाबोलोम प्रोफाइल ने क्रमशः एचसीसी827 और पीसी-9 कोशिकाओं में 175 और 150 अंतर मेटाबोलाइट्स का खुलासा किया। डायमाइड उपचार के बाद, ग्लूकोनिक एसिड और ऑक्सीकृत ग्लूकोज का स्तर एचसीसी827 कोशिकाओं में 12 गुना और पीसी-9 कोशिकाओं में 10 गुना बढ़ गया।
इसी तरह, ग्लूकोज 6-फॉस्फेट, पहले हेक्सोकिनेस-उत्प्रेरक ग्लाइटोलिस उत्पाद में फॉस्फोरीलेटेड ग्लूकोज का स्तर भी क्रमशः एचसीसी827 और पीसी-9 कोशिकाओं में 6.3-और 3.5 गुना बढ़ गया। इसके अलावा, 6-फॉस्फोग्लूकोनेट का स्तर, पेंटोज फॉस्फेट पाथवे में पहला इंटरमीडिएट, नाटकीय रूप से एचसीसी827 कोशिकाओं में 89 गुना और पीसी-9 कोशिकाओं में 231 गुना बढ़ गया। इसके विपरीत, फ्रक्टोज 6-फॉस्फेट जैसे अन्य ग्लाइकोलिटिक इंटरमीडिएट के स्तर में डायमाइड प्रायोगिक स्थिति में परिवर्तन नहीं हुआ।
कुल निकोटिनामाइड एडेनाइन डाइन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट का स्तर डायमाइड उपचार और पीबीएस नियंत्रण स्थितियों के बीच लगभग बराबर था। पीबीएस के अलावा 5% मैनिटॉल समाधान का उपयोग करना, धोने की कोशिकाओं के लिए वॉश बफर के रूप में सीईएमएस विश्लेषण के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि नमक आधारित बफ़र्स विश्लेषण में हस्तक्षेप करते हैं और माप को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करते हैं। यह प्रोटोकॉल लिपिड जैसे हाइड्रोफोबिक मेटाबोलाइट्स निकालने के लिए अनुपयुक्त है, इसलिए हमें अधिक व्यापक मेटाबोलोम विश्लेषण के लिए हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक मेटाबोलाइट्स दोनों को आसानी से निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने की आवश्यकता है।
इस तकनीक को लगभग किसी भी अनुयायी कोशिकाओं से मेटाबोलाइट्स की एक आसान निकासी का एहसास होता है, और इस प्रकार, कैंसर, स्टेम सेल, फार्माकोलॉजी, पोषण और कॉस्मेटिक विज्ञान जैसे विभिन्न शोधों के लिए लागू होता है।
इस अनुच्छेद के उद्देश्य के लिए metabolomic विश्लेषण, विशेष रूप से, केशिका electrophoresis-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए सुसंस्कृत आसंजन कोशिकाओं से जलीय चयापचयों के निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है ।
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