本稿の目的は、培養癌細胞から後続のメタボロメ分析のために水性代謝物を抽出するための詳細な段階的な視覚プロトコルを提供することです。この技術の主な利点は、接着細胞から代謝産物を抽出するためのそのシンプルさと信頼性です。しかし、何よりも、毛細管電気泳動質量分析またはCEMSを用いたメタボロム解析に最適です。
メタボロミクスは、バイオマーカーを同定したり、早期がんを検出したり、がん患者に対する化学療法応答を予測したりする強力な技術です。このデモンストレーションでは、がん細胞を用います。しかし、この技術は、iPS細胞における線維芽細胞などの他の付着細胞からの代謝産物の収穫にも適用することができる。
代謝産物濃度は、生存細胞の数に基づいて正規化される。文化の慎重な準備は、これは良い再現性のデータを得るための鍵です。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者である丸山亜美です。
まず、10%の胎児ウシ血清を添加したRPMI-1640培地の10ミリリットルを含む100ミリメートルの皿にHCC827およびPC-9細胞をプレート。培養器に食器を5%の二酸化炭素、37度で24時間培養します。インキュベーション後、100ミリメートルの培養皿を軽く傾けて細胞培養培地を吸引する。
カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水を2ミリリットル使用して、各皿の細胞を洗浄します。PBS溶液が皿の表面を完全に覆うように各皿を穏やかに揺らし、皿を傾けて洗浄バッファーを吸引します。摂氏37度に0.25%トリプシン-EDTA溶液を温めます。
5ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、各皿に温めたトリプシン-EDTA溶液を2ミリリットル加えます。トリプシンが皿の表面を完全に覆い、各皿をそっと揺らします。約5分間摂氏37度で培養します。
その後、各皿に事前に温めた完全な成長培地の4ミリリットルを加えます。そして、ミディアム内の細胞を再中断するために数回穏やかにピペット。各細胞懸濁液を別の15ミリリットルの円錐管に移します。
800回gで5分間遠心分離機。上清を捨て、各細胞ペレットを温め込んだ完全成長培地の2ミリリットルで再中断する。セル懸濁液10マイクロリットルを0.4%トリパンブルー溶液の10マイクロリットルと1.5ミリリットルのマイクロチューブに混ぜます。
毛細管作用を通して細胞の計数チャンバーのスライドに混合物の10マイクロリットルをロードします。自動セルカウンターにチャンバースライドを挿入し、キャプチャボタンを押して画像をキャプチャし、セルの総数と生存率の割合の結果を表示します。総細胞数が1ミリリットル当たり0.5百万個を超える場合は、さらに増殖培地を15ミリリットルの円錐管に加えて、所望の細胞濃度を得る。
次に、1皿あたり約1〜21/200万個の細胞を播種するために、各100ミリメートルの細胞培養皿に2〜5ミリリットルの培養液を加えます。37°Cで5%の二酸化炭素で18時間培養します。まず、15ミリリットルの体積フラスコで、L-メチオニンスルホンとD-Camphor-10-スルホン酸を含む市販の内部標準液を超純水で1,000倍に希釈する。
超純水にマンニトールを溶解し、洗浄バッファーとして超純水にミリリットルマンニトール溶液あたり0.05グラムを調製します。次いで、各遠心フィルター部のフィルターカップに、ピペット250マイクロリットルの超純水を入れます。フィルターユニットをしっかりとキャップし、遠心分離機を9、摂氏4度で100倍に5分間キャップします。
各濾液の体積を確認してください。最初の短いスピンの間に有意な濾液が蓄積した場合、フィルターユニットに欠陥がある可能性があります。フィルタユニットを破棄し、代わりに新しいフィルタユニットを使用します。
フィルターユニットの蓋をしっかりと閉じ、遠心分離機を9、摂氏4度で100回30分間閉じます。フィルターカップに超純水が残らないようにし、各採取管の濾過された超純水をピペットで取り除きます。フィルターカップを回収チューブに戻し、1時間以内に遠心フィルターユニットを使用して乾燥時の損傷を防ぐ。
100ミリメートルの培養皿をインキュベーターから取り出し、各皿から細胞培養培地を吸引する。各皿に250マイクロモルジアミドの有無にかかわらずPBS培地10ミリリットルを加え、細胞層を乱さないよう注意する。37°Cで30分間培養料理をインキュベートします。
インキュベーション後、各100ミリメートル培養皿から細胞培養培地を吸引する。皿を少し傾け、穏やかに5%マンニトール洗浄バッファーの2ミリリットルを各皿の端に加えて細胞を洗浄し、細胞層を乱さないのに注意します。各培養皿から洗浄バッファーを吸引し、皿を少し傾け、1皿あたり10ミリリットルの洗浄バッファーを軽く加えて細胞を再び洗浄する。
次いで、各培養皿の端から洗浄バッファーを完全に吸引する。今、培養皿ごとに99.7%メタノールの800マイクロリットルを追加し、その表面全体をカバーするために、各培養皿を前後に穏やかに揺らします。食器を室温で30秒間放置します。
ピペットの先端をメタノールに浸し、数回ゆっくりと上下にピペットを入れ、1皿あたり希釈した内部標準溶液の550マイクロリットルをゆっくりと加えます。各文化料理を前後にそっと揺らし、表面全体を覆い、室温で30秒間放置します。次いで、各培養皿から抽出した溶液を別の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移す。
チューブを摂氏4度で2、300倍に5分間遠心する。各上清の700マイクロリットルを2つの遠心フィルターユニットに移し、単位あたり350マイクロリットルで。フィルターカップに液体が残らなくなるまで、約2時間、摂氏4度で100回gの9、100回のフィルターチューブを遠心します。
フィルターカップを取り外し、コレクションチューブの蓋をしっかりと閉じます。本研究では、HCC827細胞とPC-9細胞は3時間等に成長した。CEMS分析は、両方の細胞株のジアミド処理細胞とPBS処理細胞の差を示す。
これらの中で、ペントースリン酸経路および上糖分解におけるいくつかの中間体は、ジアミド処理条件において有意に高かったが、一方、いくつかの三カルボン酸サイクル中間体は、処理条件において低かった。細胞内代謝産物のメタボロームプロファイルは、HCC827およびPC-9細胞においてそれぞれ175および150の微分代謝産物を明らかにした。ジアミド処理後、グルコン酸および酸化グルコースのレベルはHCC827細胞で12倍、PC-9細胞では10倍に増加した。
同様に、グルコース6-リン酸のレベルは、第1のヘキソキナーゼ触媒分解産物におけるリン酸化グルコースであり、HCC827およびPC-9細胞においてもそれぞれ6.3倍および3.5倍に増加した。さらに、ペントースリン酸経路の第1中間体である6-ホスホグルコン酸のレベルは、HCC827細胞で89倍、PC-9細胞で231倍に劇的に増加した。これに対し、フルクトース6-リン酸などの他の解糖中間体のレベルは、ジアミド実験条件において変化しなかった。
総ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸レベルは、ジアミド処理とPBS制御条件との間でほぼ同等であった。5%マンニトール溶液を使用すると、PBS以外の洗浄用の洗浄バッファーとして、CEMS分析のために非常に重要であり、塩系バッファーが分析を妨げ、測定に悪影響を及ぼすため。このプロトコルは脂質のような疎水性代謝産物を抽出するのに適さないので、より包括的なメタボロメ分析のために、親水性代謝産物と疎水性代謝産物の両方を簡便に抽出するためのプロトコルを開発する必要がある。
この技術は、ほとんどすべての付着細胞からの代謝産物の容易な抽出を実現し、癌、幹細胞、薬理学、栄養学、化粧品科学などの様々な研究に適用可能である。
